CC BY
69
суды этого венозного образования слизистой оболочки, расширяясь, способствуют сужению просвета носослезного протока изнутри, в результате слезы идут только из глаз. При плаче часть слезной жидкости может идти через нос - сопли, часть из глаз -слезы. И вдобавок ко всему еще и слюни текут, поскольку слезный центр является частью ротового центра пищеварения, который обеспечивает секрецию подъязычной и подчелюстной желез.
Если проанализировать вышеизложенное, то можно прийти к следующему: координационный центр совместной деятельности соматической и вегетативной мускулатуры (и желез), образованный соматическим двигательным и парасимпатическим ядрами лицевого нерва является ротовым центром пищеварения, слезным центром, а также рабочим центром положительных и отрицательных эмоций, связанных первоначально с приемом пищи. Итак, все эти центры связаны между собой морфологически и функционально, хотя каждый из них может функционировать самостоятельно под влиянием внешних раздражителей через вкусовую чувствительную порцию самого лицевого нерва или общечувствительную порцию тройничного нерва или под влиянием вышерасположенных корковых, подкорковых и стволовых различных центров. В частности, через среднемозговое лимбическое поле, включающее в себя центральное серое вещество и ретикулярную формацию [7].
Литература
1. БМЭ.- Т.23.- М.,1984.- С. 409.
2. Литвиненко Л МЛ ВНМТ.- 1997.- №4.- С. 90-93.
3. Фениш Х. Карманный атлас анатомии человека на основе
международной номенклатуры.- Минск: Вышэйшая школа.
1996.- С. 286.
4. БМЭ.- Т.8.- М.,1984.- С. 515.
5. Анохин П.К.// Вестник АМН СССР.- 1965.- №6.- С.10.
6. БМЭ.- Т.23.- М.,1984.- С. 410.
7. БМЭ.- Т.28.- М.,1984.- С. 150.
УДК 616.37-002
ОРГАНИЗАЦИЯ ВХОДНОГО КОНТРОЛЯ ПУЛОВ ПЛАЗМЫ ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НА МАРКЕРЫ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ
«В»И «С»
Н.В. ЗУБКОВА, Е.В. ФИЛАТОВА, В.В. АНАСТАСИЕВ,
М. А. МОИСЕЕВА*
Формирование больших пулов плазмы при производстве лечебных препаратов крови, состоящих из тысяч, а иногда, десятков тысяч донаций, требует разработки специальных подходов к организации контроля вирусной безопасности сырья.
В развитых странах мира порядок контроля пулов плазмы на предприятиях фракционирования четко определен [3, 5, 6]. В монографии «Плазма человека для фракционирования» в Европейской фармакопее 5-го издания, наряду с проверкой индивидуальных донаций, рекомендовано тестировать первый гомогенный пул плазмы на антигены гепатита В, антитела к вирусу гепатита С, ВИЧ и РНК вируса гепатита С [7]. Пул плазмы считается пригодным для производства препаратов крови, если в нем отсутствуют специфические маркеры указанных инфекций. В России контроль пулов плазмы не регламентирован, валидированные диагностические тест-системы, предназначенные для этой цели, отсутствуют. Практически нет сведений о применении на отечественных предприятиях по производству препаратов из плазмы крови геноамплификационных методов исследования, одним из которых является метод полимеразной цепной реакции, позволяющий выявлять не опосредованный маркер (антитела), а нуклеиновые кислоты возбудителей инфекционных заболеваний.
Цель работы - оценка эффективности выявления маркеров вирусов гепатита В и С в пулах плазмы для фракционирования и разработка алгоритма мини-пул-тестирования плазмы на предприятиях фракционирования.
* Филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио», г. Нижний Новгород
«Г*
і.г^ --------------------------------------------------------
1 10 100 1000 '^СОЭО 1ИМЮ 1000000
Когыешред1яНВэ*й (нг*ип)
Рис. 1. Распределение концентраций НВ$А§ в плазме крови доноров-вирусоносителей Приволжского федерального округа (п=100)
л
26-1 ЕС ЗОІЛІИ £г»11М1
Кі.г_'У 4 П-ШЛI пи -У-ь-Н-1—.ТТ. І.ЗС1) і™ 1% ІЛІ ІЛ* рЪ
■ ілгп-ЕГС ж.РНК> J i.4_B.-ET Г
Рис.2. Выявление РНК ВГС в образцах плазмы крови доноров с различной активностью антител (п=73)
Таблица 1
Эффективность выявления НВsAg методом ИФА в пулах плазмы (п=60)
Кол-во модельных пулов, п Кол-во индивидуальных донаций доноров в 1 пуле Результаты тестирования пулов Эффективность выявления, (%)
негативных позитивных (концентрация HBsAg) отр. пол.
20 19 1 (>100 нг/мл) 0 20 100
20 27 1 (>100 нг/мл) 0 20 100
10 19 1 (<100 нг/мл) 0 10 100
10 27 1 (<100 нг/мл) 2 8 80
Таблица 2
Эффективность выявления анти-ВГС методом ИФА в пулах плазмы (п=120)
Кол-во модельных пулов Кол-во индивидуальных донаций в 1 пуле Результаты тестирования пулов Эффективность выявления,%о
негативных позитивных (активность) кол-во отр. кол-во пол.
44 19 1 (высокая) 0 20 100
44 27 1 (высокая) 0 20 100
16 19 1 (низкая) 11 3 21,4
16 27 1 (низкая) 12 2 14,2
Материалы и методы. В работе были использованы следующие материалы: индивидуальные образцы плазмы донорской (п=8570), полученные со станций переливания крови Приволжского федерального округа; мини-пулы плазмы для фракционирования от 24+4 доноров (п=60), сформированные в производственных условиях на Нижегородском филиале ФГУП «НПО «Микроген»; модельные пулы плазмы для фракционирования от 24+4 доноров, содержащие позитивную по гепатиту В (п=20) и С (п=40) плазму; индивидуальные образцы плазмы донорской,
отбракованные по наличию НВбА§ (п=100) и анти-ВГС (п=40) на станциях переливания крови Приволжского федерального округа. Для изготовления модельных пулов использовали только положительные образцы, содержащие вирусный геном (ДНК ВГВ или РНК ВГС) и охарактеризованные по концентрации НВбА§ и
коэффициенту позитивности анти-ВГС. Поверхностный антиген вируса гепатита В (НВsAg) и антитела к вирусу гепатита С (анти-ВГС) определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с применением диагностических иммуноферментных тест-систем «ИФА-HBsAg», «ИФА-анти-ВГС» и «Спектр-4» (Нижегород-
ский филиал ФГУП «НПО «Микроген», г. Нижний Новгород).
Количественное содержание HВsAg определяли по калибровочной кривой, построенной в программе Microsoft Excel с использованием отраслевого стандартного образца HВsAg (ОСО 42-28-311-03H). При оптической плотности более 1,5 о.е. пробу разводили, уровень НВsAg определяли с учетом разведения. Коэффициент позитивности анти-ВГС-положительных проб рассчитывали: К= ОПпро6ы/ОПкрит.*п, где n - разведение.
Определение дезоксирибонуклеиновой кислоты вируса гепатита В (ДНК ВГВ) и рибонуклеиновой кислоты вируса гепатита С (РНК ВГС) в индивидуальных образцах плазмы и в модельных пулах проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием коммерческих тест-систем производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (г. Москва).
Таблица З
Эффективность выявления РНК ВГС методом ПЦР в пулах плазмы (n=12G)
Кол-во модельных пулов Кол-во индивидуальных донаций в 1 пуле Результаты тестирования пулов Эффективность выявления,%
кол-во отр. кол-во пол.
негативных позитивных (активность)
44 19 1 (более 24) 0 20 100
44 27 1 (более 24) 0 20 100
16 19 1 (менее 24) 1 15 93,7
16 27 1 (менее 24) 2 14 87,5
Результаты. Организация входного контроля на предприятиях фракционирования осуществляется обычно в формате мини-пулов, когда первичные гомогенные пулы проходят контроль еще до формирования производственной загрузки. Учитывая, что метод ИФА в настоящее время является единственным в России декларированным методом для оценки вирусной безопасности плазмы для фракционирования, первоначально перед нами стояла задача оценить специфичность иммуноферментных тест-систем, предназначенных для контроля индивидуальных дона-ций, а затем определить факторы, влияющие на эффективность выявления НВsAg и анти-ВГС в пулах плазмы. Для оценки специфичности тест-систем «ИФА-НВsAg» и «ИФА-анти-ВГС» смешивали предварительно проверенные и негативные по НВsAg и анти-ВГС индивидуальные образцы плазмы. Полученные таким образом мини-пулы 24+4 донаций тестировали методом ИФА. Ложноположительных результатов не выявлено. Для оценки эффективности выявления НВsAg в пулах плазмы формировали модельные пулы, изготовленные в лабораторных условиях путем смешивания по 1 мл 19-27 негативных образцов с 1 мл положительного по гепатиту В образца. Положительные по НВsAg образцы плазмы условно были разделены на две группы: с исходной концентрацией НВsAg >100 нг/мл и <100 нг/мл.
Эффективность выявления НВsAg в пулах (п=40), контами-нированных положительными образцами с концентрацией НВsAg более 100 нг/мл, и в пулах из 19 донаций, контаминиро-ванных положительными образцами с концентрацией НВsAg менее 100 нг/мл (п=10), составляла 100%. В то же время при контроле пулов, сформированных из 27 негативных донаций и 1 положительного образца с концентрацией НВsAg <100 нг/мл, НВsAg обнаруживался только в 80% случаев (табл.1).
Одной из причин снижения эффективности выявления НВsAg в пулах плазмы было разведение антигена плазмой, не содержащей этого маркера, а также присутствие в пулах нейтрализующих антител. Процесс нейтрализации нами подробно описан ранее [1]. В данном случае более важно было определить, насколько часто встречаются донации, содержащие НВsAg в концентрации 100 нг/мл и менее. Для этого нами была проведена оценка распределений концентраций НВsAg в 100 образцах донорской плазмы, забракованной на нескольких станциях переливания крови Приволжского федерального округа. Результаты наших работ показали, что 90,7% доноров-вирусоносителей имели уровень НВsAg в плазме >100 нг/мл и 9,3%<100 нг/мл
(рис.1). Исходя из содержания HBsAg у доноров-
вирусоносителей и учитывая, что на предприятия фракционирования обычно поступает плазма, прошедшая первичный скрининг, нами рассчитан риск получения плазмы с концентрацией HBsAg <100 нг/мл. Он является низким и составляет 1 случай на 92150 индивидуальных донации. Учитывая, что эффективность выявления таких образцов в мини-пулах плазмы доноров составляет >80%, риск контаминации плазменного пула поверхностным антигеном вируса гепатита В ниже уровня детекции будет составлять 1 случай на 19197 мини-пулов.
Для определения маркеров ВГВ в мини-пулах плазмы был использован метод ПЦР. Для этого модельные пулы (n=20), контаминированные ДНК ВГВ-позитивными образцами, содержащими HBsAg в концентрации менее 100 нг/мл, исследовали методом ПЦР. Однако, вопреки ожиданиям, эффективность выявления маркеров ВГВ была невысокой и составила 30% для исследованных проб. Невысокую эффективность выявления ДНК ВГВ по сравнению с HBsAg можно объяснить тем, что концентрация HBsAg в плазме крови доноров-вирусоносителей обычно многократно превышает концентрацию полных вирусных частиц [2]. По данным Kuhns M.C. [2004], корреляция между концентрацией HBsAg и ДНК ВГВ в плазме крови достаточна низкая, и у 36% доноров-вирусоносителей концентрация ДНК ВГВ может быть ниже предела детекции методом ПЦР [8].
Поэтому из-за относительно высокой чувствительности тестов на HBsAg и низкой концентрации ДНК ВГВ во время длительной фазы инфекционности, исследование пулов плазмы методом ПЦР позволяет выявлять только небольшую часть инфицированной плазмы. Именно поэтому большинство фирм считают нецелесообразным тестировать пулы плазмы методом ПЦР на ДНК ВГВ [4,9]. На основании полученных результатов эффективность выявления HBsAg методом ИФА в пулах плазмы от 24+4 доноров позволяет реально снизить риск контаминации, поэтому тест на HBsAg является обязательным для оценки вирусной безопасности пулов плазмы.
Оценку эффективности выявления анти-ВГС в мини-пулах плазмы проводили аналогичным образом. Формировали модельные пулы, формировали модельные пулы, изготовленные в лабораторных условиях путем смешивания по 1 мл 19-27 негативных образцов с 1 мл положительного по гепатиту С образца. Анти-ВГС-положительные образцы плазмы, используемые для контаминации, содержали РНК и были условно разделены на 2 группы: образцы с высокой активностью антител (коэффициент позитивности более 24) и образцы с низкой активностью антител (коэффициент позитивности <24).
Эффективность выявления анти-ВГС в пулах плазмы от 2028 донаций методом ИФА составила 100% для пулов, контами-нированных анти-ВГС, содержащими образцы плазмы с высокой активностью антител, и 21,4% и менее для пулов, контаминиро-ванных анти-ВГС-содержащими образцами плазмы с низкой активностью антител (табл.2). В ходе данного исследования продемонстрировано, что при пулировании плазмы крови существенно снижается эффективность выявления анти-ВГС методом ИФА, при этом разбавление является определяющим фактором, который снижает чувствительность метода («dilution sensitivity»), что согласуется с результатами, полученными Европейским агентством по оценке медицинских продуктов [6].
Чтобы определить степень риска контаминации пулов плазмы ВГС-позитной плазмой, нами было изучено распределение коэффициентов позитивности антител у инфицированных гепатитом С доноров (рис.2). Показано, что 19% образцов инфицированной плазмы имели коэффициенты позитивности менее 2 4 , пр и э то м 7% таки х о бр аз ц о в с о держали РНК ВГС. Следует отметить, что с увеличением коэффициентов позитивности анти-ВГС доля РНК-позитивных образцов увеличивалась. Оценив полученные данные, а также, определив вероятность получения на предприятие фракционирования анти-ВГС-позитивной плазмы, нами определен возможный риск контаминации мини-пулов РНК ВГС. Он является достаточно высоким и составляет 1 случай на 600-640 мини-пулов при условии проведения контроля только методом ИФА. Исследования модельных пулов, выполненные методом ПЦР, показали, что эффективность выявления маркеров ВГС в них повысилась и достигла 87% и более (табл.3). Хотя количество исследований было ограниченным, полученные данные свидетельствовали о том, что метод ПЦР позволяет выяв-
лять инфицированные порции в пулах плазмы эффективнее, чем методы, основанные на обнаружении антител. Кроме того, использование метода ПЦР для выявления вирусных нуклеиновых кислот позволяет выявлять порции плазмы, полученные на протяжении периода «окна», а также обнаруживать донации от инфицированных лиц, у которых сероконверсии не происходит или отсутствуют антитела к эпитопам, выявляемых при помощи иммунологических реакций.
Вывод. Метод ИФА является при тестировании на гепатит В основным инструментом, обеспечивающим вирусную безопасность сырья на предприятиях фракционирования. Для контроля могут быть использованы коммерческие наборы, предназначенные для индивидуальных донаций, если доказано, что смешивание негативных образцов не влияет на специфичность анализа. Чтобы компенсировать снижение эффективности выявления анти-ВГС в пулах плазмы, необходимо дополнительное определение РНК ВГС. Комбинирование методов ИФА и ПЦР для скрининга сырья в отношении гепатита С позволит снизить риск передачи инфекции посредством трансфузий и повысить уровень вирусной безопасности выпускаемых препаратов крови.
Литература
1. Зубкова Н.В. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. и им-мунол.-.2006.-..№ 2.-.С.60-65
2. Майер К.—П.. Гепатит и последствия гепатита. / Пер. с нем. - М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - 423 с.
3. Панов В.П. и др. / В кн. Качество, эффективность, безопасность средств трансфузионной и инфузионной терапии (Сб.трудов службы гос. контроля) / Под. ред. А.И. Воробьева, В.П. Панова.- М.- 2005.- С.76-94
4. Bush M.P., Klainman S.N. // Transfusion.- 2000.- 40 (2).-P.143-149
5. CPMP/BWP/269/95, rev/2: Note for guidance on plasma-derived medical products
6. EMEA Workshop on the Plasma Master File//CPMP/BWP/1737/02
7. European Pharmacopee. Monogr 0853: Human Plasma for fractionation/ 01/2002
8. KuhnsM.C. et al. // Transfusion.- Vol.44.- 2004.- P.527.
9. OffergeldR. et al. // Euro Surveill.- 2005.-10(2).- P.8-11
THE ORGANIZATION OF ADMISSION CONTROL OF PLASMA’ FOR FRACTION OF VIRUS HEPATITIS «B/C» MARKERS
N.V. ZUBKOVA, E.V. FILATOVA, V.V. ANASTASIEV, M.A. MOISEEVA
Summary
The results of this study allows to affirm that the method of IFA is effective and important for testing of hepatitis B which provides virus safety
Key words: hepatitis B, control of plasma’
УДК 577.112.3 612.17 613.96
ГОМОЦИСТЕИНОВЫЙ ОБМЕН У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА Н.А. АГАДЖАНЯН*, Л.Д. ЦАТУРЯН**
Благодаря исследованиям создана концепция факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Эти факторы риска связаны с образом жизни, окружающей средой, генетическими особенностями человека, способствующие развитию и прогрессированию ССЗ. При этом следует учитывать, что начальные признаки поражения артерий атеросклерозом появляются уже в детском, подростковом и юношеском возрасте [1-3].
В последние годы диагностика ССЗ чаще основывается на исследовании липидного обмена, с определением атерогенных липопротеинов и гемостаза [4, 5]. Итоги проспективных эпидемиологических исследований свидетельствуют об увеличении
***Российский университет дружбы народов, г. Москва
** Ставропольский государственный университет, г. Ставрополь
риска развития инфаркта миокарда, повышенное содержание гомоцистеина (ГЦ) является независимым фактором риска развития атеросклероза. Рост уровня ГЦ в плазме на 5 ммоль/л увеличивает риск развития ССЗ и общей смертности в 1,3-1,7 раза, гипергомоцистеинемия является наиболее сильным предиктором сердечно-сосудистых осложнений [6, 7]. ССЗ среди мужчин среднего возраста в 3-4 раза выше, чем у женщин [ 8, 9].
ГЦ представляет собой серосодержащую аминокислоту и формируется в процессе метаболизма незаменимой аминокислоты метионина, в плазме находится преимущественно в связанной с белками форме. Общий ГЦ плазмы состоит из свободного и связанного ГЦ, большая часть которого подвергается обратному метилированию с образованием метионина, следует добавить, что в метаболизме ГЦ участвуют витамины В12, В6, фолиевая кислота. ГЦ быстро окисляется в плазме крови, в результате образуется большое количество радикалов, содержащих активный кислород. При этом происходит повреждение клеток эндотелия, ведущее к нарушению многочисленных функций, кроме того, в исследованиях продемонстрирована способность ГЦ стимулировать пролиферацию гладкомышечных клеток в сосудистой стенке [10, 11]. Уникальность сложившейся ситуации гипергомоцистеи-немии заключается в том, что она диктует необходимость детальной расшифровки механизмов «повреждающего» действия ГЦ [12]. Важно изучение особенностей метаболизма ГЦ и его нарушений у молодых, а также разработка ранних превентивных мероприятий, направленных на устранение факторов риска развития сердечно-сосудистой патологии.
Цель работы — изучение особенностей метаболизма ГЦ у юношей и девушек, проживающих в разных регионах Северного Кавказа с учетом национальной принадлежности.
Материал и методы исследования. В результате выездных исследований нами обследовано 86 практически здоровых студентов, в возрасте 16-21 год (49 юношей и 37 девушек), проживающих на территории Северного Кавказа и обучающихся в вузах. Обследованный контингент разделен на группы в зависимости от проживания, этнической и половой принадлежности: I группа - 17 русских юношей, уроженцы Ставропольского края, II группа - карачаевцы, живущие на территории Карачаево-Черкесской республики (п = 16), III группа (п = 16) представлена жителями Кабардино-Балкарской республики, IV группа - 13 русских девушек, живущих на территории Ставропольского края, V группа - уроженки Карачаево-Черкесской республики (п = 12) и VI группа (п = 12) - жительницами Кабардино-Балкарии.
Иммуноферментным методом определяли уровень ГЦ в сыворотке крови с использованием набора реактивов АХК-8ШЕЬЭ (Норвегия) и выраженность гипергомоцистеинемии. Для изучения метаболизма ГЦ, использовали свежевыделенные пробы сыворотки крови. У обследуемых взятие крови проводили после соблюдения 12-14-часового голодания, натощак, пункцией иглой локтевой вены (самотеком). Для описательной статистики использовали вычисление крайних значений, медиан, средних значений. Достоверность различий между изучаемыми группами по анализируемому показателю оценивали по ^Стьюдента, различия считали статистически значимыми при Р<0,05.
Таблица 1
Референтные пределы колебаний ГЦ в сыворотке крови у юношей
Показатель I группа (n=17) II группа (n=16) III группа (n=16) Р Р1 Р2
ГЦ, (М±ш| мкмоль/л 9,61±0,55 7,03±0,52 8,51±0,45 <0,001 >0,1 <0,05
Min 6,24 5,01 5,23
Max 15,96 11,02 12,76
Me 8,56 6,35 8,65
Р - доказательные различия уровня ГЦ между I и II группами; Р1 - различия уровня ГЦ между I и III; Р2 - различия уровня ГЦ между II и III
Результаты исследования. Ср. значения уровня общего ГЦ в сыворотке крови у юношей выявили доказательные различия между референтными пределами его колебаний в группах, представленных в табл.1. В группе русских юношей обнаружены достоверные различия референтных интервалов ГЦ в сравнении с юношами II группы, а также у представителей II и III групп. Уровень общего ГЦ отражает суммированное в ней содержание связанных с белками, свободно-окисленных и восстановленных форм ГЦ и составляет у здоровых людей ~5-15 мкмоль/л. Уме-
