CC BY
215
АКУШЕРСТВО И ГИНЕКОЛОГИЯ
УДК 618.293-07:616.15-097
ОПЫТ ВНЕДРЕНИЯ В КЛИНИЧЕСКУЮ ПРАКТИКУ МЕТОДИКИ НЕИНВАЗИВНОГО ПРЕНАТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЛА И РЕЗУС-ФАКТОРА ПЛОДА НА РАННЕМ СРОКЕ ПО КРОВИ БЕРЕМЕННОЙ ЖЕНЩИНЫ
Л.И. Трубникова1, А.Н. Тороповский2, Е.В. Жмырко2, А.Г. Никитин2, Р.Ф. Бурганова3, О.В Лысова1
гФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», 2ООО «ТестГен», г. Ульяновск, 3ГУЗ «Ульяновская областная клиническая больница»
Исследование направлено на выявление достоверности, чувствительности и специфичности методик неинвазивного определения пола и резус-фактора плода на раннем сроке беременности на основе анализа ДНК плода в крови беременной женщины. В исследование включены результаты пятилетнего опыта внедрения научной разработки ООО «Тест-Ген» на базе Ульяновской областной клинической больницы. Всего в исследовании приняло участие 138 беременных резус-отрицательных женщин, всем пациенткам было проведено тестирование внеклеточной фетальной ДНК с целью выявления гена КИС. 35 женщинам был проведен пренатальный неинвазивный анализ установления пола плода. По результатам проведенного исследования было установлено, что методики пре-натальной диагностики пола и резус-фактора плода являются простыми и надежными методами с высокой чувствительностью и специфичностью уже на 10-й нед. бере-
менности.
Ключевые слова: пренатальная диагностика, неинвазивная диагностика, молекулярно-генетическая диагностика, резус-фактор плода, пол плода.
Введение. Несмотря на существенные достижения в области перинатологии и гинекологии, многие вопросы ведения беременных, диагностики и лечения беременной матери и плода не могут считаться до конца решенными. Так, среди иммунологически обусловленных осложнений беременности ведущее место занимает гемолитическая болезнь плода и новорожденного (ГБПН), которая развивается вследствие несовместимости крови матери и плода по различным эритро-цитарным антигенам, в частности по резус-фактору крови [2].
Резус-фактор крови - это белковый антигенный комплекс на поверхности эритроцитов. В системе резуса различают пять антигенов. Наиболее иммуногенным является антиген D, присутствие которого и определяет положительный резус-фактор. Распространенность резус-положительных лиц - носителей антигена D - в европейской популяции составляет около 85 %, соответственно, доля резус-отрицательных лиц, не имеющих антигена D, - около 15 % [3].
Если резус-отрицательная женщина беременна резус-положительным плодом, её иммунная система начинает вырабатывать анти^-антитела, вызывающие разрушение эритроцитов плода [8]. Как правило, анти^-антитела отсутствуют при первой беременности резус-положительным плодом, протекающей без осложнений, однако сенсибилизация матери возникает в процессе родов [2]. А при каждой последующей беременности или при повреждении плаценты увеличивается риск ГБПН [2].
Методы, до сих пор использовавшиеся для диагностики резус-фактора плода, были либо неточны, либо связаны с инвазивными процедурами и риском прерывания беременности. Одним из вариантов является определение резус-фактора крови плода посредством анализа плодного материала, полученного при проведении кордоцентеза или амнио-центеза [6].
В настоящее время разработаны и внедрены в практическое здравоохранение диагностические тест-системы, позволяющие анализировать небольшие количества фе-тальной ДНК, содержащиеся в кровотоке матери, и определять тем самым некоторые характеристики плода, например резус-фактор или пол.
ДНК плода, или фетальная ДНК, представлена в кровотоке матери в виде фрагментов циркулирующей внеклеточной плодной ДНК и носит название внеклеточной феталь-ной ДНК (вкфДНК) [12]. ВкфДНК является продуктом распада и утилизации клеток плода, появляется в кровотоке матери уже на первом месяце беременности [12]. Внеклеточные ДНК плода составляют 3-10 % от всей циркулирующей в крови беременной внеклеточной ДНК. Чувствительность метода ПЦР дает возможность определить некоторые генетические параметры плода при анализе фетальной ДНК в крови матери, например, на таком алгоритме построено неинва-зивное определение резус-фактора и пола плода [1].
Пренатальное определение резус-фактора плода крайне актуально. Всем беременным женщинам с резус-отрицательным фактором крови предлагается в настоящее время «слепое» введение иммуноглобулина Д в целях предотвращения развития ГБПН. Антирезус-ную профилактику иммуноглобулином человека рекомендовано проводить на 28 нед. беременности либо в течение 48 ч после родов. Но как минимум 30 % беременных носят резус-отрицательного ребенка [3], и проведение такого рода профилактики не оправдано. Определение резус-фактора плода в 1-2-м триместрах беременности позволит сократить расходы на регулярное определение титра анти-D-антител и антирезусную профилактику.
Неинвазивное пренатальное определения пола плода по крови матери в современном акушерстве имеет большое значение, особенно при определении риска развития у плода
заболеваний, сцепленных с полом. В настоящее время известно более 300 наследственных заболеваний и признаков, передающихся сцепленно с полом. Самым распространенным методом определения пола ребенка является УЗИ-исследование. Однако его достоверность не превышает 70 % даже на последних месяцах беременности [1]. Благодаря современным методам диагностики появилась уникальная возможность узнать пол ребенка неинвазивным для плода способом и на самых ранних сроках беременности [1]. Такие исследования проводятся с использованием современного метода генетической диагностики - ПЦР в режиме реального времени - и позволяют получать достоверные результаты с 7-й нед. Данный метод неинвазивной пре-натальной диагностики безопасен и одновременно очень достоверен: вероятность правильного определения составляет 99 % [1].
Системы для диагностики состояний плода посредством анализа плодной ДНК в периферической крови матери являются легкими, простыми, надежными, а самое главное - единственно безопасными методиками неинвазивной пренатальной диагностики и могут быть рекомендованы для применения в акушерской практике.
В рамках научно-практического исследования и определения характеристик описанных выше методик на базе клинико-диагностической лаборатории Ульяновской областной клинической больницы была проведена работа по внедрению в клиническую практику диагностических тест-систем «ТеБ^ЖГ» и «Test-RHD» (ООО «ТестГен») для неинва-зивного определения по крови беременной женщины пола и резус-фактора плода соответственно в первом и втором триместрах.
Цель исследования. Определить информативность и диагностическую значимость авторского метода неинвазивного определения резус-фактора и пола плода.
Материалы и методы. В исследование включены результаты пятилетнего опыта внедрения научной разработки ООО «Тест-Ген» на базе Ульяновской областной клинической больницы - методик пренатального неинвазивного определения резус-фактора и пола плода «Test-RHD» и «ТеБ^ЖГ» соот-
ветственно. Всего в исследовании приняло участие 138 беременных женщин. Всем пациенткам было проведено тестирование вкфДНК с целью выявления гена RHD. Все женщины сами при этом являлись резус-отрицательными. Отрицательный резус-фактор у беременных был определен серологически. Кроме того, 35 женщинам был проведен пренатальный неинвазивный анализ для установления пола плода. От всех женщин было получено информированное согласие на выполнение данных исследований. Все женщины имели одноплодную беременность и беременность подтверждалась на УЗИ, генетическое исследование проводили в период первого и второго триместров беременности. Протоколы выделения вкфДНК и последующей ПЦР-амплификации были стандартизированы.
Свежие образцы венозной крови собирались в пробирки объемом 8 мл с ЕDТA-ан-тикоагулянтом, плазму отделяли от клеток путем центрифугирования при низкой скорости (500-3000 g в течение 10 мин) с последующим разделением плазмы и фрагментов клеток путем центрифугирования при 16000 g в течение 15 мин. Эти манипуляции проводились не позднее чем через 24 ч от момента забора крови у беременной женщины с целью сокращения доли материнской ДНК в плазме, высвобождающейся при деградации лейкоцитов. Супернатант отбирали в стерильные, свободные от ДНК пробирки, после чего проводили непосредственно процедуру выделения вкфДНК.
Из всех образцов плазмы беременных женщин, участвующих в исследовании, была выделена вкфДНК с использованием набора «ДНК-Плазма-2» (ООО «ТестГен», Россия). Процедуру выделения ДНК проводили согласно инструкции, приложенной к набору. Ввиду сложности генетики резус-фактора крови, учитывая, что существует несколько генетических механизмов, приводящих к резус-отрицательному фенотипу, с целью повышения специфичности анализа ПЦР-ам-плификацию необходимо проводить по нескольким разным регионам гена RНD. Для определения RНD-состояния плода проводили ПЦР с использованием набора «Тест-RHD» (ООО «ТестГен», Россия). Данный набор со-
держит все необходимые для реакции буферы, ферменты, dNTP, специфические прай-меры для амплификации 6, 7, 10 экзонов гена RHD и специфичные для них флуоресцентно-меченные зонды. ПЦР-РВ проводили на ПЦР-амплификаторах ДТ96 («ДНК-Технология», Россия) и CFX (Bio-Rad, США). Конечный объем реакционной смеси составлял 20 мкл. Протокол амплификации (в соответствии с инструкцией): 95 °С в течение 5 мин, затем 50 циклов 94 °С в течение 10 с и 62 °С в течение 50 с. Параллельно проводили реакцию амплификации гена GAPDH для контроля выделения ДНК и прохождения ПЦР-ам-плификации. Отрицательный контроль (де-ионизованная вода) и положительный контроль - RHD-положительная геномная ДНК (присутствует в наборе «Тест-RHD», ООО «ТестГен», Россия) были включены в каждую постановку реакций.
Исследование полученных образцов вкфДНК по гену SRY - маркеру Y-хромосо-мы проводили с применением набора «Тест-SRY» (ООО «ТестГен», Россия). Набор содержал все необходимые для реакции буферы, ферменты, dNTP, специфические прай-меры и флуоресцентно-меченные зонды для локусов гена SRY. ПЦР-РВ проводили на
ПЦР-амплификаторах ДТ96 («ДНК-Технология», Россия) и CFX (Bio-Rad, США). Конечный объем реакционной смеси составлял 20 мкл. Протокол амплификации (в соответствии с инструкцией): 95 °С в течение 5 мин, затем 50 циклов 94 °С в течение 10 с и 62 °С в течение 50 с. Параллельно проводили амплификацию участка гена GAPDH с целью контроля выделения ДНК. Отрицательный и положительный контроль реакции ставили с использованием набора «Тест-SRY» (ООО «ТестГен», Россия).
По результатам исследования были определены: чувствительность, специфичность, диагностическая точность. Эти параметры были вычислены при сопоставлении результатов исследований со сведениями о ребенке, полученными после родов.
Результаты и обсуждение. Основное внимание в данной работе было уделено определению резус-фактора плода в связи с крайней актуальностью введения данного исследования в качестве диагностического инструмента в акушерскую практику. В исследование включены результаты за 2011-2014 гг. и первый квартал 2015 г. На рис. 1 представлено распределение проведенных исследований по срокам.
Рис. 1. Распределение по годам проведенных исследований по неинвазивному пренатальному установлению пола и резус-фактора плода
Из 138 образцов, проанализированных по резус-фактору плода, в 68 % случаев (94 обр.) был выявлен ген RHD и в 28 % (38 обр.) ген RHD не был выявлен; в 1 % случаев (2 обр.) был выявлен сомнительный результат анализа, что не позволило достоверно установить
резус-фактор плода; в 3 % случаев (4 обр.) анализ не удалось выполнить, о чем свидетельствовало отсутствие прохождения контрольной реакции гена GAPDH в нескольких повторах на одном и том же образце (рис. 2).
Не удалось установить резус фактор; 3%
Сомнительный результат; 1%
Установлен отрицательный резус-фактор -у плода; 28%
Установлен положительный резус-фактор у плода; 68%
Рис. 2. Распределение образцов проанализированной вкфДНК по резус-фактору плода
Из 35 образцов, проанализированных по полу плода, в 63 % (22 обр.) случаев был установлен женский пол плода и в 37 % (13 обр.) -мужской. Сомнительных и неинформативных образцов не было (рис. 3).
Все образцы, прошедшие анализ по идентификации пола и резус-фактора плода, были верифицированы по этим же характеристикам по факту рождения ребенка. Совпадения составили 100 % как по резус-фактору (среди установленных в ходе прове-
денного исследования резус-факторов), так и по полу.
По результатам проведенного исследования, тест-систем «Тест-ЖГ» и «Тест-RHD» имеют диагностическую точность 100 %. Чувствительность диагностической тест-системы «Тест-ЖГ» составила 100 %, а чувствительность «Тест-RHD» - 95,65 %. Ложнопо-ложительных и ложноотрицательных результатов не было выявлено (табл. 1).
Вынвлено мальчиков, 37%
Выявлено девочек, 63%
Рис. 4. Распределение образцов проанализированной вкфДНК по полу плода
Таблица 1
Общие аналитические характеристики использованных диагностических методик
«Тест-SRF» «Тест-RHD»
Диагностическая точность, % 100 100
Чувствительность, % 100 95,65
Специфичность, % 100 100
Полученные данные свидетельствуют о высокой точности и высокой чувствительности двух используемых методик неинвазив-ной идентификации пола и резус-фактора плода по крови беременной женщины на раннем сроке.
В России количество беременных с резус-сенсибилизацией не имеет тенденции к снижению. В год регистрируется около 270 тыс. беременных с отрицательным резус-фактором [5, 7]. Острая ситуация сформировала необходимость разработки стратегии мониторинга и профилактики резус-конфликта матери и ребенка. Основываясь на последних достижениях науки и на зарубежном опыте, необходимо включить в стратегию мониторинга и профилактики резус-конфликта матери и ребенка определение резус-фактора плода. При этом выбранные для диагностики методики должны иметь хорошие аналитические характеристики и отличаться высокими показателями чувствительности и специфичности.
При сравнении наших результатов с результатами аналогичных зарубежных исследований становится очевидным, что полученные данные весьма схожи. Так, в одном из самых ранних сообщений по данному направлению, в статье К. Finning et al., диагностическая точность методики составила 97 % [10]. В исследование были включены 137 беременных первым ребенком женщин, феталь-ную ДНК авторам исследования удалось достоверно проанализировать только на 11-й нед. беременности [9]. Также J.M. Minon et al. удалось добиться чувствительности методики 98,8 % [13]. В исследовании приняло участие
563 беременные женщины, и достоверные результаты были получены на сроке от 10-й нед. беременности [10]. Также диагностическая точность 95 % была получена С. GonzalezGonzalez et а1. на сроке 11-16 нед. беременности [9].
Во всех проанализированных исследованиях, а также по результатам проведенных анализов диагностическая точность, чувствительность и специфичность методики увеличивается с увеличением срока беременности. Это обусловливается увеличением количества генетического материала плода в кровотоке матери. По данным литературы, на сроке 9 нед. беременности лишь 1 % от всей свободно циркулирующей внеклеточной ДНК является фетальной, а на сроке 20 нед. - около 7 % [11, 13].
Для оценки качества выделения ДНК в использованные методики включена реакция на ген GAPDH, который конститутивно экс-прессируется на высоком уровне в большинстве клеток и считается геном «домашнего хозяйства» [14]. По этой причине GAPDH нередко используют в качестве контроля реакций для иммуноблоттинга и количественной ПЦР. В используемой методике данный ген также был выбран для контроля выделения ДНК в образце и минимизации ложноотрица-тельных результатов.
Важность определения резус-фактора плода очевидна. Всем резус-отрицательными женщинам на сроке 11-17 нед. беременности может быть проведен анализ определения резус-фактора плода, и лишь при получении положительного результата должно приниматься решение о выполнении анти^-имму-ноглобулиновой терапии. В Российской Фе-
дерации всем резус-отрицательным женщинам рекомендовано «слепое» введение анти-D-иммуноглобулина на сроке 28 и 34 нед. беременности [4]. Стоимость иммуноглобулина достаточно высока, некоторые производители получают его из препаратов донорской крови, что является небезопасным для женщин. Кроме того, сама процедура введения иммуноглобулина может сопровождаться нежелательными побочными эффектами: развитие реакции гиперчувствительности, анафилактический шок, артралгии и др. При внедрении пренатального определения резус-фактора плода можно добиться целенаправленной, обоснованной профилактики резус-конфликта, которая выполняется только в случаях беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом.
Проведенное исследование по определению пола плода на основании анализа вкфДНК, выделенной из материнской периферической плазмы, при помощи ПЦР в реальном времени продемонстрировало высокую точность и надежность уже с 9 нед. беременности.
Полученные данные соотносятся с данными в аналогичных работах. Расхождения могут быть связаны с различиями в способах выделения ДНК и с низкой концентрацией вкфДНК у некоторых беременных.
Наличие вкфДНК в плазме беременных женщин обозначило новый источник материала для пренатального определения пола. Метод установления пола плода по вкфДНК имеет высокий потенциал для широкого внедрения и использования в акушерской практике. Применяемые методики определения пола плода при риске развития заболеваний, сцепленных с полом, основываются на инва-зивном получении генетического материала плода для выполнения анализа и имеют значительные недостатки, несут высокие риски для здоровья матери и плода, кроме того, данный анализ не может быть выполнен до 11 нед. беременности. Следует отметить, что методика неинвазивного установления пола плода по вкфДНК имеет существенные преимущества и по сравнению с рутинным методом УЗИ-диагностики пола плода: специфичность и достоверность исследованной ме-
тодики значительно выше, и пол может быть определён уже на 7-8 нед. беременности, в то время как УЗИ может идентифицировать пол плода только после 11 нед., что связано с развитием и визуализацией наружных половых органов плода [15].
Заключение. Пренатальная диагностика резус-фактора плода у резус-отрицательных беременных на основе исследования вкфДНК, выделенной из материнской периферической плазмы, с последующей ПЦР-амплификацией в режиме реального времени является легким, простым и надежным методом с высокой чувствительностью и точностью уже на 10-й нед. беременности. Используя данные анализа, а также последующие клинические и лабораторные сведения о беременной, врач может принять решение о необходимости обоснованного введения профилактического анти-RhD-иммуноглобулина. Методика не-инвазивного определения пола ребенка на основе анализа вкфДНК, выделенной из периферической плазмы беременной, с последующей ПЦР в режиме реального времени также очень точна, надежна и возможна как для неклинического применения (в случае выполнения анализа в целях удовлетворения интереса родителей), так и для клинического (при необходимости выявления угрозы развития у плода заболеваний, сцепленных с полом).
1. Анализ показателей информативности наборов реагентов «ТЕСГ-SRY» и «ТЕСТ-КГО» при определении пола и резус-фактора плода / А. Н. Тороповский [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 10. - С. 1566-1571.
2. Гемолитическая болезнь плода у беременных с резус-сенсибилизацией. Диагностика. Лечение. Профилактика : методическое письмо Минздравсоцразвития России № 15-4/10/2-12699 от 16.12.2011.
3. Климов В. А. Резус-конфликт и беременность : монография / В. А. Климов, И. В. Чибисо-
ва, Л. И. Школа. - М. : ГЭОТАР-МЕД, 2008. -С. 11-18.
4. Малышева О. В. Неинвазивная пренаталь-ная диагностика. Проблемы, подходы и перспективы / О. В. Малышева, В. С. Баранов // Журн. акушерства и женских болезней. - 2012. - Т. LXI, № 3. - С. 83-93.
5. Сидельникова В. М. Привычная потеря беременности / В. М. Сидельникова. - М. : Триа-да-Х, 2005. - 308 с.
6. Современные методы диагностики и лечения гемолитической болезни плода и новорожденного при резус-сенсибилизации / Г. М. Савельева [и др.] // Российский вестн. акушера-гинеколога. - 2004. - № 4. - С. 5-6.
7. Суханова Л. П. Современные тенденции репродуктивного процесса и организации службы родовспоможения в России / Л. П. Суханова, М. С. Скляр, Г. Ю. Уткина // Здравоохранение Российской Федерации. - 2008. - № 5. - С. 37-42.
8. Яцык Г. В. Практическое руководство по неонатологии : практическое пособие / Г. В. Яцык. -Л. : Медицина, 2008. - С. 251-256.
9. Application of fetal DNA detection in maternal plasma: a prenatal diagnosis unit experience / C. Gonzalez-Gonzalez [et al.] // J. of Histochemistry & Cytochemistry. - 2011. - № 53. - P. 307-314.
10. Effect of high throughput RHD typing of
fetal DNA in maternal plasma on use of anti-RhD immunoglobulin in RhD negative pregnant women: prospective feasibility study / K. Finning [et al.] // BMJ. - 2008. - № 336. - P. 816-818.
11. Quantification of cell-free DNA in normal and complicated pregnancies: overcoming biological and technical issues / I. Manokhina [et al.] // PLoS One. - 2014. - № 9 (7). - e 101500.
12. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis / Y. M. D. Lo [et al.] // Am. J. of Humane Genetics. - 1998. - Vol. 62 (4). -P. 76183-.7R7o5.utine fetal RHD genotyping with maternal plasma: a four-year experience in Belgium / J. M. Mi-non [et al.] // Transfusion. - 2008. - № 48. -P. 373-381.
14. Sonographic fetal sex determination / M. Odeh [et al.] // Obstetrics & Gynecology Survey. - 2009. -№ 64. - P. 50-57.
15. Validation of reference genes for normalization gene expression in reverse transcription quantitative PCR in human normal thyroid and goiter tissue / R. Weber [et al.] // BioMed Research International. - 2014. - Vol. 2014:198582. - doi: 10.1155/2014/198582.
EXPERIENCE OF INTRODUCTION IN CLINICAL PRACTICE OF NON-INVASIVE PRENATAL METHODS DIAGNOSTICS OF FETAL GENDER AND RHESUS FACTOR STATUS AT EARLY STAGES OF GESTATION ON MATERNAL PERIPHERAL BLOOD
L.I. Trubnikovа1, A.N. Toropovskiy2, E.V. Jmirko2, A.G. Nikitin2, R.F. Burganova3, O.V. Lisova1
Ulyanovsk State University, 2LLC «TestGen», Ulyanovsk, Ulyanovsk Regional Clinical Hospital
This study was aimed at identifying the reliability, sensitivity and specificity of non-invasive diagnostic methods of sex determination and Rhesus factor fetus at an early stage of pregnancy, based on the analysis of fetal DNA in a pregnant woman's blood. This study includes the results of five years of experience implementing the scientific development of «TestGen» on the Ulyanovsk Regional Clinical Hospital. Just study involved 138 pregnant women, all patients were tested extracellular fetal DNA to identify gene RHD, all women do in this case is Rh-negative. 35 and women were analyzed to establish a non-invasive prenatal fetal sex. According to the results of the study, it was found that these techniques of prenatal diagnosis of sex and Rhesus factor fetus are easy, simple and reliable method with high sensitivity and specificity already in the 10th week of pregnancy.
Keywords: prenatal diagnosis, non-invasive diagnostics, molecular genetic diagnosis, Rh fetal sex of th.
