CC BY
61
№ 1 - 2010 г. 14.00.00 медицинские науки
УДК 616-006.04-085.849.12]:57.085.2
ОПЫТ СОЗДАНИЯ ТКАНЕВЫХ МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ БОР-НЕЙТРОНОЗАХВАТНОЙ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ
(ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)
11 2 Ю. В. Пахомова , В. В. Каныгин , С. М. Давыдова
]ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава»
(г. Новосибирск)
2 •,
ГУ «НИИ физиологии СО РАМН» (г. Новосибирск)
В статье рассматриваются модели (перевиваемые, индуцированные опухоли, экспериментальные модели, использующие опухоли человека и молекулярногенетические модели) для проведения бор-нейтронзахватной терапии злокачественных опухолей.
Ключевые слова: перевиваемые, индуцированные опухоли, экспериментальные модели, использующие опухоли человека, молекулярно-генетические модели
Пахомова Юлия Вячеславовна - доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава», телефон рабочий: (383) 225-39-78
Каныгин Владимир Владимирович - кандидат медицинских наук, ассистент кафедры нейрохирургии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава», телефон рабочий: (383) 229-28-84
Давыдова Светлана Михайловна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории нейрорегуляции ГУ «НИИ физиологии СО РАМН», контактный телефон: (383) 229-10-82
Известно, что при использовании бор-нейтронзахватной терапии (БНЗТ) нормальные клетки, окружающие опухоли, подвергаются воздействию тепловых нейтронов, приводящему к вызванному радиацией повреждению нормальной ткани. Повреждение здоровых клеток может произойти как из-за радикалов, генерированных излучением при БНЗТ, так и при прямом повреждении ДНК клетки нейтронным потоком. Концентрация препаратов бора 10В в здоровых клетках ниже, чем в опухолевых клетках. Поэтому, диапазон нейтронного излучения применительно к нормальным клеткам ниже, чем в опухолевых клетках. Следовательно, радикалы могут играть важную роль в
повреждении нейтронами здоровой ткани. Есть данные, что вызванные радиацией радикалы длительного действия (нескольких часов), могут играть более важную роль в индукции мутации, чем радикалы короткого действия [7]. Радикалы короткого действия вызывают повреждение клеток и их гибель, с другой стороны, радикалы длительного действия (не менее 20 часов) не вызывают повреждения самой клетки, но способны вызывать мутации гена [7]. В эксперименте в культуре ткани была использована аскорбиновая кислота, которую добавляли после воздействия нейтронов, что позволило снизить число мутаций в клетках [9].
В качестве экспериментальных моделей для оценки клеточных реакций в онкологии широко используют так называемые перевиваемые или постоянные клеточные линии, которые представляют собой клетки различных опухолевых и неопухолевых тканей человека, способные к росту и размножению in vitro. Процесс получения клеточных линий чрезвычайно сложен и длителен. Обычно выход культивированных in vitro опухолей человека в постоянные клеточные линии не превышает 1-2 %.
В дальнейшем осуществляется промывка с удалением нежизнеспособных клеток и пересев небольшого числа жизнеспособных клеток в новые емкости. В результате многократных пассажей получают клетки, адаптированные к росту в культуре, обладающие уникальными свойствами. Они требуют соблюдения определенных условий при культивировании и пересевах, а также особого температурного режима и газовой фазы (смеси кислорода и углекислого газа); для сохранения их подвергают криоконсервации в специальных жидких средах, охлаждая по определенной программе, после чего хранят в специальных сосудах с жидким азотом. Периодически культуры клеток размораживают, «разгоняют» (пересеивают 3-4 пассажа в благоприятных условиях) либо используют для исследований, затем их можно повторно замораживать. Трудности получения культур клеток обусловлены неспособностью многих клеток к росту вне организма, сложностью подбора оптимальных питательных сред и ростовых факторов, гормонов и другими причинами.
Так, клеточные линии используют в качестве экспериментальных моделей для изучения закономерностей опухолевого роста, межклеточных взаимодействий, морфологических и других особенностей клеток различных опухолей, влияния препаратов химического и биологического происхождения на опухолевые и нормальные клетки. Эти исследования осуществляют с применением современных методов культивирования, клонирования клеток и их трансдукции разными генами, а также иммунологических, вирусологических, биохимических, морфологических и цитогенетических методов. Благодаря наличию этих клеточных моделей осуществляется создание и тестирование активности новых противоопухолевых средств, антиангиогенных, иммуномодулирующих и противовирусных препаратов, а также проводится определение токсикологических свойств солей металлов и других химических соединений, с которыми человек сталкивается на работе и в быту.
Остановимся подробно на вариантах экспериментальных моделей опухолей для БНЗТ. Современный арсенал моделей экспериментальной онкологии включает спонтанные, перевиваемые и индуцированные опухоли животных; опухоли человека, перевитые иммунодефицитным животным; культуры опухолевых клеток человека и животных; молекулярно-генетические модели, что позволяет изучать особенности различных опухолей, закономерности их возникновения и роста, механизмов их метастазирования и т. д. Наиболее часто в этих целях используют перевиваемые опухоли, культуры клеток и молекулярно-генетические модели, процесс получения которых трудоемок и длителен [8].
Перевиваемые опухоли. Создание инбредных линий позволило ввести в арсенал моделей экспериментальной онкологии перевиваемые опухоли. Онкологам-экспериментаторам уже не надо было дожидаться появления спонтанных опухолей. При прививке они могли получить достаточное для исследований количество опухолей [3]. Это делало возможным постановку эксперимента с большим числом сравниваемых групп животных. Трансплантация опухоли с одной особи на другие в пределах одной линии мышей всегда успешна. Любую спонтанно возникшую или индуцированную опухоль можно превратить в перевиваемый штамм, т. е. опухоль, сохраняющую свои свойства при последующих перевивках. Штамм можно подвергнуть замораживанию с применением криопротекторов и хранить в таком состоянии в контейнере с жидким азотом сколь угодно долго. В случае надобности штамм размораживают и трансплантируют животным. В онкологических центрах и лабораториях существуют банки, где хранятся сотни перевиваемых штаммов опухолей. С использованием перевиваемых опухолей инбредных мышей получаются более воспроизводимые и статистически достоверные результаты, причем на меньшем числе животных. Все это делает перевиваемые опухоли незаменимой моделью для исследований в области экспериментальной терапии. Как правило, неизвестный препарат испытывают на нескольких штаммах, причем в этот список непременно включают метастазирующие штаммы опухолей, а также штаммы, обладающие лекарственной устойчивостью. Все химиопрепараты, применяющиеся в онкологической клинике в настоящее время, непременно проявили противоопухолевую активность на какой-нибудь перевиваемой опухоли животных. Наряду с явными преимуществами перевиваемые опухоли как модели имеют один существенный недостаток. Дело в том, что при прививке опухоль переносится в организм здорового животного. По отношению к онкологическим заболеваниям человека это искусственная ситуация. Более адекватными в этом смысле моделями являются спонтанные и индуцированные опухоли, так как в этих случаях опухоль возникает из клеток организма, подвергшихся злокачественной трансформации [2]. Получение перевиваемых опухолей заключается в трансплантации спонтанной или индуцированной опухоли подопытным животным (мышам, крысам, кроликам, собакам [5, 6] с последующими многократными пассажами клеток опухоли от одного животного к другому [1].
Индуцированные опухоли. При исследовании индуцированных канцерогенными веществами опухолей были получены факты, необходимые для понимания сущности процесса злокачественного роста.Опухоли могут быть индуцированы у животных также онкогенными вирусами. Первым вирусом, для которого доказана роль в возникновении опухолей, был открытый в 1910 году П. Раусом из Рокфеллеровского университета США вирус саркомы кур.
В отличие от животных, у которых открыты десятки опухолеродных вирусов, лишь для относительно небольшого числа опухолей человека доказана роль вирусов в их возникновении. Модели индуцированных вирусами опухолей животных, а также модели злокачественно трансформированных под влиянием вирусов клеток, культивируемых в условиях in vitro, позволили не только раскрыть многие тайны вирусного канцерогенеза, но и создать общую концепцию молекулярных механизмов возникновения опухолей.
Опухоли могут быть индуцированы также различными видами облучения. У людей, подвергшихся действию ионизирующей радиации, возникают опухоли кроветворной ткани, костей, легких, печени, щитовидной железы и других органов. В экспериментах на животных при воздействии облучения возникают опухоли такого же широкого спектра. Нарушения баланса гормонов могут играть одну из главных ролей в патогенезе злокачественных опухолей. Моделями исследования этого процесса служат
опухоли животных, образующиеся вследствие введения гормонов или наоборот удаления желез внутренней секреции (гипофиза, яичников) [2].
Экспериментальные модели, использующие опухоли человека. Исследования опухолей животных, спонтанных, индуцированных и перевиваемых, показали, что полной корреляции между экспериментальными и клиническими данными нет и, следовательно, прямой перенос результатов в клинику опухолей человека невозможен. Последнее касается, прежде всего, отбора противоопухолевых препаратов. Это заставляло онкологов искать подходы к использованию опухолей человека в экспериментальных моделях. Различные опухоли человека можно выращивать на питательных средах. В этом обзоре нет возможности рассмотреть все разнообразие культуральных моделей. Назову лишь самые распространенные из них: органные, тканевые и клеточные культуры, культуры в агаре.
Многие фундаментальные проблемы онкологии решены с использованием культуры опухолевых клеток. С практической точки зрения, важным является применение культуры клеток опухолей человека для отбора противоопухолевых препаратов, установления индивидуальной чувствительности опухоли к химиопрепаратам, а также для испытания генотоксических свойств веществ. В этой модели самым привлекательным является то, что экспериментатор имеет дело с опухолями человека. Однако они находятся вне организма, в искусственных условиях. Это главный недостаток данной модели. Тем не менее, на ней можно испытывать препараты, оказывающие токсический эффект на клетки, хотя при этом об избирательности их действия на опухолевые клетки судить невозможно. Для тестирования препаратов, обладающих опосредованным эффектом на опухоли, эта модель не годится. Также непригодна она и для исследования веществ, подвергающихся в организме метаболической активации. Поэтому исследователи прилагали усилия для получения модели, позволяющей опухолям человека расти в организме животных. С этой целью используют гетеротрансплантацию опухолей человека. Для того чтобы опухоли человека развивались в организме животных, необходимо преодолеть или обойти барьер тканевой несовместимости между опухолью и реципиентом. Для этого опухоли человека трансплантируют в так называемые привилегированные органы. В этих органах на чужеродные трансплантаты (гетеротрансплантаты) иммунные реакции не развиваются. К таким органам относятся передняя камера глаза, мозг, семенники, защечные мешки у хомячков. При прививке опухоли в эти органы можно работать только с опухолями маленьких размеров. Как только опухоль прорастает окружающие ткани, привилегированность данного района отменяется, и опухоль отторгается.
Гетеротрансплантацию опухолей человека можно производить также на развивающийся куриный эмбрион. И в этом случае недостатки модели те же. В связи с этим подобные трансплантации широкого применения в экспериментальной онкологии не нашли. Более адекватной является трансплантация человеческих опухолей животным в диффузионных камерах. Кусочки опухоли помещают в миллипоровую камеру, размер пор которой предотвращает проникновение в нее клеток иммунной системы. На этой модели можно отбирать противоопухолевые препараты, требующие активации в организме. Однако исследования с использованием диффузионных камер весьма трудоемки. Кроме того, при этом есть трудности в оценке противоопухолевого эффекта. Это является серьезным препятствием для применения модели, в частности для установления индивидуальной чувствительности опухоли к химиопрепаратам.
Наиболее пригодной для трансплантации опухолей человека являются созданные недавно мыши SCIDШu. Это мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом,
которым в раннем возрасте трансплантированы кусочки тимуса и печени человека. Метаболические процессы у этих мышей максимально приближены к человеческим. Такие животные с трансплантированными им опухолями человека используются в настоящее время в различных онкологических экспериментах [2].
Молекулярно-генетические модели. С развитием молекулярной биологии в онкологию пришли новые модели, и возник самостоятельный раздел молекулярной онкологии. Появилась возможность исследования механизмов злокачественной трансформации на молекулярном уровне. Интересующий экспериментатора ген может быть выделен из генома, клонирован (то есть получено много его копий), и расшифрована его структура. Кроме того, ген может быть перенесен в геном другого животного, которое будет называться трансгенным. В настоящее время получены трансгенные мыши, представляющие собой ценную и перспективную модель для изучения различных аспектов злокачественного превращения клеток. Манипулирование с генами позволяет также осуществить выбивание (нокаут) определенного гена. Так получают «нокаутированных» мышей. На модели трансгенных и «нокаутированных» мышей показано, что развитие опухоли может быть результатом мутации в генах, играющих ключевую роль в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток. Необходимые для изучения гены могут быть внесены в клетки, растущие в культуре ткани. Такие клетки называются трансфецированными. В последнее время они активно используются в онкологии [2].
Особенностью реакции нейтронного захвата 10В(п,а) и 7Li является образование высокоэнергетической а-частицы (4He), отличающейся высокой величиной пробега в ткани (порядка 5-9 мкм), сопоставимой с размером клеточного ядра. Все это и создает условия для повреждения лишь непосредственно в зоне локализации атома бора. Таким образом, селективная доставка атомов бора 10B к опухоли позволяет после воздействия тепловыми нейтронами рассчитывать на локальное повреждение только самой мишени [4]. Основная доза излучения, поражающая опухолевые ткани, формируется непосредственно в самой опухоли в результате вторичного излучения, которое возникает в результате поглощения тепловых нейтронов ядрами некоторых элементов (наиболее часто используют изотопы бора 10B и реже 157Gd), входящих в состав специальных препаратов [5].
Таким образом, при использовании БНЗТ здоровые клетки, окружающие опухоль, подвергаются воздействию тепловых нейтронов, приводящему к их повреждению как из-за радикалов, генерированных излучением при БНЗТ, так и при прямом повреждении ДНК клетки нейтронным потоком.
Список литературы
1. Гончарук Е. И. Применение карбоцианиновых флуоресцентных зондов для оценки функционального состояния культивированных клеток после криоконсервирования / Е. И. Гончарук [и др.] // Biopolymers and cell. - 2008. - Т. 24, № 3. -С.225-230.
2. Попова Н. А. Модели экспериментальной онкологии / Н. А. Попова //
Соросовский образовательный журнал. -
(http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/1014.html)
3. Ситдикова С. М. Специфичность рецидивирования и метастазирования экспериментальных перевиваемых опухолей карциномы Эрлиха и меланомы В16 / С. М. Ситдикова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 143, № 1. - С. 86-88.
4. Хмелевский Е. В. - М. : Российский научный центр рентгенорадиологии Росмедтехнологий. - (http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v7/papers/khmelevsky_v7.htm)
5. Dagrosa M. Biodistribution of p-borophenylalanine (BPA) in dogs with spontaneous undifferentiated thyroid carcinoma / М. Dagrosa [et al.] // Neutron capture therapy of epidermal growth factor (+) gliomas using boronated cetuximab (IMC-C225) as a delivery agent : Topics in neutron Capture therapy: Proceedings of the Eleventh World Congress on Neutron Capture Therapy. - 2004. - Vol. 61, N 5. - P. 911-917.
6. French J. L. Bayesian Methods for a Three-State Model for Rodent Carcinogenicity Studies / J. L. French, J. G. Ibrahim // Biometrics. - 2002. - Vol. 58, N 4. - Р. 906-916.
7. Koyama S. Radiation-induced long-lived radicals which cause mutation and transformation / S. Koyama [et al.] // Mutat. Res. - 1998. - Vol. 421. - P. 45-54.
8. Miyata S. Biodistribution and Imaging studies on F98 rat glioma by convection enhanced delivery of transferrin targeting PEG liposomes encapsulating both BSH and iodine contrast agent / S. Miyata [et al.] // A new option against cance : 13th International Congress on Neutron Capture Therapy. - Florence, 2008. - Р. 303-306.
9. Ueno A. Ascorbate, added after irradiation, reduces the mutant yield and alters the spectrum of CD59-mutations in A(L) cells irradiated with high LET carbon ions / А. Ueno [et al.] // J. Radiat. Res. (Tokyo). - 2002. - Vol. 43 (Suppl.). - Р. 245-S249.
TISSUE MODELS CREATION EXPERIENCE FOR MALIGNANT TUMORS BOR-NEUTRON-CAPTURE TERAPY CONDUCT (LITERATURE
PREVIEW)
11 2 J. V. Pakhomova , V.V. Kanygin , S.M. Davydova
1SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Rushealth»
(c. Novosibirsk)
2SG «NRI of physiology SD RAMS» (c. Novosibirsk)
Such models as: re-inoculated and inducted tumors, experimental models with human tumors and molecular-genetic models' use; for malignant tumors bor-neutron capture therapy conduct, are viewed in the article.
Keywords: re-inoculated inducted tumors experimental models, human tumors use, molecular-genetic models
About authors:
Pakhomova Julia Viacheslavovna - doctor of medical sciences, professor of pathological physiology department and clinical pathophysiology SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Rushealth » , office telephone: (383)225-39-78
Kanygin Vladimir Vladimirovich - medical sciences candidate, neurosurgery department assistant SEI HPE «Novosibirsk State Medical University Rushealth» office telephone: (383)229-28-84
Davydova Svetlana Mikhailovna - biological sciences candidate, neuroregulation laboratory scientific collaborator SG «NRI of physiology SD RAMS», contact telephone: (383)229-10-82
List of the Literature:
1. Goncharuk E.I. Carbon-cyanic fluorescent probes' usage for post-crio-preservation of cultivated cells functional state evaluation / E.I. Goncharuk [et.al.] // Biopolymers and cell. - 2008. - T. 24, № 3. - C. 225-230.
2. Popova N.A. Experimental oncology models / N.A. Popova // Sorosovskiy educational journal. (http://www.pereplet.ru/obrazovanie/stsoros/1014.html)
3. Sitdikova S.M. Re-inoculated Erlikh carcinomas and B16 melanomas relapse and metastasis specification / S.M. Sitdikova [et.al.] // Experimental biology and science bulletin. - 2007. - T. 143, № 1. - C. 86-88.
4. Khmelevskiy E.V. - M.: Russian scientific centre of roentgen-radiology of Russian medical technology. (http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v7/papers/khmelevsky_v7.htm)
5. Dagrosa M. Biodistribution of p-borophenylalanine (BPA) in dogs with spontaneous undifferentiated thyroid carcinoma / M. Dagrosa [et al.] // Neutron capture therapy of epidermal growth factor (+) gliomas using boronated cetuximab (IMC-C225) as a delivery agent : Topics in neutron Capture therapy: Proceedings of the Eleventh World Congress on Neutron Capture Therapy. - 2004. - Vol. 61, N 5. - P. 911-917.
6. French J. L. Bayesian Methods for a Three-State Model for Rodent Carcinogenicity Studies / J. L. French, J. G. Ibrahim // Biometrics. - 2002. - Vol. 58, N 4. - P. 906-916.
7. 7. Koyama S. Radiation-induced long-lived radicals which cause mutation and transformation / S. Koyama [et al.] // Mutat. Res. - 1998. - Vol. 421. - P. 45-54.
8. Miyata S. Biodistribution and Imaging studies on F98 rat glioma by convection enhanced delivery of transferrin targeting PEG liposomes encapsulating both BSH and iodine contrast agent / S. Miyata [et al.] // A new option against cance : 13th International Congress on Neutron Capture Therapy. - Florence, 2008. - P. 303-306.
9. Ueno A. Ascorbate, added after irradiation, reduces the mutant yield and alters the spectrum of CD59-mutations in A(L) cells irradiated with high LET carbon ions / A. Ueno [et al.] // J. Radiat. Res. (Tokyo). - 2002. - Vol. 43 (Suppl.). - P. 245-S249.
