CC BY
57
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.438-007.61-053.2-078.33
П. Д. Ваганов1 *, А. Д. Донецкова2, М. Ф. Никонова2, И. М. Данько1, А. А. Ярилин2
ОСЛАБЛЕНИЕ ЭМИГРАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ИЗ ТИМУСА ПРИ ТИМОМЕГАЛИИ
У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА
1РНИМУ им. Н. И. Пирогова; 2ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, Москва
*Ваганов Павел Дмитриевич, д-р мед. наук, проф. каф. детских болезней лечебного фак.; 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1
♦ У детей в возрасте до 5 лет с тимомегалией значительно (более чем 6-кратно) снижено содержание так называемых Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК) в мононуклеарах периферической крови. ТРЭК формируются в процессе перестройки генов Т-клеточного рецептора в тимоцитах. В периферическом отделе иммунной системы (включая кровь) ТРЭК присутствуют только в Т-клетках, недавно эмигрировавших из тимуса, и их содержание в мононуклеа-рах отражает интенсивность созревания Т-лимфоцитов и их эмиграции из тимуса. Таким образом, содержание ТРЭК в мононуклеарах крови может рассматриваться как показатель функциональной активности тимуса. С возрастом содержание ТРЭК в периферических Т-клетках неуклонно снижается. Полученные данные свидетельствуют о том, что функциональная активность тимуса у детей до 5 лет с тимомегалией снижена по сравнению с возрастной нормой.
Ключевые слова: дети, тимомегалия, Т-лимфоциты, функциональная активность тимуса
P.D. Vaganov, A.D. Donetskova, N.F. Nikonova, I.M. Danko, A.A. Yarylin
THE DECREASE OF EMIGRATION OF T-LYMPHOCYTES FROM THYMUS UNDER THYMOMEGALIA
IN CHILDREN OF EARLY AGE
The N.I. Pirogov Russian research medical university, Moscow The institute of immunology, the federal medical biologic agency of Russia, Moscow
♦ The article demonstrates that in children aged less than 5 years the content of so called T-receptor excisional rings in mononuclears of peripheral blood is significantly (more than six-fold times) decreased. The T-receptor excisional rings are formed in the process of changes of genes of T-cell receptor in thymocytes. In the peripheral part of immune system (blood included) T-receptor excisional rings are present only in T-cells, recently migrated from thymus. The content of T-receptor excisional rings in mononuclears reflects the intensity of T-lymphocytes maturation and their emigration from thymus. Therefore, the content of T-receptor excisional rings in mononuclears of blood can be considered as an indicator of thymus functional activity. With age, the content of T-receptor excisional rings in peripheral T-cells steadily decreases. The research data signify that in children aged less than 5 years with thymomegalia the thymus functional activity is decreased as compared with age norm.
Key words: children, thymomegalia, T-lymphocytes, thymus functional activity
Термином «тимомегалия» принято обозначать увеличение объема и массы тимуса выше предельных возрастных значений с сохранением нормальной гистоархитектоники органа [5, 7]. Тимомегалия чаще всего определяется у детей раннего возраста. При тимомегалии наблюдаются признаки гипофункции Т-клеточного звена иммунной системы — снижение численности Т-лимфоцитов, изменение их субпопуля-ционного состава, ослабление функциональной активности [1, 4, 6, 8, 9]. Характерным для этого состояния является снижение сывороточного уровня гормонов тимуса [4], свидетельствующее об ослаблении эндокринной функции тимуса.
Увеличение численности лимфоидных клеток тимуса (тимоцитов), характерное для тимомегалии, может быть результатом снижения интенсивности апоптоза, реализуемого в ходе селекции тимоцитов, или ослабления эмиграции зрелых Т-лимфоцитов из органа в периферический отдел иммунной системы. Прижизненная оценка интенсивности апоптоза внутри тимуса представляется затруднительной. В то же время существует метод определения уровня эмиграции Т-клеток по содержанию в Т-клетках крови Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК). ТРЭК представляют собой кольцевидные структуры, образованные ДНК, которые локализуются в составе эписом в цитоплазме клеток. Они образуются в ходе перестройки генов Т-клеточного рецептора, реализуемой при дифференцировке Т-лимфоцитов в тимусе [10]. В периферической крови ТРЭК определяются
только в так называемых недавних мигрантах из тимуса (RTE — Recent thymic еш1§га^) — Т-клетках, которые не пролиферировали после выхода из тимуса на периферию [12]. Поскольку при делении клеток эписомальная ДНК не подвергается репликации, пролиферативный процесс приводит к снижению числа ТРЭК-содержащих Т-клеток. В связи с вышесказанным уровень таких клеток в кровотоке рассматривается как показатель интенсивности процессов Т-лимфопоэза и эмиграции Т-клеток из тимуса [3, 12, 13].
Цель данной работы состояла в оценке функции тимуса путем определения уровня ТРЭК в популяции Т-лимфоцитов периферической крови у детей с тимомегалией.
Содержание ТРЭК определяли у 8 детей с тимомегалией. Возраст семи детей составлял от 6 мес до 2 лет и лишь одному ребенку было 5 лет. У всех детей был диагностирован острый бронхит — простой или обструктивный. Число ТРЭК определяли также у 19 детей без тимомегалии, из которых 10 детей в возрасте от 1 года до 5 лет c бронхитами или ОРВИ составили группу сравнения для группы детей с тимомегалией и 9 детей в возрасте от 6 до 16 лет обследовались для оценки возрастной динамики числа ТРЭК. Характеристика численности Т-клеток, их субпопуляционного состава и функциональной активности осуществлена на основе обследования 70 детей с тимомегалией и 26 детей из группы сравнения без тимомегалии.
Размер тимуса определяли рентгенологически. Мерой выраженности тимомегалии был кардио-тими-
ко-торакальный индекс (КТТИ), который рассчитывали как отношение ширины тимуса к ширине грудной клетки на уровне куполов диафрагмы.
Из периферической крови обследованных детей выделяли мононуклеарную фракцию путем центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколла-гипака (Sigma, США) плотностью 1,077 г/мл по методу А. Boyum. Численность и субпопуляционный состав Т-лимфоцитов оценивали методом проточной цитометрии на цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Для определения Т-клеток использовали моноклональные антитела к CD3, Т-хелперы выявляли по окрашиванию комбинацией моноклональных антител к CD3 и CD4, цитотоксические Т-клетки — с использованием антител к CD3 и CD8, регуляторные Т-клетки — антител к CD4 и CD25 (учитывали клетки с высоким уровнем экспрессии CD25). В работе использовали моноклональные антитела фирм Becton Dickinson, США (анти-CD25, меченные фикоэритрином) и "Сорбент", Москва (анти-CD3, анти-CD4, и анти-CD8, меченные флюоресцеинизотиоцианатом или фи-коэритрином). Для оценки пролиферации лимфоцитов в культуру мононуклеаров крови (0,5 х 106/мл среды) вносили фитогемагглютинин в конечной концентрации 10 мкг/мл и культивировали в течение 72 ч. За 18 ч до завершения культивирования в лунки вносили 40 кБк 3Н-тимидина и оценивали включение тимидина на счетчике ß-сцинтилляций. Методы детально описаны в публикации [8].
Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК» («ДНК-Технология»). Метод основан на лизисе образцов в 4M растворе гуани-динтиоцианата, осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом с последующими отмывками этанолом и ацетоном, подсушиванием и растворением в специальном буфере. Выделение ДНК проводили из 1 • 106 клеток. Объем полученной ДНК составил 25 мкл. Концентрацию ДНК определяли спек-трофотометрически, соотношение A260/280 составляло 1,6—2,0.
Для постановки ПЦР использовали набор реагентов TaqMan Universal PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems). Для определения ТРЭК использованы следующие праймеры: прямой 5'-CGT GAG AAC GGT GAA TGA AGA GCA GAC A-3', обратный 5'-CAT CCC TTT CAA CCA TGC TGA CAC CTC T-3', а также флюоресцентно-меченный олигонуклеотид (зонд) 5'-FAM-TTT TTG TAA AGG TGC CCA CTC CTG TGC ACG GTG A-MGB-3' [11]. Количество копий ТРЭК рассчитывали с использованием стандартной кривой, полученной по разведениям плазмиды с известной концентрацией ДНК ТРЭК. Результаты выражали числом копий ТРЭК на 1 мкг ДНК. Для определения количества геномной ДНК использован ß-актин (Applied Biosystems).
Амплификацию проводили на приборе 7300 Applied Biosystems Real-time PCR System. Реакцию ставили в объеме 25 мкл (в реакцию брали 100 нг ДНК)
Таблица 1
Численность Т-клеток и их субпопуляций в составе мононуклеаров крови и ответ Т-клеток на действие митогена у детей с тимомегалией в сопоставлении с контрольной группой соответствующего возраста
Показатель
Группа сравнения
Тимомегалия
CD3+ клетки
%
109/л
CD3+CD4+ клетки
%
109/л
CD3+CD8+ клетки %
109/л
CD4+CD25hi клетки
%
109/л
Включение 3Н-тимидина, имп/мин
спонтанное
ФГА-индуцированное
79.8 ± 9,0 4,59 ± 0,93
56.9 ± 10,7 3,23 ± 0,72
21,4 ± 7,3 1,25 ± 0,55
4,19 ± 0,8 0,22 ± 0,05
4390 ± 2320 138 140 ± 58 600
71,0 ± 12,1* 3,19 ± 1,25*
51,2 ± 12,1* 2,35 ± 1,04*
19,2 ± 6,1 0,96 ± 1,03*
3,95 ± 1,49 0,18 ± 0,09*
3900 ± 2200 115 040 ± 39 060*
Примечание. * — р < 0,05.
по следующей программе: 1 цикл — 50°С 2 мин, 95°С 10 мин; 50 циклов — 94°С 30 с, 60°С 30 с. Измерение уровня флюоресценции проводили на каждом цикле при температуре 60°С.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием параметрических (с использованием ¿-критерия Стьюдента) и непараметрических (с использованием ¿/-критерия Манна—Уитни) методов.
Ранее нами подробно охарактеризовано состояние популяции Т-лимфоцитов у детей с тимомегалией разной степени выраженности [2, 8]. Здесь мы ограничимся суммарными (без учета степени тимомегалии) данными о численности, субпопуляционном составе и функциональной активности Т-клеток у детей с тимо-мегалией в сопоставлении с показателями возрастной нормы. Данные табл. 1 свидетельствуют о значимом снижении относительного и абсолютного содержания Т-клеток (СБ3+-лимфоцитов), в частности, Т-хелперов (СБ4+С03+), а также абсолютного содержания цито-токсических (СБ3+СБ8+) и регуляторных Т-клеток (СБ4+СБ25Ы).
Значимо снижен уровень пролиферативного ответа мононуклеаров на Т-клеточный митоген фитогемаг-глютинин, что свидетельствует об ослаблении функциональной активности Т-лимфоцитов.
Оценка содержания ТРЭК в мононуклеарах крови детей с тимомегалией в возрасте от 6 мес до 5 лет и детей без тимомегалии той же возрастной группы показала, что при тимомегалии число копий ТРЭК в пересчете на 1 мкг ДНК снижено в 6,18 раз (табл. 2).
Наблюдаемые различия высоко достоверны. Даже если сделать поправку на более низкое содержание
Таблица 2
Численность ТРЭК в мононуклеарах крови детей возрастом до 4 лет с тимомегалией и без тимомегалии
Группа Средняя Медиана Минимум Максимум Нижний квартиль Верхний квартиль
Группа сравнения(n =10) 61 066 57 866 38 979 94 126 53 282 66 563
Тимомегалия (n = 8) 9 884 9 491 772 17 265 6 115 13 712
Примечание. p = 0,00078.
28
Российский медицинский журнал
Возраст, годы
Зависимость содержания ТРЭК в мононуклеарах периферической крови от возраста детей. Слева отмечены величины, характеризующие численность ТРЭК у обследованных детей по данным этой работы: * — с тимомегалией; о — без тимомегалии.
Т-клеток у детей с тимомегалией (3,19 млрд Т-клеток в 1 л крови против 4,49 млрд Т-клеток в группе сравнения, т. е. в 1,44 раза меньше), умножив число копий у детей с тимомегалией на 1,44, полученная величина все равно будет многократно ниже, чем в группе сравнения — 4 461 против 13 304 копий на 1 мкг ДНК.
Известно, что интенсивность эмиграции тимоци-тов на периферию неуклонно снижается с возрастом [3, 10]. Нами рассчитана динамика числа ТРЭК в клетках крови здоровых детей в возрасте до 16 лет. При сопоставлении числа копий ТРЭК у детей от 6 мес до 5 лет с тимомегалией с показателями возрастной нормы (см. рисунок) оказывается, что оно со-
ответствует нормальным показателям, свойственным примерно 15-летним детям, у которых функциональная активность тимуса снижена по сравнению с детьми более раннего возраста.
Таким образом, нами впервые получены прямые свидетельства ослабления эмиграции Т-клеток из тимуса в периферический отдел иммунной системы у детей первых лет жизни с тимомегалией.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ваганов П. Д., МартыноваМ. И., Арион В. Я. // Рос. вестн. пери-натол. и педиат. — 2001. — Т. 46, № 3. — С. 59—60.
2. Донецкова А. Д., Никонова М. Ф., Данько И. М. и др. // Рос. им-мунол. журн. — 2008. — № 4. — С. 427—432.
3. Донецкова А. Д., Фроленко А. Л., Трошина В. В. и др. // Иммунология. — 2010. — Т. 31, № 6. — С. 329—334.
4. Зайратьянц О. В., Серов В. В., Кузьменко Л. Г. // Арх. пат. —
1990. — Т. 52, № 6. — С. 33—39.
5. Зайратьянц О. В. // Арх. пат. — 1991. — Т. 53, № 10. — С. 3—12.
6. Зайратьянц О. В. Синдром увеличенной вилочковой железы у детей. — М., 1993.
7. Ивановская Т. Е., КатасоноваЛ. П. // Арх. пат. — 1986. — Т. 48, № 1. — С. 3—9.
8. Никонова М. Ф., Данько И. М., Ваганов П. Д., Ярилин А. А. // Иммунология. — 2008. — Т. 29, № 4. — С. 201—206.
9. Тюрин Н. А., Арион В. Я., Пушко Л. В. и др. // Педиатрия. —
1991. — № 6. — С. 39—42.
10. Douek D. C., Me Farland R. D., Keiser P. H. et al. // Nature. — 1998. — Vol. 396. — P. 690—695.
11. Hochberg E. P., Chillemi A. C., Wu C. J. et al. // Blood. — 2001. — Vol. 98. — P. 1116—1121.
12. Kong F.-K., Chen C. L., Cooper M. // Immunity. — 1998. — Vol. 8. — P. 97—104.
13. Ribeiro R. M., Perelson A. S. // Immunol. Rev. — 2007. — Vol. 216. — P. 21—34.
Поступила 22.04.12
Обмен опытом
© В. А. ВЕРХНЕВ, 2012 УДК 616.24-002-022.6-08:614.2
В. А. Верхнее*
ОПЫТ ОРГАНИЗАЦИИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ВИРУСНЫМИ ПНЕВМОНИЯМИ
ГБУ РМЭ Йошкар-Олинская городская больница, отделение анестезиологии-реаниматологии Казанского государственного медицинского университета
*Верхнев Валентин Александрович, канд. мед. наук, зав. отд-нием анестезиологии и реаниматологии, ассистент каф. общей врачебной практики № 2. 424035, Республика Марий Эл, Йошкар-Ола, ул. Карла Либкнехта, д. 55. Е-таД^огЪо1@тап-е1.га
♦ Цель исследования — разработка тактики интенсивной терапии больных вирусными пневмониями, находившихся в отделении реанимации в 2009—2011 гг. Среди 75 госпитализированных пациентов преобладали лица в возрасте 22—45 лет — 41 (55%), из них 4 беременные женщины (сроки беременности 16, 29, 38 и 39 нед). Сроки пребывания в реанимации составили 6,2 койко-дня. Срочный перевод на искусственную вентиляцию легких потребовался 33 (44%) больным. Основу противовирусной терапии составил осельтамивир. Эмпирическая антибактериальная терапия проводилась меропенемом, цефепимом, левофлоксацином. Умерли 18 (24%) больных, из них у 11 (61%) был выделен вирус гриппа А(НШ1)2009. Летальных исходов среди беременных не было.
Ключевые слова: грипп А(НШ1)2009, пневмония, реанимация, интенсивная терапия
V.A. Verkhnev
THE EXPERIENCE OF ORGANIZATION OF TREATMENT OF PATIENTS WITH VIRAL PNEUMONIA
The Kazan state medical university, Kazan
♦ The article discusses the intensive therapy policy in patients with viral pneumonia in the department of reanimation in 2009-2011. Among 75 hospitalized patients prevailed persons aged 22-45 years (41 patients, 55%), including 4 pregnant women
