Научная статья на тему 'Ослабление эмиграции Т-лимфоцитов из тимуса при тимомегалии у детей раннего возраста'

Ослабление эмиграции Т-лимфоцитов из тимуса при тимомегалии у детей раннего возраста Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
235
51
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ДЕТИ / ТИМОМЕГАЛИЯ / Т-ЛИМФОЦИТЫ / ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ТИМУСА / CHILDREN / THYMOMEGALIA / T-LYMPHOCYTES / THYMUS FUNCTIONAL ACTIVITY

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Ваганов Павел Дмитриевич, Донецкова А. Д., Никонова М. Ф., Данько И. М., Ярилин А. А.

У детей в возрасте до 5 лет с тимомегалией значительно (более чем 6-кратно) снижено содержание так называемых Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК) в мононуклеарах периферической крови. ТРЭК формируются в процессе перестройки генов Т-клеточного рецептора в тимоцитах. В периферическом отделе иммунной системы (включая кровь) ТРЭК присутствуют только в Т-клетках, недавно эмигрировавших из тимуса, и их содержание в мононуклеарах отражает интенсивность созревания Т-лимфоцитов и их эмиграции из тимуса. Таким образом, содержание ТРЭК в мононуклеарах крови может рассматриваться как показатель функциональной активности тимуса. С возрастом содержание ТРЭК в периферических Т-клетках неуклонно снижается. Полученные данные свидетельствуют о том, что функциональная активность тимуса у детей до 5 лет с тимомегалией снижена по сравнению с возрастной нормой.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Ваганов Павел Дмитриевич, Донецкова А. Д., Никонова М. Ф., Данько И. М., Ярилин А. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

THE DECREASE OF EMIGRATION OF T-LYMPHOCYTES FROM THYMUS UNDER THYMOMEGALIA IN CHILDREN OF EARLY AGE

The article demonstrates that in children aged less than 5 years the content of so called T-receptor excisional rings in mononuclears of peripheral blood is significantly (more than six-fold times) decreased. The T-receptor excisional rings are formed in the process of changes of genes of T-cell receptor in thymocytes. In the peripheral part of immune system (blood included) T-receptor excisional rings are present only in T-cells, recently migrated from thymus. The content of T-receptor excisional rings in mononuclears reflects the intensity of T-lymphocytes maturation and their emigration from thymus. Therefore, the content of T-receptor excisional rings in mononuclears of blood can be considered as an indicator of thymus functional activity. With age, the content of T-receptor excisional rings in peripheral T-cells steadily decreases. The research data signify that in children aged less than 5 years with thymomegalia the thymus functional activity is decreased as compared with age norm.

Текст научной работы на тему «Ослабление эмиграции Т-лимфоцитов из тимуса при тимомегалии у детей раннего возраста»

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.438-007.61-053.2-078.33

П. Д. Ваганов1 *, А. Д. Донецкова2, М. Ф. Никонова2, И. М. Данько1, А. А. Ярилин2

ОСЛАБЛЕНИЕ ЭМИГРАЦИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ИЗ ТИМУСА ПРИ ТИМОМЕГАЛИИ

У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА

1РНИМУ им. Н. И. Пирогова; 2ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, Москва

*Ваганов Павел Дмитриевич, д-р мед. наук, проф. каф. детских болезней лечебного фак.; 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1

♦ У детей в возрасте до 5 лет с тимомегалией значительно (более чем 6-кратно) снижено содержание так называемых Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК) в мононуклеарах периферической крови. ТРЭК формируются в процессе перестройки генов Т-клеточного рецептора в тимоцитах. В периферическом отделе иммунной системы (включая кровь) ТРЭК присутствуют только в Т-клетках, недавно эмигрировавших из тимуса, и их содержание в мононуклеа-рах отражает интенсивность созревания Т-лимфоцитов и их эмиграции из тимуса. Таким образом, содержание ТРЭК в мононуклеарах крови может рассматриваться как показатель функциональной активности тимуса. С возрастом содержание ТРЭК в периферических Т-клетках неуклонно снижается. Полученные данные свидетельствуют о том, что функциональная активность тимуса у детей до 5 лет с тимомегалией снижена по сравнению с возрастной нормой.

Ключевые слова: дети, тимомегалия, Т-лимфоциты, функциональная активность тимуса

P.D. Vaganov, A.D. Donetskova, N.F. Nikonova, I.M. Danko, A.A. Yarylin

THE DECREASE OF EMIGRATION OF T-LYMPHOCYTES FROM THYMUS UNDER THYMOMEGALIA

IN CHILDREN OF EARLY AGE

The N.I. Pirogov Russian research medical university, Moscow The institute of immunology, the federal medical biologic agency of Russia, Moscow

♦ The article demonstrates that in children aged less than 5 years the content of so called T-receptor excisional rings in mononuclears of peripheral blood is significantly (more than six-fold times) decreased. The T-receptor excisional rings are formed in the process of changes of genes of T-cell receptor in thymocytes. In the peripheral part of immune system (blood included) T-receptor excisional rings are present only in T-cells, recently migrated from thymus. The content of T-receptor excisional rings in mononuclears reflects the intensity of T-lymphocytes maturation and their emigration from thymus. Therefore, the content of T-receptor excisional rings in mononuclears of blood can be considered as an indicator of thymus functional activity. With age, the content of T-receptor excisional rings in peripheral T-cells steadily decreases. The research data signify that in children aged less than 5 years with thymomegalia the thymus functional activity is decreased as compared with age norm.

Key words: children, thymomegalia, T-lymphocytes, thymus functional activity

Термином «тимомегалия» принято обозначать увеличение объема и массы тимуса выше предельных возрастных значений с сохранением нормальной гистоархитектоники органа [5, 7]. Тимомегалия чаще всего определяется у детей раннего возраста. При тимомегалии наблюдаются признаки гипофункции Т-клеточного звена иммунной системы — снижение численности Т-лимфоцитов, изменение их субпопуля-ционного состава, ослабление функциональной активности [1, 4, 6, 8, 9]. Характерным для этого состояния является снижение сывороточного уровня гормонов тимуса [4], свидетельствующее об ослаблении эндокринной функции тимуса.

Увеличение численности лимфоидных клеток тимуса (тимоцитов), характерное для тимомегалии, может быть результатом снижения интенсивности апоптоза, реализуемого в ходе селекции тимоцитов, или ослабления эмиграции зрелых Т-лимфоцитов из органа в периферический отдел иммунной системы. Прижизненная оценка интенсивности апоптоза внутри тимуса представляется затруднительной. В то же время существует метод определения уровня эмиграции Т-клеток по содержанию в Т-клетках крови Т-рецепторных эксцизионных колец (ТРЭК). ТРЭК представляют собой кольцевидные структуры, образованные ДНК, которые локализуются в составе эписом в цитоплазме клеток. Они образуются в ходе перестройки генов Т-клеточного рецептора, реализуемой при дифференцировке Т-лимфоцитов в тимусе [10]. В периферической крови ТРЭК определяются

только в так называемых недавних мигрантах из тимуса (RTE — Recent thymic еш1§га^) — Т-клетках, которые не пролиферировали после выхода из тимуса на периферию [12]. Поскольку при делении клеток эписомальная ДНК не подвергается репликации, пролиферативный процесс приводит к снижению числа ТРЭК-содержащих Т-клеток. В связи с вышесказанным уровень таких клеток в кровотоке рассматривается как показатель интенсивности процессов Т-лимфопоэза и эмиграции Т-клеток из тимуса [3, 12, 13].

Цель данной работы состояла в оценке функции тимуса путем определения уровня ТРЭК в популяции Т-лимфоцитов периферической крови у детей с тимомегалией.

Содержание ТРЭК определяли у 8 детей с тимомегалией. Возраст семи детей составлял от 6 мес до 2 лет и лишь одному ребенку было 5 лет. У всех детей был диагностирован острый бронхит — простой или обструктивный. Число ТРЭК определяли также у 19 детей без тимомегалии, из которых 10 детей в возрасте от 1 года до 5 лет c бронхитами или ОРВИ составили группу сравнения для группы детей с тимомегалией и 9 детей в возрасте от 6 до 16 лет обследовались для оценки возрастной динамики числа ТРЭК. Характеристика численности Т-клеток, их субпопуляционного состава и функциональной активности осуществлена на основе обследования 70 детей с тимомегалией и 26 детей из группы сравнения без тимомегалии.

Размер тимуса определяли рентгенологически. Мерой выраженности тимомегалии был кардио-тими-

ко-торакальный индекс (КТТИ), который рассчитывали как отношение ширины тимуса к ширине грудной клетки на уровне куполов диафрагмы.

Из периферической крови обследованных детей выделяли мононуклеарную фракцию путем центрифугирования в одноступенчатом градиенте плотности фиколла-гипака (Sigma, США) плотностью 1,077 г/мл по методу А. Boyum. Численность и субпопуляционный состав Т-лимфоцитов оценивали методом проточной цитометрии на цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Для определения Т-клеток использовали моноклональные антитела к CD3, Т-хелперы выявляли по окрашиванию комбинацией моноклональных антител к CD3 и CD4, цитотоксические Т-клетки — с использованием антител к CD3 и CD8, регуляторные Т-клетки — антител к CD4 и CD25 (учитывали клетки с высоким уровнем экспрессии CD25). В работе использовали моноклональные антитела фирм Becton Dickinson, США (анти-CD25, меченные фикоэритрином) и "Сорбент", Москва (анти-CD3, анти-CD4, и анти-CD8, меченные флюоресцеинизотиоцианатом или фи-коэритрином). Для оценки пролиферации лимфоцитов в культуру мононуклеаров крови (0,5 х 106/мл среды) вносили фитогемагглютинин в конечной концентрации 10 мкг/мл и культивировали в течение 72 ч. За 18 ч до завершения культивирования в лунки вносили 40 кБк 3Н-тимидина и оценивали включение тимидина на счетчике ß-сцинтилляций. Методы детально описаны в публикации [8].

Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК» («ДНК-Технология»). Метод основан на лизисе образцов в 4M растворе гуани-динтиоцианата, осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом с последующими отмывками этанолом и ацетоном, подсушиванием и растворением в специальном буфере. Выделение ДНК проводили из 1 • 106 клеток. Объем полученной ДНК составил 25 мкл. Концентрацию ДНК определяли спек-трофотометрически, соотношение A260/280 составляло 1,6—2,0.

Для постановки ПЦР использовали набор реагентов TaqMan Universal PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems). Для определения ТРЭК использованы следующие праймеры: прямой 5'-CGT GAG AAC GGT GAA TGA AGA GCA GAC A-3', обратный 5'-CAT CCC TTT CAA CCA TGC TGA CAC CTC T-3', а также флюоресцентно-меченный олигонуклеотид (зонд) 5'-FAM-TTT TTG TAA AGG TGC CCA CTC CTG TGC ACG GTG A-MGB-3' [11]. Количество копий ТРЭК рассчитывали с использованием стандартной кривой, полученной по разведениям плазмиды с известной концентрацией ДНК ТРЭК. Результаты выражали числом копий ТРЭК на 1 мкг ДНК. Для определения количества геномной ДНК использован ß-актин (Applied Biosystems).

Амплификацию проводили на приборе 7300 Applied Biosystems Real-time PCR System. Реакцию ставили в объеме 25 мкл (в реакцию брали 100 нг ДНК)

Таблица 1

Численность Т-клеток и их субпопуляций в составе мононуклеаров крови и ответ Т-клеток на действие митогена у детей с тимомегалией в сопоставлении с контрольной группой соответствующего возраста

Показатель

Группа сравнения

Тимомегалия

CD3+ клетки

%

109/л

CD3+CD4+ клетки

%

109/л

CD3+CD8+ клетки %

109/л

CD4+CD25hi клетки

%

109/л

Включение 3Н-тимидина, имп/мин

спонтанное

ФГА-индуцированное

79.8 ± 9,0 4,59 ± 0,93

56.9 ± 10,7 3,23 ± 0,72

21,4 ± 7,3 1,25 ± 0,55

4,19 ± 0,8 0,22 ± 0,05

4390 ± 2320 138 140 ± 58 600

71,0 ± 12,1* 3,19 ± 1,25*

51,2 ± 12,1* 2,35 ± 1,04*

19,2 ± 6,1 0,96 ± 1,03*

3,95 ± 1,49 0,18 ± 0,09*

3900 ± 2200 115 040 ± 39 060*

Примечание. * — р < 0,05.

по следующей программе: 1 цикл — 50°С 2 мин, 95°С 10 мин; 50 циклов — 94°С 30 с, 60°С 30 с. Измерение уровня флюоресценции проводили на каждом цикле при температуре 60°С.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием параметрических (с использованием ¿-критерия Стьюдента) и непараметрических (с использованием ¿/-критерия Манна—Уитни) методов.

Ранее нами подробно охарактеризовано состояние популяции Т-лимфоцитов у детей с тимомегалией разной степени выраженности [2, 8]. Здесь мы ограничимся суммарными (без учета степени тимомегалии) данными о численности, субпопуляционном составе и функциональной активности Т-клеток у детей с тимо-мегалией в сопоставлении с показателями возрастной нормы. Данные табл. 1 свидетельствуют о значимом снижении относительного и абсолютного содержания Т-клеток (СБ3+-лимфоцитов), в частности, Т-хелперов (СБ4+С03+), а также абсолютного содержания цито-токсических (СБ3+СБ8+) и регуляторных Т-клеток (СБ4+СБ25Ы).

Значимо снижен уровень пролиферативного ответа мононуклеаров на Т-клеточный митоген фитогемаг-глютинин, что свидетельствует об ослаблении функциональной активности Т-лимфоцитов.

Оценка содержания ТРЭК в мононуклеарах крови детей с тимомегалией в возрасте от 6 мес до 5 лет и детей без тимомегалии той же возрастной группы показала, что при тимомегалии число копий ТРЭК в пересчете на 1 мкг ДНК снижено в 6,18 раз (табл. 2).

Наблюдаемые различия высоко достоверны. Даже если сделать поправку на более низкое содержание

Таблица 2

Численность ТРЭК в мононуклеарах крови детей возрастом до 4 лет с тимомегалией и без тимомегалии

Группа Средняя Медиана Минимум Максимум Нижний квартиль Верхний квартиль

Группа сравнения(n =10) 61 066 57 866 38 979 94 126 53 282 66 563

Тимомегалия (n = 8) 9 884 9 491 772 17 265 6 115 13 712

Примечание. p = 0,00078.

28

Российский медицинский журнал

Возраст, годы

Зависимость содержания ТРЭК в мононуклеарах периферической крови от возраста детей. Слева отмечены величины, характеризующие численность ТРЭК у обследованных детей по данным этой работы: * — с тимомегалией; о — без тимомегалии.

Т-клеток у детей с тимомегалией (3,19 млрд Т-клеток в 1 л крови против 4,49 млрд Т-клеток в группе сравнения, т. е. в 1,44 раза меньше), умножив число копий у детей с тимомегалией на 1,44, полученная величина все равно будет многократно ниже, чем в группе сравнения — 4 461 против 13 304 копий на 1 мкг ДНК.

Известно, что интенсивность эмиграции тимоци-тов на периферию неуклонно снижается с возрастом [3, 10]. Нами рассчитана динамика числа ТРЭК в клетках крови здоровых детей в возрасте до 16 лет. При сопоставлении числа копий ТРЭК у детей от 6 мес до 5 лет с тимомегалией с показателями возрастной нормы (см. рисунок) оказывается, что оно со-

ответствует нормальным показателям, свойственным примерно 15-летним детям, у которых функциональная активность тимуса снижена по сравнению с детьми более раннего возраста.

Таким образом, нами впервые получены прямые свидетельства ослабления эмиграции Т-клеток из тимуса в периферический отдел иммунной системы у детей первых лет жизни с тимомегалией.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ваганов П. Д., МартыноваМ. И., Арион В. Я. // Рос. вестн. пери-натол. и педиат. — 2001. — Т. 46, № 3. — С. 59—60.

2. Донецкова А. Д., Никонова М. Ф., Данько И. М. и др. // Рос. им-мунол. журн. — 2008. — № 4. — С. 427—432.

3. Донецкова А. Д., Фроленко А. Л., Трошина В. В. и др. // Иммунология. — 2010. — Т. 31, № 6. — С. 329—334.

4. Зайратьянц О. В., Серов В. В., Кузьменко Л. Г. // Арх. пат. —

1990. — Т. 52, № 6. — С. 33—39.

5. Зайратьянц О. В. // Арх. пат. — 1991. — Т. 53, № 10. — С. 3—12.

6. Зайратьянц О. В. Синдром увеличенной вилочковой железы у детей. — М., 1993.

7. Ивановская Т. Е., КатасоноваЛ. П. // Арх. пат. — 1986. — Т. 48, № 1. — С. 3—9.

8. Никонова М. Ф., Данько И. М., Ваганов П. Д., Ярилин А. А. // Иммунология. — 2008. — Т. 29, № 4. — С. 201—206.

9. Тюрин Н. А., Арион В. Я., Пушко Л. В. и др. // Педиатрия. —

1991. — № 6. — С. 39—42.

10. Douek D. C., Me Farland R. D., Keiser P. H. et al. // Nature. — 1998. — Vol. 396. — P. 690—695.

11. Hochberg E. P., Chillemi A. C., Wu C. J. et al. // Blood. — 2001. — Vol. 98. — P. 1116—1121.

12. Kong F.-K., Chen C. L., Cooper M. // Immunity. — 1998. — Vol. 8. — P. 97—104.

13. Ribeiro R. M., Perelson A. S. // Immunol. Rev. — 2007. — Vol. 216. — P. 21—34.

Поступила 22.04.12

Обмен опытом

© В. А. ВЕРХНЕВ, 2012 УДК 616.24-002-022.6-08:614.2

В. А. Верхнее*

ОПЫТ ОРГАНИЗАЦИИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ВИРУСНЫМИ ПНЕВМОНИЯМИ

ГБУ РМЭ Йошкар-Олинская городская больница, отделение анестезиологии-реаниматологии Казанского государственного медицинского университета

*Верхнев Валентин Александрович, канд. мед. наук, зав. отд-нием анестезиологии и реаниматологии, ассистент каф. общей врачебной практики № 2. 424035, Республика Марий Эл, Йошкар-Ола, ул. Карла Либкнехта, д. 55. Е-таД^огЪо1@тап-е1.га

♦ Цель исследования — разработка тактики интенсивной терапии больных вирусными пневмониями, находившихся в отделении реанимации в 2009—2011 гг. Среди 75 госпитализированных пациентов преобладали лица в возрасте 22—45 лет — 41 (55%), из них 4 беременные женщины (сроки беременности 16, 29, 38 и 39 нед). Сроки пребывания в реанимации составили 6,2 койко-дня. Срочный перевод на искусственную вентиляцию легких потребовался 33 (44%) больным. Основу противовирусной терапии составил осельтамивир. Эмпирическая антибактериальная терапия проводилась меропенемом, цефепимом, левофлоксацином. Умерли 18 (24%) больных, из них у 11 (61%) был выделен вирус гриппа А(НШ1)2009. Летальных исходов среди беременных не было.

Ключевые слова: грипп А(НШ1)2009, пневмония, реанимация, интенсивная терапия

V.A. Verkhnev

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

THE EXPERIENCE OF ORGANIZATION OF TREATMENT OF PATIENTS WITH VIRAL PNEUMONIA

The Kazan state medical university, Kazan

♦ The article discusses the intensive therapy policy in patients with viral pneumonia in the department of reanimation in 2009-2011. Among 75 hospitalized patients prevailed persons aged 22-45 years (41 patients, 55%), including 4 pregnant women

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.