CC BY
11ОРИГИНАЛЬНЫЕ ЛЕКТИНЫ САПРОФИТНЫХ БАЦИЛЛ КАК ВОЗМОЖНЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Карпова Ирина Сергеевна
доктор биологических наук, Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, г. Киев
Коваленко Эмма Александровна доктор биологических наук, Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного
НАН Украины, г. Киев Подгорский Валентин Степанович
академик НАН Украины, Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, г. Киев
ORIGINAL LECTINS OF SAPROPHYTIC BACILLI AS POSSIBLE REGULATORS OF MAMMALIAN CELLS PROLIFERATION Karpova Iryna, Doctor of Science, Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv Kovalenko Emma, Doctor of Science, Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
Podgorsky Valentine, Academician of National Academy of Sciences of Ukraine, Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
АННОТАЦИЯ
Цель работы - изучение структурно-функциональной гетерогенности внеклеточных лектинов сапрофитных бацилл как потенциальных противоопухолевых препаратов. Использованы микробиологические, биохимические, молекулярно-биологические и статистические методы исследований. Выделены и охарактеризованы три изо-лектина, отличающихся по физико-химическим и биологическим свойствам, а также действию на пролиферацию клеток млекопитающих in vitro. Следовательно, при изучении противоопухолевых свойств лектинов надо учитывать возможность разнонаправленного действия различных структурных вариантов этих молекул и их сродство к определенным типам рецепторов.
ABSTRACT
A purpose of work is a study of structural and functional heterogeneity of extracellular lectins of saprophytic bacilli as putative antitumour preparations. The microbiological, biochemical, molecular-biological and statistical methods of research are used. Three isolectins were isolated with different physical, chemical and biological properties, and also different effect on proliferation of mammalian cells in vitro. Consequently, in studying of lectins antitumour activity is necessary to take into account the possibility of another action of different structural variants of these molecules and their affinity to the certain types of receptors.
Ключевые слова: Bacillus subtilis, изолектины, клетки млекопитающих, пролиферация.
Key words: Bacillus subtilis, isolectins, mammalian cells, proliferation.
Большой интерес к лектинам - углевод-связываю-щим белкам, объясняется их ведущей ролью в процессах углевод-белкового распознавания, а также перспективой использования в качестве эффективных антивирусных, антибактериальных и противоопухолевых препаратов [1, 2]. Молекулярные механизмы, определяющие разную направленность их биологической активности, требуют более глубокого изучения.
В литературе имеется достаточно сведений о свойствах лектинов растений, а также высших животных и человека, раскрывающих их участие в процессах роста, пролиферации, иммунного ответа, эмбриогенеза др. [3]. К настоящему времени хорошо изучены лектины патогенных микроорганизмов и доказано их участие в инициации инфекционного процесса. Однако лектины сапрофитных бактерий долгое время оставались вне поля зрения ученых [4].
В связи с этим в Институте микробиологии и вирусологии им Д.К. Заболотного НАН Украины в конце 80-х годов прошлого столетия было основано оригинальное научное направление - изучение лектинов сапрофитных микроорганизмов, в большей степени внеклеточных лектинов бацилл. Была отработана технология получения
данных лектинов с учетом физиологических особенностей их биосинтеза, охарактеризованы физико-химические свойства и их редкая углеводная специфичность к сиало-вым кислотам [1, 4].
Известно, что лектины представлены не индивидуальными молекулами, а популяцией разных молекулярных форм (изолектинов), который, предположительно, функционирует как единый регуляторный комплекс. В связи с этим, целью данного исследования была разработка подходов к изучению структурно-функциональной гетерогенности внеклеточных лектинов бацилл, а также определение их влияния на пролиферацию клеток млекопитающих in vitro как основы возможного использования в качестве противоопухолевых препаратов.
Методы. Объектом исследования был сапрофитный штамм Bacillus subtilis ИМВ В-7014 из Украинской коллекции микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, который отличался высоким выходом внеклеточного лектина в среду роста. Лектиновую активность определяли общепринятым методом [5] в реакции гемагглютинации (РГА) с трип-синизированными и фиксированными глутаровым альдегидом эритроцитами кроля и барана, которую выражали
как титр-1 РГА, что соответствовало одной гемагглютини-рующей единице (ГАЕ). Углеводную специфичность определяли в реакции торможения геммаглютинации с набором из 44 углеводов и гликопротеинов.
Изолектины получали комбинированным методом путем высаливания из культуральной жидкости сульфатом аммония при 70% насыщении с последующим изо-электрофокусированием в модификации [6]. Препараты белков характеризовали с помощью электрофореза в SDS-PAGE по Лэммли.
Влияние изолектинов на пролиферацию клеток млекопитающих in vitro регистрировали с помощью МТТ
Свойства изолектинов штам
(тест-набор CellTiter96, Promega) по изменению показателя абсорбции при 570 нм.
Статистическую обработку данных проводили стандартными методами [7].
Результат. Использование метода изоэлектрофоку-сирования позволило выявить в первую очередь различия гемагглютинирующих субстанций по заряду, в соответствии с которым они сконцентрировались в трех зонах рН: кислой, промежуточной и щелочной, которым присвоено рабочее название BSL1 (B. subtilis lectin), BSL2 и BSL3, соответственно (Таблица).
Таблица
I Bacillus subtilis ИМВ В-7014
Характеристика Изолектины
BSL1 BSL2 BSL3
Зона рН 2,5 - 3,0 6,0 - 6,5 8,5 - 9,0
РГА кроль РГА отсутствует 16 ГАЕ 1024 ГАЕ
баран 512 ГАЕ РГА отсутствует РГА отсутствует
Углеводная специфичность Муцин подчелюстной железы быка N-ацетил-нейраминовая кислота сиалолактоза
Молекулярная масса 50 кДа 40 кДа 55 кДа
Кроме заряда полученные изолектины отличались избирательностью к эритроцитам разной видовой специфичности, где BSL1 взаимодействовал только с эритроцитами барана, а остальные два - с эритроцитами кроля. Препараты существенно отличались по гемагглютинирую-щей активности и располагались в порядке убывания: BSL3>BSL1>BSL2. Определение углеводной специфичности позволило выявить, с одной стороны, у всех изученных препаратов редкую специфичность к сиаловым кислотам, а с другой стороны - их индивидуальную способность распознавать тонкие различия в структуре этих кислых сахаров.
Расчетные значения молекулярных масс изолектинов, исходя из представлений об их субъединичном строении (10 кДа и 25 кДа), дали основание предположить, что BSL1 является гомодимером с мМ 50 кДа, BSL2 - гомотет-рамером с мМ 40 кДа, а BSL3 - гетеротетрамером с мМ около 55 кДа.
Для изучения влияния изолектинов на пролиферацию клеток млекопитающих in vitro использовали препараты с альтернативным зарядом, различной тонкой углеводной специфичностью и высокой лектиновой активностью - BSL1 и BSL3. Объектом воздействия изолектинов были нормальные клетки (первичные фибробласты мыши), условно-нормальные клетки (эпителиоподобные клетки яичника китайского хомячка) и раковые клетки линии HeLa (Рисунок 1).
Показано, что изолектины Bacillus subtilis отличались по характеру воздействия на клетки млекопитающих. Их эффект зависел от концентрации препарата и типа клеток. В культуре первичных фибробластов мыши оба изо-
лектина проявили цитостатическое действие, степень которого с увеличением концентрации снижалась(Рисунок 1a). В отличие от этого клетки перевиваемой линии китайского хомячка оказались резистентными к цитостатиче-скому эффекту этих препаратов. Более того, изолектин BSL3 выявил тенденцию к стимуляции роста клеток данного типа, более выраженную при концентрации 2 мкг/мл (Рисунок 1b). Особенно выраженные различия в действии изолектинов проявились в результате обработки злокачественно трансформированных клеток человека линии HeLa. В этом случае препарат BSL1 достоверно снижал их пролиферативную активность на 25-30 % во всем диапазоне концентраций, в отличие от другого изолектина, слабое цитостатическое влияние которого на данные клетки оказалось не достоверным (Рисунок 1с).
Противоопухолевое действие лектинов растений давно привлекает внимание ученых. Неоднозначость результатов исследований в этой области возможно объясняется тем, что различные лектины, а также их структурные варианты могут взаимодействовать с разными поверхностными рецепторами и активировать разные сигнальные системы. Если рассматривать лектины как перспективные противоопухолевые препараты, необходимо учитывать их структурно-функциональную гетерогенность. Цитостатическим действием может обладать какая-либо одна изоформа, в то время как другие могут стимулировать деление клеток или не влиять на этот процесс. В пользу такого предположения свидетельствуют полученные нами результаты по изучению влияния изолектинов Bacillus subtilis на пролиферацию клеток млекопитающих в культуре.
0.5
0.4
0.2
а
20
1 .2
О.8
0.2
20
b
О.7
0.6 --
0.5
0.4
0.2
нх
20
С
Рисунок 1. Сравнительное действие молекулярных форм внеклеточного лектина Bacillus subtilis ИМВ В-7014
на пролиферацию клеток млекопитающих in vitro: Первичные фибробласты мыши (а); эпителиоподобные клетки яичника китайського хомячка (Ь); раковые клетки линии HeLa (c). Изолектны: 1-BSL1, 2-BSL3, 3- контроль без лектина. х- концентрация препарата в мкг/мл; у - показатель абсорбции при 570 нм; *- достоверные отклонения ат уровня контроля. (p < 0,05).
Выводы.
1. С использованием метода изоэлектрофокусирова-ния показана структурна-функциональная гетерогенность внеклеточного лектина сапрофитн ого штамма Bacillus subtilis ИМВ В-7014, препарат которого содержал как минимум три изолектина (BSL1, BSL2 и BSL3) с различными физико-химическими и биологическими свойствами.
2. Выявлена различная чувствительность клеток млекопитающих к действию изолектинов бацилл, в результате которой отмечена стимуляция или торможение деления клеток. Наиболее чувствительными к цитостатическому действию оказались раковые клетки линии HeLa, а наименее - клетки китайського хомячка.
3. Показан выраженный цитостатический эффект препарата BSL1 в отношении злокачественно транс-формированиых клеток во всем диапазоне изученных концентраций.
Авторы выражают благодарность сотрудникам Института молекулярной биолонии и генетики НйН Украины профессору Лукаш Л.Л., научному сотруднику Рубан Т.А. и ведущему инжеееру Института микроби ологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины Гетьман Е.И. за помощь в экспериментальной работе и ценные консультации.
Литература
1. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Карпова И.С., Са-щук Е.В., Гетьман Е.И. Внеклеточные лектины са-
профитных штаммов бактерий рода Bacillus // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50, № 3. - Ст. 1-8.
2. Podgorsky V., Kovalenko E., Karpova I., Saschuk E., Getman E. New extracellular Bacillus subtilis lectins with sialic acid specificity // Journal of Agricultural Science and Technology A&B USA. - 2014. - V. 4, № 6. - P. 541-546.
3. Lis H., Sharon N. Lectins. - New York: Springer, 2007, 472 p.
4. Подгорский В.С., Коваленко Э.А., Симоненко И.А. Лектины бактерий. -Киев: Наук. Думка, 1992, 204 ст.
5. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Антонюк В.А. Методические рекомендации для биохимиков и иммунологов. - Львов: Львовский государственный мединститут, 1980, 20 ст.
6. Sova O. Autofocusing - a method for isoelectric focusing without carrier ampholytes // J. Chromatography. - 1985. - V. 320, № 1. - P. 15-22.
7. Вознесенский В.Л. Первичная обработка экспериментальных данных. - Ленинград: Наука, 1969. - 84 ст.
БИОДЕГРАДАЦИЯ ИОНООБМЕННЫХ СМОЛ СИСТЕМ ВОДООЧИСТКИ
АТОМНЫХ ЭЛЕКТРОСТАНЦИЙ
Жданова Галина Владимировна
кандидат техн. наук, доцент, Севастопольский государственный университет, г.Севастополь.
Ковальчук Юлия Лукинична
кандидат биолог.наук, ФГБУН Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН, г.Москва.
Заниздра Валерия Сергеевна Черноморское высшее военно-морское училище им. П.С.Нахимова, г.Севастополь
BIODEGRADATION OF EXCHANGE PITCHES OF SYSTEMS OF WATER PURIFICATION OF ATOMIC POWER STATIONS Zhdanova Galina, Candidate of tech. Science, assistant professor of The Sevastopol state university, Sevastopol Kovalchuk Yulia, Candidate of biol. Science, FGBUN Institute of problems of ecology and evolution A.N.Severtsova, Moscow Zanizdra Valeriya, The Black Sea higher naval school of P.S.Nakhimov, Sevastopol. АННОТАЦИЯ
Показана важность применения воды высокой чистоты для систем водоочистки атомных электростанций путем исключения влияния коррозионно-опасных микроорганизмов на ионообменные свойства фильтрующих материалов. Описаны источники и последствия заражения микроорганизмами ионообменных фильтров. Сделан вывод о необходимости периодической обработки ионообменных смол ингибиторами роста микроорганизмов. ABSTRACT
Importance of application of water of high cleanliness for systems of water purification of atomic power stations (APS) by an exception of influence of corrosion-dangerous microorganisms on ionexchange properties of filtering materials is shown. Sources and consequences of infection by microorganisms ionexchange filters are described. The conclusion is drawn on necessity of periodic processing ionexchange pitches ingibitor growth of microorganisms. Ключевые слова: ионообменные смолы, система водоочистки, АЭС. Keywords: exchange pitches, systems of water purification, APS.
Актуальность темы исследования определяется важностью обеспечения экологической безопасности России при эксплуатации атомных электростанций (АЭС) и объектов, связанных с ядерной энергетикой. В процессе работы АЭС происходит непрерывное поступление с природной водой примесей, в частности микробиологического происхождения, вызывающих биологическую коррозию технологического оборудования. Бактерии коррозионной группы попадают в трубопроводы энергетических установок через системы водоочистки, ионообменные материалы которых не обладают бактерицидными свойствами, а наоборот, являются питательным субстратом для жизнедеятельности микрофлоры. В связи с этим актуальность исследования влияния коррозионно-опас-ных микроорганизмов на ионообменные свойства фильтрующих материалов, несомненна. Исследования в этом
направлении во всем мире очень ограничены и практически отсутствуют в России.
Для работы промышленного оборудования потребность в технологической воде обеспечивается путем деминерализации воды с помощью ионообменных фильтров. Иониты применяются для приготовления воды высокой чистоты, в частности, необходимой для заполнения и подпитки энергетических контуров.
Бактериальная флора, попадая с потоком воды на фильтрующие материалы АЭС, загрязняют их, ухудшая качество обессоленной воды, и уменьшают срок эксплуатации ионообменных смол и конструкционных систем. Обессоленная вода по величине водородного показателя, концентрации растворенного кислорода, сульфат-ионов, органических S -, N -, O - содержащих соединений явля-
