CC BY
36
2023;20(1):152-159
Проблемы здоровья и экологии / Health and Ecology Issues
УДК 575.113.12:579.238]:57.088.7 https://doi.org/10.51523/2708-6011.2023-20-1-19
Опыт проведения секвенирования генома Klebsiella pneumoniae с использованием метода коротких прочтений на платформе Illumina
А. С. Шафорост1, А. А. Зятьков1, Е. В. Воропаев1, О. В. Осипкина1, А. В. Воропаева2, Н. А. Бонда3, И. О. Стома1
1Гомельский государственный медицинский университет, г. Гомель, Беларусь Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека, г. Гомель, Беларусь 3Гомельский областной центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья, г. Гомель, Беларусь
Цель исследования. Рассмотреть основные этапы секвенирования генома Klebsiella pneumoniae с использованием метода коротких прочтений на платформе Illumina и описать особенности процесса пробоподготовки библиотек и анализа полученных данных.
Материалы и методы. Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) для высокопроизводительного секвенирования выделяли из культур Klebsiella pneumoniae. Пробоподготовку выполняли согласно инструкции производителя к набору Nextera XT DNA Library Prep. Секвенирование проводили на платформе Illumina MiSeq с использованием картриджа 2х151. Сборку генома до уровня контигов производили с помощью приложения SPAdes Genome Assembler на сервисе Illumina BaseSpace Sequence Hub и набора программ в среде Linux. Оценку качества сборки генома проводили с помощью сервиса QUAST.
Результаты. Проведено секвенирование генома образцов культур K. pneumoniae с последующей оценкой качества запуска, сборкой генома и определением его основных параметров.
Заключение. Рассмотрены основные этапы секвенирования генома K. pneumoniae с использованием метода коротких прочтений на платформе Illumina. Отмечены основные параметры оценки качества пробоподготовки, запуска и сборки генома.
Ключевые слова: высокопроизводительное секвенирование, Illumina, сборка генома, прокариоты Вклад авторов. Шафорост А.С., Зятьков А.А.: проведение исследования, анализ и обработка результатов; Воропаев Е.В.: аналитическая оценка содержания исследования; Осипкина О.В., Воропаева А.В.: подготовка статьи к публикации; Бонда Н.А.: сбор и подготовка материала; Стома И.О.: концепция и организация исследования. Благодарность. Авторы выражают благодарность заведующему лабораторией «Центр аналитических и генно-инженерных исследований» ГНУ «Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси», к.м.н., доценту Валентовичу Л.Н. за помощь и консультирование в процессе сборки генома и при проведении анализа его результатов.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Источники финансирования. При проведении исследования стороннее финансирование и спонсорская поддержка не осуществлялись.
Для цитирования: Шафорост АС, Зятьков АА, Воропаев ЕВ, Осипкина ОВ, Воропаева АВ, Бонда НА, Стома ИО. Опыт проведения секвенирования генома Klebsiella pneumoniae с использованием метода коротких прочтений на платформе Illumina. Проблемы здоровья и экологии. 2023;20(1):152-159. DOI: https://doi. org/10.51523/2708-6011.2023-20-1-19
Experience of Klebsiella pneumoniae genome sequencing using the short read method on the Illumina platform
Alexander S. Shaforost1, Alexey A. Ziatskov1, Evgenii V. Voropaev1, Olga V. Osipkina1, Alla V. Voropaeva2, Nadezhda A. Bonda3, Igor O. Stoma1
Abstract
Objective. To review the main stages of Klebsiella pneumoniae genome sequencing using the Illumina short-read method and describe the peculiarities of sample library preparation and analysis of the obtained data.
© А. С. Шафорост, А. А. Зятьков, Е. В. Воропаев, О. В. Осипкина, А. В. Воропаева, Н. А. Бонда, И. О. Стома, 2023
Резюме
1Gomel State Medical University, Gomel, Belarus 2Republican scientific and practical center for radiation medicine and human ecology, Gomel, Belarus 3Gomel Regional Center for Hygiene, Epidemiology and Public Health, Gomel, Belarus
Проблемы здоровья и экологии / Health and Ecology Issues 2023;20(1):152-159
Materials and methods. Deoxyribonucleic acid (DNA) for high-throughput sequencing was isolated from Klebsiella pneumoniae cultures. Sample preparation was performed according to the manufacturer's instructions for the Nextera XT DNA Library Prep kit. Sequencing was performed on an Illumina MiSeq platform using a 2x151 cartridge. Genome assembly to the contigs was performed using the SPAdes Genome Assembler application on the Illumina BaseSpace Sequence Hub service and a set of programs in a Linux environment. The quality of genome assembly was assessed using the QUAST service.
Results. Genome sequencing of K. pneumoniae culture samples was performed, followed by an evaluation of the quality of the launch, assembly of the genome, and determination of its main parameters.
Conclusion. The main steps of K. pneumoniae genome sequencing have been considered using the short-read method on the Illumina platform. The main parameters for assessing the quality of sample preparation, launch and genome assembly are described.
Keywords: high throughput sequencing, Illumina, genome assembly, prokaryotes
Author contributions. Shaforost A.S., Ziatskov A.A.: research, analysis and processing of results; Voropaev E.V.: analytical evaluation of the content of the study; Osipkina O.V., Voropaeva A.V.: preparation of the article for publication; Bonda N.A.: collection and preparation of material; Stoma I.O.: concept and organization of the study. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Funding. The study did not receive any external funding or sponsorship.
For citation: Shaforost AS, Ziatskov AA, Voropaev EV, Osipkina OV, Voropaeva AV, Bonda NA, Stoma IO. Experience of Klebsiella pneumoniae genome sequencing using the short reads method on the Illumina platform. Health and Ecology Issues. 2023;20(1):152-159. DOI: https://doi.org/10.51523/2708-6011.2023-20-1-19
Введение
На современном этапе развития медицины появился ряд технических решений, которые значительно повышают качество диагностики различных, в том числе и инфекционных, заболеваний и способствуют разработке эффективных методов их лечения [1]. Было предложено множество инноваций как в области диагностики, так и в терапевтической сфере [1]. Для решения сложных и трудоемких задач молекулярной биологии микроорганизмов у современного исследователя в настоящее время имеются различные диагностические инструменты, из которых наиболее известны и часто используются различные модификации секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК [1].
Классическое, или секвенирование ДНК первого поколения по методу Сенгера, получило мировое признание научного сообщества, выразившееся в получении его автором — Фредериком Сенгером — Нобелевской премии по химии в 1980 г. [1].
Технологии секвенирования следующего поколения являются наиболее эффективным и современным методом исследования генетических особенностей различных организмов. Наиболее распространенными являются решения, предлагаемые компаниями Illumina (MiniSeq, MiSeq, HiSeq и др.) и Thermo Fisher Scientific (Ion GeneStudio S5) [2]. Получаемые данные применяются для улучшения диагностики социально значимых заболеваний и разработки персонализированной терапии благодаря применению
широкого спектра панелей, позволяющих определять наличие точечных мутаций и предрасположенности к развитию отдельных патологий (онкологических, неврологических, сердечно-сосудистых, респираторных и др.), а также для идентификации и классификации онкологических заболеваний, определения антибиотикоре-зистентности микроорганизмов и др. [3].
Для исследования микробных сообществ, секвенирования геномов вирусов и прокариот de novo наиболее предпочтительным является технология компании Illumina (секвенатор MiSeq), сочетающая в себе достаточную для секвенирования таксономически значимых локусов метагеномной ДНК длину прочтения (до 2x301 нуклеотидов), что имеет решающее значение для сборки участков генома с повторяющимися последовательностями (гомополимерами), высокую пропускную способность и относительно низкую стоимость секвенирования [4].
Цель исследования
Рассмотреть основные этапы секвенирования генома Klebsiella pneumoniae с использованием метода коротких прочтений на платформе Illumina и описать особенности процесса пробо-подготовки библиотек и анализа полученных данных.
Материалы и методы
Пробоподготовку образцов ДНК, выделенной из культур Klebsiella pneumoniae, для высокопроизводительного секвенирования на платформе
Проблемы здоровья и экологии / Health and Ecology Issues
2023;20(1):152-159
Illumina MiSeq проводили с использованием набора Nextera XT DNA Library Prep. Сборку генома до уровня контигов выполняли с помощью приложения SPAdes Genome Assembler на сервисе Illumina BaseSpace Sequence Hub и набора программ в среде Linux с последующей оценкой качества сборки генома с помощью приложения QUAST.
Результаты и обсуждение
Получение качественных выходных данных высокопроизводительного секвенирования напрямую зависит от корректности выполнения отдельных этапов (экстракции ДНК, получении геномных библиотек и их пулирование, настройки запуска) и выбора метода обработки получаемой информации.
Для получения максимального количества ДНК из культур K. pneumoniae использовали набор PureLink™ PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, США), возможно применение аналогичных наборов, способных разрушать клеточную стенку грамотрицательных микроорганизмов с последующим выделением нуклеиновой кислоты.
Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 1000. Для дальнейшего
анализа использовали образцы с соотношением экстинкции А260/280 > 1,8, если образцы имели загрязнение, требовалась дополнительная их очистка этанолом с дальнейшим измерением количества и качества ДНК.
С помощью набора Nextera XT DNA Library Prep, проводили пробоподготовку для полногеномного секвенирования, которая включала в себя следующие стадии: ферментативную фрагментацию геномной ДНК, штрихкодирование образцов и их очистку с использованием магнитных частиц.
Для ферментативной фрагментации проводили разведение образцов ДНК до 0,2 нг/мкл, измерение концентрации геномной ДНК выполняли на флуориметре Qubit4 (Thermo Fisher Scientific, Германия) с помощью набора Qubit™ 1х dsDNA High Sensitivity Assay Kit (1х dsDNA HS).
Для оценки эффективности фрагментации, качества полученных библиотек можно использовать электрофоретическое разделение в ага-розном геле или капиллярный электрофорез (рисунок 1) и измерение концентрации библиотек на флуориметре Qubit4 (набор 1х dsDNA HS).
Рисунок 1. Электрофореграмма геномных библиотек K. pneumoniae после индексной ПЦР: а — 1,7 % агарозный гель (маркер — GeneRuler 50 bp DNA Ladder SM0371 (ThermoFisher Scientific, США)); б — результат капиллярного электрофореза (набор Perkin Elmer The LabChip® NGS 3K) Figure 1. Electrophoregram of K.pneumoniae genomic libraries after index PCR: a — 1.7 % agarose gel (marker — GeneRuler 50 bp DNA Ladder SM0371 (ThermoFisher Scientific, USA)); b — results of capillary electrophoresis (Perkin Elmer The LabChip® NGS 3K set)
Размер полученных библиотек для геномного секвенирования находился в интервале от 250 до 1500 п. н., что соответствует инструкции к набору Nextera XT DNA Library Prep.
Измеряли концентрацию (нг/мкл) очищенных библиотек с помощью флуориметра Qubit 4 (набор 1х dsDNA HS) или амплификатора «в реальном времени» методом измерения флу-
оресценции по конечной точке с применением интеркалирующего красителя 2х Zubr Green-1 («ПраймТех», Республика Беларусь) (таблица 1). При использовании последнего метода необходимо предварительное приготовление стандартов с последующим построением калибровочной кривой.
Проблемы здоровья и экологии / Health and Ecology Issues 2023;20(1):152-159
Таблица 1. Концентрация геномных библиотек ДНК при измерении с помощью флуориметра Qubit 4 и методом измерения флуоресценции по конечной точке
Table 1. Concentration of genomic DNA libraries when measured with the Qubit 4 fluorometer and the endpoint fluorescence measurement method
Номер образца Концентрация «4 нM» библиотек (Qubit 4), нг/мкл Концентрация «4 нM» библиотек (по конечной точке), нг/мкл
329 1,62 1,14
366 1,69 1,20
476 1,48 1,06
1271 1,62 1,15
Отмеченные отличия в величине концентрации библиотек, полученные с помощью различных методов, можно интерпретировать различной химической структурой используемых интеркали-рующих красителей или погрешностями измерений. Определение концентрации библиотек является критически важным показателем, влияющим на количество генерируемых в процессе запуска кластеров и в конечном итоге — на объем получаемой по результатам секвенирования информации.
Завышенная концентрация объединенной геномной библиотеки может привести к перекластеризации и стать причиной снижения производительности выполнения анализа и показателя Q30 (доля нуклеотидов, идентифицированных с точностью 99,9 %), появлению артефактов секвенирования, снижению общего объема выходных данных и даже к досрочному прерыванию запуска. Уменьшение количества получаемых данных может происходить и при недокластериза-ции (недозагрузке) проточной ячейки [5, 6].
Для полногеномного секвенирования с использованием реагентов версии v2 оптимальным считается количество «сырых кластеров» (до прохождения фильтра качества) в диапазоне 1000-1200 кластеров на 1 мм2 [6]. Согласно рекомендациям компании Illumina для секвенатора MiSeq загрузочная концентрация объединенной геномной библиотеки составляет 6-20 пМ [7]. Контролем качества для генерации кластеров, секвенирования и выравнивания прочтений, а также генерации матрицы перекрестных помех является примесь ДНК вируса ФХ174 (PhiX). Минимальное содержание PhiX в объединенной геномной библиотеке для секвенатора MiSeq составляет 5 % [8]. Это значение во многом определяется разнообразием последовательностей нуклеотидов в образце: чем оно ниже, тем доля PhiX должна быть выше.
Первоначальная обработка данных, полученных в результате анализа коротких фрагментов, осуществляется в автоматическом режиме с
помощью встроенного программного обеспечения Illumina MiSeq с предоставлением выходных данных в виде 2 файлов, содержащих последовательности для прямого и обратного прочтения в формате FASTQ.
Перед сборкой генома необходимо провести оценку качества полученных данных. Для этого использовали программу FastQC [9]. Одной из значимых метрик является «Per base sequence quality», которая отражает изменение качества прочтения нуклеотидов в процессе секвенирова-ния. Как правило, отмечается его снижение в начале и в конце прочтения. На основании анализа этого параметра принимается решение об удалении начальных или конечных нуклеотидов с качеством менее Q30. Метрика «Sequence Length Distribution» отображает распределение прочтений по длине и позволяет получить информацию о доле прочтений требуемого размера (в нашем случае — 151 нуклеотид) и необходимости фильтрации прочтений.
Полученные данные были использованы для сборки генома до уровня контигов с применением приложения SPAdes Genome Assembler (инструмент с открытым исходным кодом для секвенирования de novo) на сервисе Illumina BaseSpace Sequence Hub [10] или набора программ в среде Linux. Сборку генома можно проводить, используя аналоги данных приложений [11].
При выполнении сборки генома в среде Linux для предварительной обработки (удаление прочтений с длиной, меньше заданной, последовательностей адаптеров и нуклеотидов с низким качеством) исходных данных секвенирования, полученных на платформе Illumina, использовали java программу Trimmomatic 0.39 в режиме PE (парноконцевых прочтений) [12].
Пример кода в терминале выглядит следующим образом:
java -jar trimmomatic-0.39.jar PE 329_R1_se-quence.fastq 329_R2_sequence.fastq 329_forward_ paired.fastq 329_forward_unpaired.fastq 329_re-verse_paired.fastq 329_reverse_unpaired.fastq
Проблемы здоровья и экологии / Health and Ecology Issues
2023;20(1):152-159
ILLUMINACLIP:/usr/share/trimmomatic/ NexteraPE-PE.fa:2:40:15 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
Первая часть позволяет запустить пакет Trimmomatic в режиме работы с парноконцевы-ми прочтениями и из исходных данных, полученных во время прямого (R1) и обратного (R2) чтения библиотек, получить 4 файла в формате FASTQ: 2 — для «парных» выходных данных и 2 — для соответствующих «непарных» выходных данных. Опция ILLUMINACLIP позволяет удалить последовательности адаптеров из прочтений, выбрав соответствующий файл с адаптерными последовательностями (например, NexteraPE-PE. fa), удалить начальные (LEADING) и конечные (TRAILING) нуклеотиды с качеством ниже Q3 (для удаления нуклеотидов, идентифицированных с точностью менее 50,12 %) при сканировании последовательности с помощью скользящего окна (SLIDINGWINDOW) шириной в 4 нуклеотида, обрезая, когда среднее качество падает ниже Q15 (для удаления нуклеотидов, идентифицированных с точностью менее 96,84 %), и удаляя прочтения короче 36 нуклеотидов (MINLEN).
Собственно сборка генома до набора контигов производится с помощью пакета SPAdes-3.15.5. Согласно литературным данным, он является одним из лучших решений для сборки малых геномов [13, 14].
Пример кода в терминале выглядит следующим образом:
./spades.py --threads 8 --careful \
--pe1-1 /home/user/329_forward_paired.fastq \
--pe1-2 /home/user/329_reverse_paired.fastq \
--pe1-s /home/user/329_forward_unpaired. fastq \
--pe1-s /home/user/329_reverse_unpaired. fastq \
-o /home/user/329spades
Программа выполняет сборку генома в «аккуратном» режиме (--careful), используя одновременно 8 потоков, и формирует набор контигов и скэффолдов на базе k-меров различного размера. В итоге программа выбирает наилучший результат и сохраняет его в выходной директории (-o /home/user/329spades).
Для обнаружения смежных контигов и расчета величины покрытия и ожидаемого размера генома при заданном размере k-мера (-k 127) используется пакет combinator-FQ [15].
Пример кода в терминале выглядит следующим образом:
./combinator-FQ.py contigs.fasta -k 127 (-o / home/user/combinator-FQ_report
В качестве входных данных используется набор контигов, полученный на предыдущем этапе, а на выходе получаем таблицу в формате tsv с указанием совместимых концов контигов и отчет следующего вида: === Summary === 290 contigs were processed. Sum of contig lengths: 5699908 bp Expected length of the genome: 6059787 bp Min coverage: 0.727723 Max coverage: 725.0 Mean coverage: 66.04 Median coverage: 34.43 LQ-coefficient: 48.3
Оценку качества сборки генома можно проводить с помощью сервиса QUAST (Quality Assessment Tool for Genome Assemblies) посредством анализа рассчитываемых им показателей (рисунок 2) [16].
QUAST работает как с эталонными геномами, так и без них. Инструмент принимает несколько сборок, поэтому подходит для их сравнения.
Для предварительной оценки качества сборки генома использовали следующие параметры: общее количество контигов, N50 и L50 (в некоторых случаях данные параметры могут быть неинформативными).
Общее количество контигов (рисунок 2а) и их распределение по длине (рисунок 2а и 2б) позволяют получить информацию об уровне фрагментации собранного генома. Чем меньше значение данного показателя, тем выше качество сборки. Параметр N50 характеризует качество сборки с точки зрения ее непрерывности и равен по значению длине самого короткого контига при суммировании длин минимального числа контигов (L50) для получения суммы, большей или равной половине длины сборки генома.
Использованные настройки Trimmonatic и SPAdes на платформе Linux позволили получить сборку генома с большей величиной N50 и меньшим количеством контигов для покрытия 50 % генома (L50) по сравнению с приложением SPAdes Genome Assembler (рисунок 2а и 2б). Однако оба варианта показывают сходные результаты при сравнении полученных с их помощью сборок генома на веб-ресурсах, позволяющих проводить анализ антибиотикорезистентности, что дает возможность выбора методики сборки генома на усмотрение исследователя.
Полученные файлы в формате *.fasta могут быть использованы для дальнейшего анализа генетических детерминант антибиотикорезистентности на веб-ресурсах ResFinder 4.1 [17, 18], CARD RGI [19, 20] или др.
При необходимости определения сиквенс-ти-па микроорганизма можно использовать ресурс Multi Locus Sequence Typing (MLST) [21].
Проблемы здоровья и экологии / Health and Ecology Issues 2023;20(1):152-159
All statistics are based on contigs of size >■ 500 hp, unless otherwise noted (e.g., contigs (>= 0 bp)" and 'Total length (>» 0 bp)" include all contigs). Q Show heatmap
Worst Median
Best
Statistics without reference
* contigs
* contigs (>- 0 bp)
* contigs (>■ 1000 bp)
* contigs (>- 5000 bp)
* contigs (>- 10000 bp) fc contigs (>- 25000 bp) a contigs 50000 bp) Largest contig
Total length
Total length (>- 0 bp)
Total length i>- 1000 bp)
Total length (>- 5000 bp)
Total length (>- 10000 bp)
Total length (>- 25000 bp)
Total length (>« 50000 bp)
N50
N75
L50
L75
GC (%) Mismatches
* N's
~ n's per 100 kbp
contigs_329spades_ubuntu
123 290 110 71 61 48 34
395 721 5 671778 5 699908 5 662404 5 566665 5 500805 5 253479 4 735024 132893 82 539 14 27
56.74
0 0
contigs329BS
153
277
135
87
73
49
36_
477 769
5664312 5691676 5 651343 5 535 226 5443147 4 997 049 4 533 502 Î15 489 70 139
16 31
a
б
Рисунок 2. Результаты оценки трех сборок геномов с помощью сервиса QUAST: а — количественные показатели анализа сборки генома; б — распределение контигов по длине Figure 2. The results of the evaluation of three genome assemblies using the QUAST service: a — quantitative indicators of the genome assembly analysis;, b — contigs distribution by length
Заключение
Платформа Illumina MiSeq позволяет выполнять широкий спектр задач, направленных на целевое секвенирование малых геномов, а также проведение исследований в области метагено-мики и клинической молекулярной диагностики.
Рассмотрены основные этапы секвенирования генома K. pneumoniae с использованием метода коротких прочтений на платформе Illumina и
освещены ключевые особенности процесса про-боподготовки библиотек и анализа полученных данных. Показана значимость контроля качества на всех этапах высокопроизводительного секве-нирования.
Данная работа будет полезна для начинающих исследователей в молекулярно-генетиче-ской биологии.
2023;20(1):152-159 Проблемы здоровья и экологии / Health and Ecology Issues
Список литературы
1. Gupta N, Verma VK. Next-Generation Sequencing and Its Application: Empowering in Public Health Beyond Reality. In: Arora PK, editor. Microbial Technology for the Welfare of Society, Singapore: Springer; 2019. p. 313-341.
DOI: https://doi.org/10.1007/978-981-13-8844-6 15
2. Pervez MT, Hasnain MJU, Abbas SH, Moustafa MF, Aslam N, Shah SSM. A Comprehensive Review of Performance of Next-Generation Sequencing Platforms. Biomed Res Int. 2022 Sep 2022;29:345780.
DOI: https://doi.org/10-1155/2022/3457806
3. AmpliSeq for Illumina Community Panels. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://emea.illumina. com/products/by-brand/ampliseq/community-panels.html
4. Goodwin, S., McPherson, J. & McCombie, W. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 2016;17:333-335.
DOI: https://doi.org/10.1038/nrg.2016.49
5. Quality Scores for Next-Generation Sequencing. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://www.illu-mina.com/documents/products/technotes/technote Q-Scores.pdf
6. Cluster density guidelines for Illumina sequencing platforms using non-patterned flow cells. [дата обращения 2023 январь 23]. Режим доступа: https://emea.support.illumina. com/bulletins/2016/10/cluster-density-guidelines-for-illumina-sequencing-platforms-.html
7. MiSeq System Denature and Dilute Libraries Guide (15039740). [дата обращения 2022 декабрь 15]. Режим доступа: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/ documents/documentation/system documentation/miseq/miseq-denature-dilute-libraries-guide-15039740-10.pdf
8. How much PhiX spike-in is recommended when sequencing low diversity libraries on Illumina platforms? [дата обращения 2022 сентябрь 21]. Режим доступа: https://emea. support.illumina.com/bulletins/2017/02/how-much-phix-spike-in-is-recommended-when-sequencing-low-divers.html
9. Babraham Bioinformatics - FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. [дата обращения 2022 октябрь 5]. Режим доступа: https://www.bioinformatics. babraham.ac.uk/projects/fastqc/
10. SPAdes-Genome-Assembler Details - BaseSpace Sequence Hub. [дата обращения 2023 январь 16]. Режим доступа: https://basespace.illumina.com/apps/3047044/SPAdes-Genome-Assembler?preferredversion
11. Bioinformatics portal Galaxy | Europe. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://usegalaxy.eu/ root?tool id=toolshed.g2.bx.psu.edu%2Frepos%2Fnml%2Fspad es%2Fspades%2F3.15.4%2Bgalaxy1
12. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014;30:2114-2120. DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170
13. Bankevich A, Nurk S, Antipov D, Gurevich AA, Dvorkin M, Kulikov AS, et al. SPAdes: A New Genome Assembly Algorithm and Its Applications to Single-Cell Sequencing. Journal of Computational Biology. 2012;19:455-477.
DOI: https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021
14. Releases ablab/spades. GitHub [дата обращения 2023 январь 16]. Режим доступа: https://github.com/ablab/ spades/releases
15. Сиколенко МА, Сергеев РС, Валентович ЛН. Метод оценки полноты нуклеотидных данных для сборки геномных последовательностей на основе расчёта доли смежных контигов. B: Материалы II междунар. науч.-практ. конф. «Компьютерные технологии и анализ данных (CTDA'2020)» (Минск, 23-24 апреля 2020 г). Минск: БГУ; 2019. с. 162-166. [дата обращения 2023 январь 18]. Режим доступа: https://elib. bsu.by/handle/123456789/248660
16. QUAST - Quality Assessment Tool for Genome Assemblies [дата обращения 2023 январь 23]. Режим доступа: https://cab.cc.spbu.ru/quast/
17. Bortolaia V, Kaas RS, Ruppe E, Roberts MC, Schwarz S, Cattoir V, et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. J Antimicrob Chemother. 2020;75:3491-3500. DOI: https://doi.org/10.1093/jac/dkaa345
18. ResFinder 4.1 - Identifcation of acquired antibiotic resistance genes [дата обращения 2023 январь 10]. Режим доступа: https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/
19. McArthur AG, Waglechner N, Nizam F, Yan A, Azad MA, Baylay AJ, et al. The comprehensive antibiotic resistance database. Antimicrob Agents Chemother 2013;57:3348-3357. DOI: https://doi.org/10.1128/AAC.00419-13
20. The Comprehensive Antibiotic Resistance Database. [дата обращения 2023 январь 09]. Режим доступа: https://card. mcmaster.ca/analyze/rgi
21. MLST 2.0 - Multi Locus Sequence Typing [дата обращения 2023 январь 09]. Режим доступа: https://cge.food.dtu. dk/services/MLST/
References
1. Gupta N, Verma VK. Next-Generation Sequencing and Its Application: Empowering in Public Health Beyond Reality. In: Arora PK, editor. Microbial Technology for the Welfare of Society, Singapore: Springer; 2019. p. 313-341.
DOI: https://doi.org/10.1007/978-981-13-8844-6_15
2. Pervez MT, Hasnain MJU, Abbas SH, Moustafa MF, Aslam N, Shah SSM. A Comprehensive Review of Performance of Next-Generation Sequencing Platforms. Biomed Res Int. 2022 Sep 2022;29:345780.
DOI: https://doi.org/10.1155/2022/3457806
3. AmpliSeq for Illumina Community Panels. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://emea.illumina. com/products/by-brand/ampliseq/community-panels.html
4. Goodwin, S., McPherson, J. & McCombie, W. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 2016;17:333-335.
DOI: https://doi.org/10.1038/nrg.2016.49
5. Quality Scores for Next-Generation Sequencing. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://www.illu-mina.com/documents/products/technotes/technote_Q-Scores.pdf
6. Cluster density guidelines for Illumina sequencing platforms using non-patterned flow cells. [дата обращения 2023 январь 23]. Режим доступа: https://emea.support.illumina.
com/bulletins/2016/10/cluster-density-guidelines-for-illumina-sequencing-platforms-.html
7. MiSeq System Denature and Dilute Libraries Guide (15039740). [дата обращения 2022 декабрь 15]. Режим доступа: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/ documents/documentation/system_documentation/miseq/miseq-denature-dilute-libraries-guide-15039740-10.pdf
8. How much PhiX spike-in is recommended when sequencing low diversity libraries on Illumina platforms? [дата обращения 2022 сентябрь 21]. Режим доступа: https://emea. support.illumina.com/bulletins/2017/02/how-much-phix-spike-in-is-recommended-when-sequencing-low-divers.html
9. Babraham Bioinformatics - FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. [дата обращения 2022 октябрь 5]. Режим доступа: https://www.bioinformatics. babraham.ac.uk/projects/fastqc/
10. SPAdes-Genome-Assembler Details - BaseSpace Sequence Hub. [дата обращения 2023 январь 16]. Режим доступа: https://basespace.illumina.com/apps/3047044/SPAdes-Genome-Assembler?preferredversion
11. Bioinformatics portal Galaxy | Europe. [дата обращения 2023 январь 24]. Режим доступа: https://usegalaxy.eu/ root?tool id=toolshed.g2.bx.psu.edu%2Frepos%2Fnml%2Fspad es%2Fspades%2F3.15.4%2Bgalaxy1
Проблемы здоровья и экологии / Health and Ecology Issues 2023;20(1):152-159
12. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014;30:2114-2120. DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170
13. Bankevich A, Nurk S, Antipov D, Gurevich AA, Dvorkin M, Kulikov AS, et al. SPAdes: A New Genome Assembly Algorithm and Its Applications to Single-Cell Sequencing. Journal of Computational Biology. 2012;19:455-477.
DOI: https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021
14. Releases ablab/spades. GitHub [дата обращения 2023 январь 16]. Режим доступа: https://github.com/ablab/spades/ releases
15. Sikolenko MA, Sergeev RS, Valentovich LN. A method for assessing the completeness of nucleotide data for genomic sequences based on the calculation of the proportions of contiguous contig assemblies. In: Proceedings of the II Intern. scientific-practical. conf. «Computer technologies and data analysis (CTDA'2020)» (Minsk, April 23-24, 2020) Minsk: BSU; 2019. p. 162-166. [Date of access 2023 january 18]. Mode of access: https://elib.bsu.by/handle/123456789/248660 (in Russ.).
16. QUAST - Quality Assessment Tool for Genome Assemblies [Date of access 2023 january 23]. Mode of access: https://cab.cc.spbu.ru/quast/
17. Bortolaia V, Kaas RS, Ruppe E, Roberts MC, Schwarz S, Cattoir V, et al. ResFinder 4.0 for predictions of phenotypes from genotypes. J Antimicrob Chemother 2020;75:3491-5000 [Date of access 2023 january 09]. Mode of access: https://doi. org/10.1093/jac/dkaa345
18. ResFinder 4.1 - Identifcation of acquired antibiotic resistance genes [Date of access 2023 january 10]. Mode of access: https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/
19. McArthur AG, Waglechner N, Nizam F, Yan A, Azad MA, Baylay AJ, et al. The comprehensive antibiotic resistance database. Antimicrob Agents Chemother 2013;57:3348-3357. DOI: https://doi.org/10.1128/AAC.00419-13
20. The Comprehensive Antibiotic Resistance Database . [Date of access 2023 january 09]. Mode of access: https://card. mcmaster.ca/analyze/rgi
21. MLST 2.0 - Multi Locus Sequence Typing [Date of access 2023 january 09]. Mode of access: https://cge.food.dtu. dk/services/MLST/
Информация об авторах / Information about the authors
Шафорост Александр Сергеевич, старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории, УО «Гомельский государственный медицинский университет», Гомель, Беларусь
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6725-5353 e-mail: asofocl@mail.ru
Зятьков Алексей Александрович, старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории, УО «Гомельский государственный медицинский университет», Гомель, Беларусь
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9542-3791 e-mail: ziatskovaa@gmail.com
Воропаев Евгений Викторович, к.м.н., доцент, проректор по научной работе, УО «Гомельский государственный медицинский университет», Гомель, Беларусь ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9435-6109 e-mail: voropaev.evgenii@gmail.com Осипкина Ольга Викторовна, заведующий научно-исследовательской лабораторией, УО «Гомельский государственный медицинский университет», Гомель, Беларусь ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1931-4224 e-mail: olga.osipkina@mail.ru
Воропаева Алла Викторовна, к.б.н., доцент, врач клинической лабораторной диагностики, ГУ «Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека», Гомель, Беларусь
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0213-2421 e-mail: allo4ka3665@mail.ru
Бонда Надежда Александровна, заведующий микробиологической лабораторией, ГУ «Гомельский областной центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья», Гомель, Беларусь
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-2104-585X e-mail: bondana8448@gmail.com
Стома Игорь Олегович, д.м.н., доцент, ректор, УО «Гомельский государственный медицинский университет», Гомель, Беларусь
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0483-7329 e-mail: rektor@gsmu.by
Alexander S. Shaforost, Senior Researcher at the Research Laboratory of Gomel State Medical University ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6725-5353 e-mail: asofocl@mail.ru
Alexey A. Ziatskov, Senior Researcher at the Research Laboratory at Gomel State Medical University
ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9542-3791 e-mail: ziatskovaa@gmail.com
Evgenii V. Voropaev, Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Vice-Rector for Scientific Work, Gomel State Medical University
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9435-6109 e-mail: voropaev.evgenii@gmail.com Olga V. Osipkina, Head of the Research Laboratory, Gomel State Medical University
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1931-4224 e-mail: olga.osipkina@mail.ru
Alla V. Voropaeva, Candidate of Biological Sciences, Associate Professor, Physician at Clinical Laboratory Diagnostics, Republican Scientific and Practical Center for Radiation Medicine and Human Ecology
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0213-2421 e-mail: allo4ka3665@mail.ru
Nadezhda A. Bonda, Head of the Microbiology Laboratory, Gomel Regional Center for Hygiene, Epidemiology and Public Health
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-2104-585X e-mail: bondana8448@gmail.com
Igor O. Stoma, Doctor of Medical Sciences, Associate Professor, Rector of Gomel State Medical University ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0483-7329 e-mail: rektor@gsmu.by
Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
Воропаев Евгений Викторович Evgenii V. Voropaev
e-mail: voropaev.evgenii@gmail.com e-mail: voropaev.evgenii@gmail.com
Поступила в редакцию / Received 02.02.2023 Поступила после рецензирования / Accepted 08.02.2023 Принята к публикации /Revised 28.02.2023
