CC BY
16
ОСНОВНЫЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ БИОЛОГИИ BRASSICA TAURICA (TZVEL.) TZVEL. (BRASSICACEAE)
Т.Н. Кузьмина, C.B. Шевченко
Никитский ботанический сад - Национальный научный центр НААН
Brassica taurica (Tzvel.) Tzvel. (B. sylvestris (L.) Mill. subsp. taurica Tzvel.) -капуста крымская - раритетный вид флоры Крыма (Цвелев, 1970; Никифоров, 2004;), внесенный в ряд списков растений, подлежащих охране (Вопросы развития Крыма, 1999; Каталог видiв флори..., 1999; Червона книга Украши, 2009). Вид имеет ограниченный ареал, приуроченный к восточным склонам горы Аю-Даг (Крым). В последние годы незначительная по численности ценопопуляция B. taurica отмечена в районе мыса Мартьян. Возобновление вида в естественной среде обитания возможно главным образом благодаря семенному размножению. В связи с этим, учитывая генетическую ценность вида и необходимость его сохранения, нами проведено изучение репродуктивной биологии B. taurica с целью выявления адаптивных возможностей репродуктивной системы вида.
Объекты и методы исследований
Наблюдения за ходом динамики цветения, образования генеративных побегов у B. taurica проводили в 2005-2008 гг. в районе мыса Мартьян, а также на цено-популяциях данного вида в бухте Панаир и на мысе Монастырский (гора Аюдаг). Фенофазы развития генеративной сферы учитывали в соответствии с Методологическими указаниями по фенологическим наблюдениям (Методические указания., 1977). Возрастную структуру ценопопуляций B. taurica и плотность популяций C. graeca определяли по методикам, предложенным А.А. Урановым (1977). Изучение морфологии цветков и их элементов осуществляли с помощью бинокулярной лупы МБС-9 на растениях, взятых в естественной среде обитания. При описании морфологических особенностей строения цветка, соцветия использовали терминологию по Ал.А. Федорову, З.Т. Артюшенко (1975), с привлечением «Методических рекомендаций к изучению антэкологических особенностей цветковых растений» (1986).
В ходе приготовления цитоэмбриологических препаратов бутоны, завязи и плоды фиксировали смесью Чемберлена (90:5:5) и Карнуа (6:3:1) (Паушева, 1970). Парафиновые срезы толщиной 8-10 ц, наклеенные на предметные стекла, окрашивали гематоксилином и алциановым синим по модифицированной методике (Жинкина, Воронова, 2000), а также метилгрюпиронином с подкраской алциановым синим (Шевченко, Чеботарь, 1992). Для анализа средних образцов пыльцы материал окрашивали ацетокармином или метиловым зеленым и пиронином, согласно методике, предложенной С.В. Шевченко с соавторами (1986). Жизнеспособность пыльцы определяли методом Д. А. Транковского во влажной камере (Паушева, 1970) при температуре +190С. Процент жизнеспособной пыльцы устанавливали по количеству проросших пыльцевых зерен, у которых пыльцевые трубки в длину были не менее диаметра пыльцевого зерна. При морфометрическом анализе пыльцевых зерен использовали окуляр-микрометр и объект-микрометр с ценой деления 10 ц (0,01мм). Анализ препа-
ратов проводили на микроскопе «Jenaval» фирмы Carl Zeiss. Фотографии сделаны цифровой фотокамерой Olympus SP-350.
Выборку семян для оценки их всхожести проводили согласно технике отбора среднего образца (Минин, 1949). Семена B. taurica хранили в бумажных пакетах в лабораторных условиях при комнатной температуре, ежегодно проверяя их всхожесть, проращивая в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой по 50 шт. в 3-кратной повторности. Всхожесть подсчитывали на 30 день проращивания как процентное отношение числа проростков к числу заложенных семян в каждой повторности. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 6.0. Номенклатура вида приведена в соответствии с «Vascular plant of Ukraine: a nomenclature checklist» (Mosyakin, Fedoronchuk, 1999).
Результаты и обсуждение
B. taurica является многолетним растением, вегетация которого продолжается в течение всех сезонов года. Наиболее активный вегетативный прирост отмечается в осеннее-зимний период. Цветение наступает после периода яровизации. Так, закладка соцветий и формирование бутонов у B. taurica происходит во второй декаде февраля. Начало цветения совпадает с первыми числами апреля, в этот же период завязываются первые плоды. Массовое цветение B. taurica отмечается в апреле. Созревание плодов занимает период с апреля по июль, диссеминация по типу барохория продолжается с июля по октябрь-ноябрь (табл. 1).
Таблица 1. Фенофазы генеративного развития Brassica taurica
Фенофаза Календарные сроки
начало бутонизации II декада февраля - II декада марта
начало цветения III декада марта
массовое цветение II декада апреля - I декада мая
конец цветения III декада мая
завязывание плодов III декада марта
начало созревания плодов I-II декада мая
конец созревания плодов III декада мая
начало диссеминации июль
конец диссеминации октябрь
Репродуктивная система В. taurica образована за счет мультипликации соцветий и называется «сложной» или «двойной» кистью (Методические рекомендации, 1986). Цветки в соцветии распускаются акропетально (рис 1).
Полностью сформированный бутон В. taurica продолговатый, высотой 0,60,7 см, лепестки в бутоне скручены влево. Цветок В. taurica полный, гермафродит -ный, симметричный, актиноморфный, в диаметре около 2 см (рис. 2). Все части цветка свободные, их расположение пентациклическое, гетеромерное. Цветок имеет цветоножку длиной около 1 см. В соцветии цветоножки равны между собой, неопушен-ные, цельные, прямые, отклоненные или горизонтальные. Околоцветник гетерохла-мидный, образован чашечкой и венчиком. Чашечка состоит из четырех прямых чашелистиков длиной около 1 см, прижатых к венчику. На стадии бутона они зеленые, в раскрытом цветке - желтые, расположены раздельно и по окончании цветения опадают. Венчик цветка свободный, четырехчленный. Несросшиеся лепестки желтого цвета образуют узкую гладкую трубку, по длине равную отогнутой пластинке лепестка. Лепестки обратнояйцевидные по форме, с гладкой поверхностью и цельным краем. Венчик В. taurica опадающий. Четырехсильный андроцей представлен шестью тычинками, расположенными в два круга: во внешнем круге - две латеральные, во внутреннем - четыре медиальные тычинки, которые попарно сближены. Пыльники верхушечные, прямостоячие, 4-гнездные, гнезда соединены связником, продолжающим тычиночную нить. По размерам и форме все пыльники однообразные - продолговатые, расширенные к основанию. Пыльники желтого цвета, высотой около 3 мм, покрыты простыми волосками, направленными вверх. В раскрытом цветке тычинка достигает 1 см за счет увеличения длины тычиночной нити. Тычиночная нить прямая, гладкая. Четырехгнездные пыльники вскрываются продольными щелями на вентральной стороне (интрорзно) в базипетальном направлении.
Рис.1. Внешний вид Brassica taurica на стадии цветения (1) и плодоношения (2)
Рис. 2. Строение цветка Brassica taurica
1 - внешний вид; 2 - поперечный срез (увеличение х30); 1 - завязь, 2 - лепесток, 3 - латеральные тычинки, 4 - медиальные тычинки, 5 -чашелистик
2
Сформированная стенка микроспорангия состоит из эпидермиса, эндотеция, двух средних слоев и тапетума. Тапетум секреторного типа - однослойный или нерегулярно двухслойный - образован двуядерными клетками и является производным первичного париетального слоя. Его дезорганизация начинается в период мейотиче-ского деления микроспороцитов. В это же время происходит лизис средних слоев, при этом часть внутреннего среднего слоя со стороны связника не дегенерирует и в период дифференцирующего митоза микроспор в ней, как и в эндотеции, образуются фиброзные утолщения. На эпидерме формируются простые волоски и откладывается кутикула. Таким образом, внешняя стенка зрелого пыльника представлена двумя слоями: покрытым кутикулой эпидермисом с простыми волосками и эндотецием с фиброзными утолщениями. Средний слой, прилегающий к эндотецию, также имеет фиброзные утолщения (рис. 3).
Микроспороциты - крупные многогранные клетки с хорошо выраженным ядром - образуют 5-6 рядов. Микроспорогенез у В. ?аыпса протекает по симультанному типу с образованием тетрад, в которых микроспоры расположены тетраэдриче-ски или изобилатерально (рис. 3). Отмечена асинхронность микроспорогенеза в медиальных и латеральных тычинках. Зрелые пыльцевые зерна трехклеточные, с сетчатой поверхностью спородермы, меридиально трехбороздные, но встречаются и одно-, двух-, и четырехбороздные пыльцевые зерна. Пыльца В. /аыпса желтого цвета, сфероидальной или эллипсоидальной формы. Пыльцевые зерна медиальных и латеральных тычинок сходны по размерам. Их полярный диаметр составляет около 32 д, а экваториальный - приблизительно 26 д. Доли морфологически нормальных пыльцевых зерен в медиальных и латеральных тычинках, в целом, равны (87,83 и 89,46%, соответственно), а доля дефективной пыльцы, размером около 19 д, составила 12,17 и 10,54%, соответственно для медиальных и латеральных тычинок (табл. 2).
Основной причиной образования стерильных пыльцевых зерен являются нарушения в ходе мейоза: неравномерное расхождение хромосом, выброс хромосом за пределы ахроматинового веретена и образование микроядер, как в процессе редукционного (I) деления, так и при эквационном (II) делении (рис. 4).
Рис. 3. Основные этапы развития стенки микроспорангия и пыльцевых зерен у Brassica taurica
1 - фрагмент сформированного микроспорангия; 2 - микроспорангий на стадии сформированных тетрад микроспор; 3 - фрагмент стенки микроспорангия на стадии дифференцирующего деления микроспор; 4 - стенка зрелого пыльника и пыльцевые зерна; 5 - трехклеточные пыльцевые зерна; 6 - пыльцевые зерна, покрытые трифиной (к - кутикула; мкм - микроспороциты; пз - пыльцевые зерна; сс - средний слой; т - тапетум; тм - тетрада микроспор; ф эн - фиброзный эндотеций; э - эпидермис; эн - эндотеций)
Рис. 4. Аномалии мейоза в микроспороцитах у Brassica taurica
1 - неравномерное расхождение хромосом; 2 - выброс хромосом за пределы веретена деления; 3 - образование микроядер (м я)
Таблица 2. Морфометрические параметры пыльцевых зерен медиальных и латеральных тычинок у Brassica taurica
Тип Морфометриче- Размах варьирования, Среднее арифметическое, Среднее квадратичное отклонение, а Коэф. вариа-
тычинок ские параметры min - max, ц M±m, ц ции V,%
Морфологически нормальные пыльцевые зерна
е § ь дие полярный диаметр 30-42 32,13±0,30 2,35 0,07
экваториальный диаметр 22-38 26,97±0,27 2,78 0,10
Дефективные пыльцевые зерна
полярный диаметр 16-22 18,84±0,29 1,61 0,09
Морфологически нормальные пыльцевые зерна
е § полярный диаметр 24-42 31,70±0,34 2,77 0,88
ь ерал экваториальный диаметр 20-36 25,70±0,35 2,89 0,11
ате Дефективные пыльцевые зерна
полярный диаметр 16-22 18,97±0,31 1,70 0,09
Пыльца у В. taurica покрыта особым веществом - трифиной, которая, как известно, представляет собой гетерогенную смесь веществ с большим содержанием липидов и гликолипидов и цитоплазматических остатков, является типичным покрытием пыльцевых зерен представителей сем. ВгаББюасеае и обусловливает проявление спорофитной самонесовместимости (Вишнякова, 1997).
В лабораторных условиях пыльца В. taurica сохраняет способность к образованию пыльцевых трубок в течение 5-7 суток, при этом в ходе цветения отмечена тенденция снижения ее жизнеспособности.
Гинецей у В. taurica ложнодвугнездный, паракарпный, образован двумя плодолистиками с париетальной плацентацией семязачатков, которых, в среднем, в завязи насчитывается 25. В каждом плодолистике семязачатки располагаются двумя рядами. Завязь у В. taurica верхняя, продолговатая с гладкой поверхностью и с четко выраженными продольными боковыми швами. Стилодий терминальный, прямостоячий, не превышает длины завязи. Рыльце верхушечное, округлое, маленькое, желтого цвета, с небольшими сосочками (рис. 2).
Семязачаток В. taurica битегмальный. Внутренний интегумент эпидермаль-ного происхождения. Наружный - дермально-субэпидермального. Семязачаток ме-дионуцеллятный, на ранних стадиях ана-кампилотропный, в зрелом состоянии - ана-амфитропный. Археспориальная клетка преобразуется в мегаспороцит, иногда закладывается две археспориальные клетки, каждая из которых формируется в мегаспоро-цит. Мегаспорогенез происходит с образованием линейной тетрады мегаспор. Как правило, халазальная мегаспора дает начало зародышевому мешку, который развива-
ется по Ро^опиш-типу (рис. 5). Отмечены случаи развития зародышевого мешка из эпихалазальной мегаспоры.
Рис. 5. Развитие семязачатка и зародышевого мешка у Brassica taurica 1 - семязачаток на стадии мегаспороцита (м), начало образование интегументов; 2 - развитие халазальной мегаспоры (х мг), апоптозис мегаспор; 3 - четырехядерный зародышевый мешок (зм); 4 - фрагмент зародышевого мешка с яйцеклеткой (я), синергидами (с) и полярными ядрами (пя); 5- ана-амфитропный семязачаток со зрелым зародышевым мешком
Следует отметить, что, несмотря на асинхронность развития мужской и женской генеративных сфер цветка B. taurica на начальных этапах, к моменту открытия околоцветника мужской и женский гаметофиты полностью сформированы и потенциально готовы к оплодотворению.
Наблюдение за суточным ритмом цветения показало, что раскрываться околоцветник начинает в вечерние часы. В целом, генеративные элементы цветка B. taurica сохраняют жизнеспособность в течение 5-7 суток. Особенности пространственного расположения тычинок и завязи и зрелость гаметофитов к началу цветения позволяют предположить в числе возможных типов опыления автогению. Однако опыты по определению системы скрещивания показали, что образование плодов у B. taurica возможно только при свободном опылении. Количество завязей, в которых формируются семена, в данном случае достигает около 80%. При изоляции сформированных бутонов на стадии, предшествующей началу открытия околоцветника, а также изоляции завязей рыхлых бутонов, цветки и бутоны дегенерируют и опадают в
пя
я
с
течение недели, что свидетельствует о проявлении самонесовместимости и аллоге-нии как основном типе скрещивания у В. /аипса, которая реализуется благодаря энтомофилии.
Оплодотворение у В. (аиггса происходит по премитотическому типу. Формирование нуклеарного эндосперма предшествует делению зиготы, однако в зрелом семени эндосперм отсутствует. Развитие зародыша протекает по Onagrad-типу. Зрелое семя В. /аипса содержит дифференцированный зародыш спинокорешкового типа, покрытый семенной кожурой эндотестально-эндотегмального типа.
Семена В. (аиггса не имеют периода покоя и способны прорастать сразу после диссеминации. Образование проростка начитается с проклевывания корешка, которое происходит через сутки с момента помещения семян на увлажненную фильтровальную бумагу. Семядоли прорастают на 3-4 сутки.
В лабораторных условиях всхожесть семян В. /аипса непосредственно в год их генерации составляет 83,56±6,46%, и незначительно отличается от данных, полученных при проращивании семян в земельной смеси (96,00±4,00%). При хранении семян отмечается колебание всхожести с общей тенденцией значительного снижения. Так, всхожесть семян на 4 год хранения составила 4,67±1,33%. При прорастании семян В. /аипса часть проростков имеет морфологические аномалии, соответствующие категориям аномальных проростков для видов и культурных форм семейства ВгаББюасеае (Веллингтон, 1973). При анализе соотношения количества морфологически нормальных и аномальных проростков отмечается увеличение доли проростков с различного рода морфологическими нарушениями (недоразвитие первичного корня, деформированные гипокотиль и семядоли, а также их некроз) при увеличении срока хранения. Так, если доля аномальных проростков после одного года сухого хранения семян года равна 3,97%, то на четвертый год хранения аномальные проростки составили 96,87% от общего числа всходов данного варианта (рис. 6), что свидетельствует о снижении морфогенетических корреляций в организации зародыша и дисбалансе регулирующих систем и позволяет рассматривать четырехлетний период как предельный срок сухого хранения семян В. ?аипса в лабораторных условиях.
о а о а с
г я
ч о
и
120 100 80 60 40 20 0
96,03
3,97
69
31
15,04 т
96,87
3,31
2 3
Период хранения, годы
4
Щ нормальные проростки Ш аномальные проростки
Рис. 6. Соотношение нормальных и аномальных проростков, образовавшихся из семян Brassica taurica различного срока сухого хранения
Следует отметить, что всхожесть семян сохраняется в течение 5-6 лет и у других представителей трибы Brassiceae, в частности Raphanus sativa L. и Brassica oleracea L. var. gemmifera (DC.) Zenker. и Raphanus raphanisrum L. (Roberts, 1983).
Оценка успешности опыления и оплодотворения показала, что в завязи у B. taurica оплодотворенные семязачатки составляют около 70% от их общего числа (табл. 3), что свидетельствует о высокой жизнеспособности женской генеративной сферы данного вида и эффективном половом процессе. Однако, около 20% семян не вызревает, что снижает семенную продуктивность до 50%. В то же время в пересчете на соцветие средние показатели плодообразования B. taurica составляют 64%. Фактором, ограничивающим реальную семенную продуктивность генеративных побегов B. taurica, является повреждение плодов и семян фитофагами, а также невызревание части плодов, что, вероятно, обусловлено особенностями распределения пластических ресурсов особи.
Наблюдения за состоянием и возрастным составом ценопопуляции B. taurica в районе мыса Мартьян показало, что пять растений данного вида, из которых две особи генеративные, отмеченные в мае 2005 года, к концу года погибли. Однако, осенью 2005 года численность особей данной ценопопуляция была возобновлена 47 проростками. После зимнего периода 2005-2006 гг. количество проростков B. taurica снизилось и составило 44,6% от их первоначального числа. В последующие годы наблюдений единичные особи переходили в генеративное состояние, а после диссеминации отмирали. Следует отметить, что массовое посещение людьми прибрежной зоны, к которой приурочено произрастание B. taurica, губительно сказывается на численности особей данного вида.
Таблица 3. Завязываемость семян в плодах Brassica taurica
Год исследования Генеративные структуры Среднее арифметическое, M±m, шт. Среднее квадратичное отклонение, а V,%
2005* завязавшиеся семена 12,81±0,89 1,54 12,02
выполненные семена 7,72±1,27 2,20 28,49
семязачатки 21,86±2,07 2,93 13,40
2006 завязавшиеся семена 14,55±2,12 2,99 20,55
выполненные семена 11,01±2,66 3,76 34,15
семязачатки 24,35±1,45 2,05 8,42
2007 завязавшиеся семена 18,31±1,41 1,99 10,87
выполненные семена 12,96±0,13 0,18 1,39
* - в 2005 г. учет количества семязачатков в завязях не производился.
Выводы
Основные цитоэмбриологические признаки В. taurica находятся в пределах типичных характеристик, свойственных представителям семейства ВгаББюасеае: пя-тислойная стенка микроспорангия; секреторный тапетум, представленный двуядер-ными клетками; симультанный тип микроспорогенеза; трехклеточные пыльцевые зерна; медионуцеллятный, битегмальный, ана-амфитропный семязачаток; развитие
зародышевого мешка по Polygonum-типу; нуцелярный эндосперм; Orngrad-ran эмбриогенеза; дифференцированный зародыш.
Репродуктивная система B. taurica характеризуется комплексом адаптивных признаков, обусловливающих надежность аллогенного типа опыления, что выражается в мультипликации соцветий, дублировании количества семязачатков в завязи и числа закладывающихся микроспороцитов и формирующихся пыльцевых зерен, а также продолжительности жизнеспособности генеративных структур.
Характер строения и периоды жизнеспособности генеративных структур B. taurica потенциально способны обеспечить эффективную половую репродукцию вида, а высокая жизнеспособность семян создает предпосылки для его успешного семенного возобновления в пределах исследуемых ценопопуляций.
Литература
Веллингтон П. Методика оценки проростков семян - М.: Колос, 1973. - 175 с. Вишнякова М.А. Эволюционная преемственность структурных механизмов гаметофитного и спорофитного типов реакции самонесовместимости // Ботан. журн. - 1997. - Т. 82, № 8.
- С.1-17.
Вопросы развития Крыма Материалы к Красной книги Крыма: Научно-практический дискуссионно-аналитический сборник / Сост. В.В. Корженевский, А.В. Ена, С.Ю. Костин. -Симферополь: Таврия-плюс, 1999. - Вып. 13.- 164 с. Жинкина Н.А., Воронова О.Н. О методике окраски эмбриологических препаратов // Ботан.
журн. - 2000. - 85, № 6. - С. 168-171. Каталог видiв флори i фауни Украши, занесених до Бернсько! Конвенци про охорону дико! флори i фауни та природних середовищ юнування в Сврот. - Вип. перший. Флора. -Ки!в: Фггосоцюцентр, 1999. - 52 с. Методические рекомендации по изучению антэкологических особенностей цветковых растений. Морфологическое описание репродуктивной структуры / Сост.: В.Н.Голубев, Ю.С. Волокитин. - Ялта: ГНБС, 1986. - 43 с. Методологические указания по фенологическим наблюдениям над деревьями и кустраниками при их интродукции на юге СССР / Сост.: И.В. Голубева, Р.В. Галушко, А.М. Корми-лицин. - Ялта, 1977. - 25 с. Минин Д. Д. Сбор и хранение семян древесных и кустарниковых пород. - М.-Л.: Гослесбумиз-дат. - 1949. - 85 с.
Никифоров А.Р. Интродукция растений редких видов флоры Крыма и ее использование для оптимизации экосистем региона // Экология, фитоценология и оптимизация экосистем: Труды Никит. ботан. сада. - Ялта, 2004. - Т. 123. - С. 212-219. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений - М.: Колос, 1970. - 255 с. Уранов А.А. Вопросы изучения структуры фитоценозов и видовых ценопопуляций // Ценопо-
пуляции растений. Развитие и взаимоотношение. - М.: Наука, 1977. - С. 8-20. Федоров Ал.А., Артюшенко З.Т. Атлас по описательной морфологии высших растений. Цветок.
- Л.: Наука, 1975. - 352 с.
Шевченко С.В., Ругузов И.А., Ефремова Л.М. Методика окраски постоянных препаратов метиловым зеленым и пиронином // Бюл. Гос. Никит. ботан. сада. - 1986. - Вып. 60. - С. 99101.
Шевченко С.В., Чеботарь А.А. Особенности эмбриологии маслины европейской (Olea europaea) // Цитолого-эмбриологические исследования высших растений: Труды Никит. ботан. сада. - Ялта, 1992. - Т. 113. - C. 52-73. Цвелев Н.Н. О некоторых более редких растениях Европейской части СССР // Новости систематики высших растений: Сб. трудов. - М.-Л.: Наука, 1970. - Т. 6. - С. 294 - 301. Червона книга Украши. Рослинний свгт / Ред. Я.П. Дщух. - К.: Глобалконсалтинг, 2009. - 900 с.
Mosyakin S.L., Fedoronchuk M.M. Vascular plant of Ukraine: A nomenclature checklist - Kiev, 1999. - 346 p.
Roberts H.A. Seed survival species and periodicity of seedling emergence in eight // Ann. Appl. Boil. - 1983. - Vol. 103, № 2. - P. 301-304.
