CC BY
152
ВЕСТНИК ТГГПУ. 2010. №4(22)
УДК 574.64:597.442
ОРГАНИЧЕСКИЕ СУБСТРАТЫ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ БИОСТИМУЛЯЦИИ ПРОЦЕССОВ МИКРОБИАЛЬНОЙ ОЧИСТКИ ВОДЫ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ
© Н.В.Морозов, Л.З.Хуснетдинова
В статье исследована возможность применения иммобилизованных клеток нефте- и углеводоро-докисляющих микроорганизмов (НиУОМ) на органических и неорганических субстратах, являющихся одновременно биосорбционной поверхностью и биостимулятором деструкции нефти и ее производных. Отмечено, что при внесении легкоокисляемых субстратов в присутствии сообщества микроорганизмов биодеградация нефти происходит в воде более интенсивно и полно, чем в воде с отдельными монокультурами.
Ключевые слова: нефть, микроорганизмы, сорбент, иммобилизация, деструкция, культура.
Прогрессивный рост урбанизации и развитие таких отраслей промышленного производства, как нефтедобывающая, нефтеперерабатывающая и нефтехимическая, а также машиностроение, металлообработка, приводит к большим загрязнениям природных вод нефтью и ее производными, которые представляют угрозу для водных и почвенных ресурсов, а в конечном итоге, здоровья людей [1].
Известно [2; 3], что природные воды обладают способностью к самоочищению, в процессе которого органические загрязнения утилизируются и минерализуются разнообразными гетеротрофными микроорганизмами. Подобным процессам подвергаются и нефтяные загрязнения в воде открытых водоисточников.
Однако естественные процессы самоочищения уже не в состоянии справиться с возрастающим нефтяным загрязнением, и поэтому для интенсификации процессов восстановления естественных свойств воды необходимы наиболее эффективные методы и технологии. В связи с этим одним из перспективных направлений очистки природных и сточных вод от нефти и ее персистентных соединений является изучение и дальнейшее практическое применение иммобилизованных клеток нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов (НиУОМ) на органических и неорганических субстратах, являющихся одновременно биосорбционной поверхностью и биостимулятором деструкции нефти и ее производных до безвредных продуктов окисления, т.е. до СО2 и Н2О.
Добиться устойчивого, постоянного присутствия НиУОМ в загрязненных нефтью и нефтепродуктами водах возможно лишь иммобилизовав их на медленно разлагаемом в воде носителе, обладающим широким спектром стимуляции микробиального окисления различных фракций нефти.
Все имеющиеся в настоящий момент методы иммобилизации клеток подразделяются на три основные группы: механические (включение в гель, мембрану), физические (адсорбция, агрегирование), химические (связывание бифункциональными реагентами) [4; 5].
Состав сточных вод постоянно меняется, и это приводит к необходимости иметь в очистном аппарате, реакторе или биокомплексе самые различные микроорганизмы - деструкторы разнообразных веществ. Для обеспечения полной очистки обрабатываемой воды необходимо создать высокую концентрацию клеток микроорганизмов - деструкторов, а это можно достичь только путем закрепления их на поверхности носителей [6].
Перспективным направлением является, как отмечалось выше, совмещение в одном материале способности физико-химической сорбции нефти и ее активной микробиодеструкции, участвующей в данном процессе иммобилизованными клетками углеводоро-докисляющих микроорганизмов. Для иммобилизации лучше использовать ассоциации микроорганизмов, так как они более эффективны, чем отдельно взятые виды. Это подтверждено результатами проведенных наших исследований [7; 8]. При этом типы связей в подобной ассоциации могут быть различны. Один вид микроорганизма может непосредственно участвовать в сорбции углеводородов нефти, другой - поставлять недостающие питательные вещества, а третьи, т.е. сообщества НиУОМ, - активно участвовать в биодеградации нефтяного загрязнения. Это по сути метаболическая "атака" на субстрат, когда синтезируются разные компоненты ферментативного комплекса, или же цепочка ферментативных реакций (многосубстратные конверсии), обусловленных жизнедеятельностью разнообразных групп НиУОМ, собранных в единый консорциум.
Многочисленными исследованиями показано [9; 10], что бактерии разных таксономических групп разрушают определенные компоненты нефтяного загрязнения, но для полной деструкции требуется наличие определенного комплекса разных видов микроорганизмов. Благодаря их деятельности нефть трансформируется до простых соединений, происходит накопление нового органического вещества и дальнейшее включение его в общий круговорот веществ [11; 12].
Установлено, что материал носителя и его форма влияют на количество закрепленных клеток по срав-
нению со свободными клетками. Правильно подобранный субстрат-носитель для прикрепления клеток микроорганизмов позволяет ускорить процесс деструкции нефти, а следовательно, степень очистки углеводородосодержащих сточных вод и повысить ее эффективность.
В качестве адсорбентов для прикрепления микроорганизмов могут быть использованы самые разнообразные материалы органической и неорганической природы: полимеры, керамика, глина, песок, искусственные волокна, активный уголь, торф, опилки, высушенные зернопродукты и других [6; 13]. Наиболее перспективными являются естественное органическое сырье и отходы производства растительного происхождения. В качестве последних можно применять различную шелуху: гречихи, риса, кукурузы, ячменя и т.д. Они, как правило, являются органической частью существующих экосистем. Их действие оказывается особенно эффективно при сборе тяжелых нефтяных фракций. Применение сорбентов на основе шелухи гречихи и шелухи риса позволяет с высокой степенью извлекать нефтепродукты из поверхностных вод.
При целенаправленном изучении разнообразной гетеротрофной микрофлоры водоемов и производственных сточных вод, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, условий развития их и необходимых добавочных продуктов для ускорения биодеградации нефтяных загрязнений можно достичь возможности управления процессами бактериального самоочищения воды и восстановить ее естественные качества [14].
Из изложенного можно определить, что целью настоящей работы явилось изучение роли отдельных биосубстратов на интенсификацию биодеградации нефти отселектированным консорциумом НиУОМ и проведение иммобилизации последних на органических и неорганических субстратах.
В лабораторных условиях проведено моделирование процесса микробиологической очистки нефтезаг-рязненных вод, содержащих различные фракции нефти, и попытка поиска такого легкоокисляемого органического субстрата - ускорителя, который служит
активным сорбентом для закрепления ассоциации уг-леводородокисляющих микроорганизмов и источником биостимуляции разложения нефти и ее производных до конечных продуктов распада, т.е. до СО2 и Н2О.
В работе представлен широкий спектр штаммов аборигенных форм НиУОМ различных родов: Rhodococcus, Pseudomonas, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Arthrobacter и др., на основе которых были созданы консорциумы высокоактивных углеводородокисляющих микроорганизмов, участвующие в окислении различных фракций нефти, и субстраты, обладающие способностью стимуляции биодеструкции нефтяных загрязнений.
В качестве сорбентов стимуляторов использовали шелуху гречихи (ГШ) и шелуху ячменя (ЯШ) размерами 0,01 мм. Общий вес вычислялся из расчета от 2 до 5 мг/дм3. Одновременно применяли также сорбенты неорганической природы - вермикулит. В качестве единственного источника углерода для выращивания культур и их ассоциаций служила товарная нефть Альметьевского месторождения (Республика Татарстан) (0,5% по объему).
Исследования по способности ассоциации культур к деструкции различной нефти в присутствии органических субстратов проводили в модельных аквариумах, объемом на 50 литров. Использовали следующие варианты опытов: вода + субстрат + нефть + три вида НиУОМ ^ вода + субстрат + нефть + десять видов НиУОМ ^ нефть + субстраты без внесения микроорганизмов (контроль). Длительность опыта равнялась 14 суткам.
О росте и развитии численности НиУОМ судили по изменению величин оптической плотности на КФК-3 при длине световой волны Х-600 нм, в кюветах объемом 5мл, а также учета численности микроорганизмов методом предельных разведений с высевом на агаризованные среды МПА и Раймонда [9].
Материалы динамики численности НиУОМ при биодеградации нефти под влиянием органических субстратов и без них представлены на рис.1.
Дни, сутки
-♦—контроль (нефть)
— контроль (гречиха)
-А— гречиха+ЗУОМ+нефть ■■— гречиха+1 ОУОМ+нефть ■Ж—контроль (ячмень) ячмень+ЗУОМ+нефть Н— ячмень+ЮУОМ+нефть ■■—контроль (вермикулит) вермикулит+ЗУОМ+нефть -♦— вермикулит+1 ОУОМ+нефть
Рис.1. Динамика роста численности НиУОМ в процессе окисления нефти
Как видно из рис.1, в процессе выращивания НиУОМ в воде с внесением легкоокисляемых оргве-ществ с нефтью и без нее происходило постепенное возрастание плотности бактериальной массы, а следовательно, достижение эффективности очистки от нефтяного загрязнения. Численность микроорганизмов при этом увеличивалась на 2-3 сутки культивирования, что связано с адаптацией их к исходному субстрату и началом его разложения. В контроле наблюдалось наименьшая эффективность деструкции нефти из-за отсутствия НиУОМ. При использовании трех видов микроорганизмов эффективность выше, чем в контрольном варианте, но не максимальна, как при использовании сообщества из десяти нефтеокисляющих культур.
Анализ влияния легкоокисляемых субстратов на степень трансформации НиУОМ нефти выявил, что добавление в опытные варианты шелухи гречихи (ГШ) и шелухи ячменя (ЯШ) в концентрации от 2 до 10 мг всегда выше, чем при применении искусственного субстрата (вермикулит). Использование данных субстратов в качестве соокислителя или биостимулирующих соединений всегда сопровождается усилением развития НиУОМ. Это отражается в увеличении численности в среде нефтеокисляющих бактерий, участвующих в деградации нефти, что, в конечном итоге, приводит к полноте окисления нефтяных загрязнений в силу возрастания ферментативных реакций. Наиболее высокая деструкция нефти в опытах с органическими субстратами в частности с ГШ и ЯШ по сравнению с контролем, очевидно, определяется созданием последними активной поверхности соприкосновения с искомым загрязнением и углеводородо-кисляющими микроорганизмами.
Интенсивность окисления нефтепродуктов в эксперименте максимальна в результате применения консорциума нефтеокисляющих культур, состоящего из десяти различных штаммов НиУОМ (ГШ - до 7287%; ЯШ - 55,0-64% против 10-12% в контроле), что установлено последующими исследованиями в 2010 году. Ассоциация, состоящая из трех штаммов, показывает малую активность деструкции углеводородов нефти, что, по-видимому, связано меньшей возможностью участия НиУОМ в окислении всего спектра углеводородов.
Из этого также следует, что смешанные ассоциации культур микроорганизмов, состоящих из 3-х и более видов культур, способны разрушать более сложные по составу нефтепродукты, чем отдельные монокультуры, так как разнообразие фракционного состава сырой нефти требует применения комплекса микроорганизмов, способных разлагать широкий спектр углеводородов (перевод нефти и нефтепродуктов из малоокисленного в полностью окисленное состояние, вплоть до СО2 и Н2О) [5].
Эффект биодеградации нефти всегда выше с применением комплекса микроорганизмов при добавлении добавочных веществ в виде сорбентов, являющихся одновременно как легкоокисляемыми органическими субстратами, так и источником биостимуляции разложения нефти.
Деструктивная активность микробных комплексов в окислении нефти и ее компонентов в опытах подтверждено также динамикой суммарного содержания органических веществ, выраженных химическим и биохимическим потреблением кислорода (ХПК и БПК5) (табл.1).
Таблица 1
Эффективность деструкции нефти НиУОМ в присутствии органических субстратов
Варианты опыта Показатели (мг/л) Дни опыта Эффективность деструкции нефти, %
1 5 10 15 20
1 2 3 4 5 6 7 8
Шелуха гречихи (контроль) бпк5 6.2 6.0 5.8 5.5 5.3 1.6
ХПК 283.2 265.0 254.4 220.8 219.2 2.5
Шелуха гречихи +3 НиУОМ бпк5 5.5 5.6 5.5 5.3 4.8 14.2
ХПК 270.4 272.0 236.8 219.2 200.0 15.0
Шелуха гречихи +10 НиУОМ бпк5 5.2 5.2 5.0 4.8 4.4 15.3
ХПК 288 272 268.8 252.8 251.2 18.3
Шелуха ячменя (контроль) бпк5 5.6 5.6 5.5 5.4 5.3 5.0
ХПК 281.6 240.0 267.2 252.8 236.6 7.0
Шелуха ячменя +3 НиУОМ бпк5 5.7 5.5 5.3 5.2 5.1 7.2
ХПК 278.4 7.2 1.2 4.4 2.0 10.5
Шелуха ячменя +10 НиУОМ бпк5 5.5 5.3 5.2 4.9 4.6 13.2
ХПК 272.0 268.8 252.6 240.0 296.8 14.8
Из анализов следует, что в вариантах с применением ГШ и ЯШ наибольшая эффективность деструкции нефти достигается с использованием консорциума НиУОМ, состоящего из десяти культур. Его эффективность, по изменению биологического потребления кислорода (БПК5), составила ГШ - 15,3% и ЯШ - 13,2%, а ХПК ГШ - 18,3% и ЯШ - 14,8% соответственно. Это достигнуто при концентрации субстратов до 100 мг/л. Уменьшение концентрации последних до 0,1 мг/л пре-
высило 34-42%. В контроле без добавления ГШ и ЯШ за те же сроки эксперимента значения эти намного ниже и составляют: БПК5 - 1,6%, ХПК - 2,5%.
Балансовые расчеты окисления нефти по вариантам выявили, что биодеградация нефтяного загрязнения с применением органического субстрата ГШ, в состав которой входят полисахаридные фракции, белково-полисахаридные комплексы и низкомолекулярные соединения [15], всегда максимальная.
Таким образом, испытания ряда органических субстратов гречишной и ячменной шелухи, а также вермикулита в качестве носителей микроорганизмов подтвердили перспективность использования субстратов растительного происхождения для интенсификации процессов очистки нефтезагрязненных вод.
Проведенные исследования подтверждают возможность широкого применения органических субстратов для иммобилизации гетеротрофных микроорганизмов, обеспечивающих высокую степень биодеградации нефти и нефтепродуктов в природных и сточных водах.
1. Хуснетдинова Л.З., Морозов Н.В., Жукова О.В. Применение органических субстратов для иммобилизации гетеротрофных микроорганизмов, участвующих в очистке природных и сточных вод от нефти // Водоочистка. - 2010. - №6.
2. Морозов Н.В., Телитченко М.М. Ускорение очищения вод от нефти и нефтепродуктов внесением в них макрофитов // Водные ресурсы. - 1977. -№6. - С.120-131.
3. Миронов О.Г. Нефтеокисляющие микроорганизмы в море. - Киев: Наук. думка, 1972. - 236 с.
4. Биотехнология. - М.: Наука, 1984. - 316 с.
5. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. -
Пущино: Отд. научно-технич. информации
НЦБИ, 1978. - 180 с.
6. Иммобилизованные клетки в биотехнологии. Сборник научных трудов. - Пущино: Отд. научно-технич. информации НЦБИ, 1987. - 174 с.
7. Жукова О.В., Хуснетдинова Л.З., Морозов Н.В. Защита окружающей среды от нефтяных загрязнений. Технологическая схема очистки нефтесодержащих сточных вод. Окружающая среда и устойчивое развитие региона: новые методы и технологии исследований // Т.1У: Экологическая
безопасность, инноваций и устойчивое развитие. Образование для устойчивого развития / под ред. проф.В.З.Латыповой и доц.О.Г.Яковлевой. - Казань: Отечество, 2009. - 404 с.
8. Морозов Н.В. Хуснетдинова Л.З. Создание консорциума микроорганизмов - промышленных биопрепаратов для применения в биотехнологии очистки нефтесодержащих стоков // Актуальные экологические проблемы республики Татарстан: Тезисы докладов VI республик. науч. конф. - Казань: Отечество, 2004. - 259 с.
9. Андреева И. С., Емельянова Е.К., Загребель-ный С.Н., Олькин С.Е., Резникова И.К., Репин В.Е. Психротолерантные штаммы-нефтедеструкторы для биоремедиации почв и водной среды // Биотехнология. - 2006. - №1. - С.43-52.
10. Печуркин Н.С. Популяционные аспекты биотехнологии. - М.: Наука, 1990. - 240 с.
11. Белоусова Н.И., Барышникова Л.М., Шкидчен-ко А.Н. Отбор микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при пониженных температурах // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т.38. - №5. - С.513-517.
12. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Ильинский В.В., Кузьмин Ю.И., Кирсанов И.Б., Яненко А.С. Интродукция бактерий рода КНОБОСОССИЗ в тундровую почву, загрязненную нефтью // Прикладная биохимия и микробиология. - 1997. - Т.33. -№2. - С.198-201.
13. Промышленная микробиология / под общей ред. Н.С. Егорова. - М.: Высш. шк., 1989. - 677 с.
14. Морозов Н.В. Экологическая биотехнология: очистка природных и сточных вод макрофитами. -Казань: КГПУ, 2001. - 396 с.
15. Земнухова Л.А., Томшич С.В., Шкорина Е.Д., Клыков А.Г. Определение молекулярной массы полисахаридов из шелухи и соломы гречихи // ЖПХ. - 2004. - Т.77. - Вып.7. - С.1192-1196.
ORGANIC SUBSTRATA OF PHYTOGENESIS AND THEIR USE FOR BIOSTIMULATION OF PROCESSES OF MICROBIOLOGICAL CLEANING OF WATER FROM OIL POLLUTION
N.V.Morozov, L.Z.Khusnetdinova
The authors of the article speculate on the possibility of the use of the immobilized cells of oil with the organic and inorganic substrata that at the same time present a bioadsorbtive surface and a biostimulator for the degradation of oil and its derivatives. It was discivered that at the entering of easy oxidation substrata in the presence of community of microorganisms oil biodegradation occurs in water more intensively and fully than in the water with separated monocultures.
Key words: oil, microorganisms, sorbate, immobilization, degradation, culture.
Морозов Николай Васильевич - доктор биологических наук, профессор кафедры ботаники и экологической биотехнологии Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.
E-mail: Morozov_nv@mail.ru
Хуснетдинова Ландыш Завдетовна - старший преподаватель кафедры ботаники и экологической биотехнологии Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.
E-mail: fego@tggpu.ru
Поступила в редакцию 14.09.2010
