CC BY
93
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.24-004-07:577.2.08
Симакова Т.С.1, Брагин АХ.1, Глушкова М.А.1, Петрова Н.В.2, Поляков А.В.2, Кондратьева Е.И.2, Шерман В.Д.2, Павлов А.Е.1
ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ТАРГЕТНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ МУКОВИСЦИДОЗА
1ООО «ПАРСЕК ЛАБ», 199034, Санкт-Петербург, Россия;
2ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», 115478, Москва, Россия
Муковисцидоз (МВ) - одно из частых моногенных заболеваний. В России проведение ДНК-диагностики при МВ необязательно, однако ее применение позволяет сократить время постановки диагноза, повысить эффективность терапевтического лечения и не допустить повторного появления заболевания в семье. ДНК-диагностика с использованием панелей на частые мутации в гене CFTR рекомендована в случаях неопределенной клинической картины и при пограничных значениях специфических лабораторных показателей. С помощью таких панелей в России удается выявить до 90% патологических аллелей в гене CFTR. Для выявления более редких аллелей традиционно проводят секвенирование по Сенгеру. В последнее время для выявления редких мутаций стали доступны методы высокопроизводительного секвенирования (MPS). В данной работе проведена оценка эффективности применения тест-системы на основе технологии таргетного секвенирования для выявления мутаций, не идентифицированных при первичной ДНК-диагностике. Кроме того, у двух пациентов с МВ методом MPS идентифицированы ранее не известные нонсенс-мутации Q1038X (c.3112C>T) и W1310X (c.3930G>A).
Ключевые слова: муковисцидоз; CFTR; таргетное секвенирование; MPS; VariFind™™.
Для цитирования: Симакова Т.С., Брагин А.Г., ГлушковаМ.А., ПетроваН.В., Поляков А.В., КондратьеваЕ.И., Шерман В.Д., Павлов А.Е. Опыт применения таргетного секвенирования для молекулярной диагностики муковисцидоза. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (5): 305-309. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-5-305-309
Simakova T.S.1, Bragin A.G.1, Glushkova M.A.1, Petrova N.V.2, Polyakov A.V.2, Kondratieva E.I.2, Sherman V.D.2, Pavlov A.E.1
the experience of application of target sequencing in molecular diagnostic of mucoviscidosis
1MParseq Lab" 199034 St. Petersburg, Russia
2The medical genetic research center, 115478 Moscow, Russia
The mucoviscidosis is one of frequent monogenic diseases. In Russia, in case of mucoviscidosis carrying out of DNA-diagnostic is optional. However, its application permits shortening time of diagnosing, increasing efficiency of of therapeutic treatment and preventing secondary manifestation of disease in family. The DNA-diagnostic using panels on frequent mutations in gene CFTR is recommended in cases of uncertain clinical picture and under borderline values of specific laboratory indices. In Russia, application of such panels permit detecting up to 90% ofpathological alleles in gene CFTR. To detect more rare alleles the Sanger sequencing is traditionally applied. Lately, highly productive sequencing techniques became available to detect rare mutations. The actual article presents evaluation of efficiency of application of test-system based on technology of target sequencing for detecting mutations unidentified at primary DNA-diagnostic. Besides, in two patients with mucoviscidosis the application of highly productive sequencing techniques permitted to identify previously unknown nonsense mutations Q1038X (c.3112C>T) и W1310X (c.3930G>A).
Keywords: mucoviscidosis; CFTR; target sequencing; highly productive sequencing techniques; VariFind™™. For citation: Simakova T.S., Bragin A.G., Glushkova M.A., Petrova N.V., Polyakov A.V., Kondratieva E.I., Sherman V.D., Pavlov A.E. The experience of application of target sequencing in molecular diagnostic of mucoviscidosis . Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2017; 62 (5): 305-309. (in Russ.). DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0869-2084-2017-62-5-305-309
For correspondence: PavlovA.E., the general director. e-mail: apavlov@parseq.pro. Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Acknowledgment. The study had no sponsor support.
Received 30.11.2016 Accepted 15.01.2017
Для корреспонденции: Павлов Александр Евгеньевич, генеральный директор ООО «ПАРСЕК ЛАБ», 199034, Санкт-Петербург, e-mail: apavlov@parseq.pro.
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Введение. Муковисцидоз (МВ) - наследственное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования, проявляющееся при наличии двух патогенных аллелей. С 2007 г в России проводят массовый скрининг новорожденных на МВ, включающий биохимические исследования и функциональное тестирование. В России проведение молекулярной диагностики не обязательно при постановке диагноза МВ, однако она рекомендована, особенно в случаях, когда на основании клинической картины невозможно подтвердить или исключить диагноз [1]. При наличии МВ в семейном анамнезе проведение ДНК-диагностики позволяет снизить риск рождения больного ребенка в семье.
ДНК-диагностика МВ осложняется высокой аллельной гетерогенностью. На сегодняшний день для гена CFTR, ответственного за развитие МВ, известно более 2000 мутаций. В консенсусе по МВ за 2008 г описано 170 патогенных мутаций в гене CFTR [2]. Однако данные о количестве клинически значимых вариантов в разных источниках варьируют в широких пределах, поскольку с появлением новых научных данных и уточнением имеющихся информация о клинической значимости мутаций постоянно обновляется.
Наибольшее распространение в клинической практике получили классические молекулярно-генетические методы, основанные на ПЦР, MLPA и гибридизации [3]. К преимуществам данных методов относят невысокую стоимость и простоту выполнения. Однако классические методы позволяют выявлять лишь ограниченный спектр известных мутаций, который специфичен для конкретной популяции. Как правило, специфические панели на частые мутации используют на первом этапе молекулярной диагностики, после чего в случае получения отрицательного результата проводят расширенный ДНК-анализ секвенированием по Сенгеру, включающий генотипирование в экзонах и сайтах сплайсинга. Секвенирование по Сенгеру -«золотой стандарт» клинической молекулярной диагностики в силу высокой чувствительности и специфичности метода, однако при большом потоке образцов секвенирование по Сенгеру становится технологически трудным и дорогостоящим [4].
С развитием технологий высокопроизводительного сек-венирования (MPS) появилась возможность эффективно исследовать обширные регионы генома и тем самым повысить доступность тестирования широкого спектра мутаций [5]. С 2014 г. на российском рынке доступна тест-система на основе полупроводникового таргетного секвенирования, представляющая собой комплексное клинически валидиро-ванное решение для детекции мутаций в генах CFTR, PAH и GALT [6]. Аналитические характеристики тест-системы были установлены в рамках верификации результатов путем секвенирования по Сенгеру [6]. Опыт применения подобной тест-системы в реальной клинической практике на образцах ДНК российских пациентов с МВ, у которых рутинными методами не удалось выявить оба патогенных аллеля, стал первым шагом на пути внедрения MPS-технологий в практику лабораторной диагностики.
Материал и методы. Тестирование образцов ДНК неродственных пациентов с диагнозом МВ проводили с помощью тест-системы VariFind™ Neoscreen assay (Parseq Lab). Тест-система основана на платформе Ion PGM™ (Life Technologies) и валидирована для клинического применения. Тест-система позволяет идентифицировать 580 известных точковых мутаций в генах CFTR, PAH и GALT, детектировать распространенную крупную делецию, CFTRdele2,3, в гене CFTR, а также выявлять ранее не известные и de novo мутации в пределах таргетных регионов [7].
Таблица 1
Последовательности праймеров для секвенирования по Сенгеру
№ Вариант Экзон Праймеры Длина продукта Температура отжига
1 Q1038X 19 (17a) F 5' GACACACTTTGTCCACTTTGC R 5' GTCCTGTACACCAACTGTGG 482 п.н. 58oC
2 W1310X 24 (21) F 5' CTTGATGGTAAGTACATGGGTGT R 5' GGGGTAGGTCCAGTCAAAAGT 395 п.н. 58oC
Подтверждение новых вариантов методом двустороннего секвенирования по Сенгеру проводили в ФГБНУ «МГНЦ» на секвенаторе ABI-3130XL (Applied Biosystems) согласно протоколу производителя. Последовательности праймеров приведены в табл. 1.
Образцы ДНК неродственных пациентов с диагнозом МВ получены из трех лабораторий: лаборатории генетической эпидемиологии ФГБНУ «МГНЦ» - 11 образцов; лаборатории ДНК-диагностики ФГБНУ «МГНЦ» - 25 образцов; НИИ медицинской генетики - 13 образцов; всего 49 образцов. Диагноз МВ поставлен в соответствии с российскими критериями диагностики МВ [8]. Предварительно пациентам проведена молекулярно-генетическая диагностика с использованием одной или нескольких специфических панелей на частые мутации в гене CFTR.
От всех обследованных пациентов получено письменное информированное согласие на участие в исследовании. Проведение исследования одобрено этическим комитетом ФГБНУ «МГНЦ» (протокол № 2 от 10.03.2016).
Результаты. Для анализа с помощью тест-системы на основе MPS было отобрано 49 образцов ДНК от пациентов с диагнозом МВ, у которых не были выявлены оба мутантных аллеля по результатам поиска частых мутаций с использованием специфических панелей.
У 44 пациентов рутинными методами идентифицирован один патогенный аллель, у 5 пациентов патогенные аллели не выявлены. В ходе проведения расширенного ДНК-анализа у 44 пациентов с одной идентифицированной мутацией подтверждена ранее выявленная мутация, при этом у 34 пациентов из 44 идентифицирован второй патогенный аллель (табл. 2).
Среди пяти пациентов с двумя невыявленными мутациями у трех пациентов методом MPS были установлены оба патогенных аллеля, у двух пациентов идентифицирован один патогенный аллель (табл. 3).
Методом MPS-секвенирования у двух пациентов с МВ идентифицированы ранее не описанные мутации в гене CFTR: Q1038X и W1310X (рис. 1, 2). Варианты подтверждены секвенированием по Сенгеру образцов ДНК пробан-дов и их родителей. Вариант Q1038X (c.3112C>T) приводит к образованию стоп-кодона в экзоне 19 гена CFTR. Вариант W1310X (c.3930G>A) приводит к образованию стоп-кодона в экзоне 21 гена CFTR. В базе данных CFTR1 описан патогенный вариант W1310X (c.3929G>A), приводящий к молекулярным последствиям, аналогичным таковым для обнаруженного варианта W1310X (c.3930G>A). Обнаружение варианта, для которого in silico показано формирование укороченного транскрипта, в трансположении относительно известной патогенной мутации у пациента с установленным диагнозом может свидетельствовать о клинической значимости этого варианта. Согласно критериям классификации вариантов, утвержденным Американским колледжем медицинской генетики, такие варианты с высокой вероятностью являются патогенными [9].
У 49 пациентов идентифицировано 323 генетических ва-
Таблица 2
Мутации, выявленные методом MPs у пациентов с одной известной мутацией
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
рианта в гене CFTR, в том числе 86 клинически значимых вариантов. Выявлена 41 уникальная мутация, 10 мутаций встречали в исследуемой выборке два и более раз. Идентифицировано 11 мутаций, впервые выявленных у российских пациентов, это варианты: 4374+1G>A, [E217G;H1085R], 3199del6,3667ins4, 406-6T>c, A96E, G178X, L1077p, Q1038X, W1310X (TGG>TGA) и W57R [10, 11].
Заключение. По результатам расширенной ДНК-диагностики, у 75,5% (37 из 49) пациентов поставлен генетический диагноз МВ, т.е. выявлены оба патогенных аллеля. В исследуемой группе идентифицировано 86 патогенных аллелей, из которых только 44 были установлены ранее другими методами. Таким образом, на данной выборке диагностическая чувствительность Mps тест-системы составила 88% против 45% для узких диагностических панелей. Полученные результаты коррелируют с данными литературы, согласно которым расширенный анализ гена CFTR путем секвенирования по Сенгеру позволяет достичь 95% чувствительности [11]. Различия обусловлены разнородностью исследуемых выборок. Причины не обнаружения второй мутации у оставшихся 24,5% можно разделить на две группы.
К основным причинам относят естественные ограничения метода. В некоторых случаях фенотип может быть обусловлен мутациями, находящимися за пределами исследуемых регионов генома, например в интронах или регуля-торных областях. Эту проблему решают путем модификации панели с учетом новых данных. Кроме того, некоторые типы мутаций, например структурные вариации, могут быть обнаружены только при использовании специальных методов, таких как mlpa и array cgh. По данным литературы, на долю вариаций копийности в гене CFTR приходится до 4 % всех патогенных мутаций [5]. Идентифицировать такие варианты при рутинном секвенировании по Сенгеру крайне трудно, однако для mps-методов существуют решения, позволяющие детектировать вариации копийности, в том числе ранее не известные [12].
Другие причины невыявления мутаций носят биологический характер. Тяжесть заболевания варьирует от мягких форм, не приводящих к инвалидизации, до летальных исходов в младенческом возрасте. Такое разнообразие клинической картины обусловлено наличием генов-модификаторов, мутации в которых влияют на фенотип [13]. Известны уникальные случаи, когда при наличии генетического диагноза заболевание отсутствует [14]. В редких случаях клиническая картина, сходная с МВ, может быть обусловлена другими наследственными заболеваниями, не связанными с геном CFTR [15].
В исследованной группе пациентов первичная ДНК-диагностика с использованием специфических панелей на частые мутации не привела к постановке генетического диагноза, тогда как расширенный ДНК-анализ позволил установить генетический диагноз и подтвердить клинический
№ Образец Известная мутация Новая мутация Диагноз
1 112MB F508del cfTrdele2,3 Муковисцидоз
2 120MB F508del cfTrdele2,3 Муковисцидоз
3 121MB f508del E92K Муковисцидоз
4 122MB f508del s466X (c>G) Муковисцидоз
5 1247-3 f508del na Муковисцидоз
6 1273-3 f508del Q1038X Муковисцидоз
7 127MB f508del 1898+1G>c Муковисцидоз
8 133MB f508del E92K Муковисцидоз
9 136MB f508del 2789+5G>A Муковисцидоз
10 141MB f508del NA Муковисцидоз
11 1560-1 1677delTA A96E Муковисцидоз
12 1590-1 f508del R553X Муковисцидоз
13 159MB f508del NA Муковисцидоз
14 1700-1 G542X R1158X Муковисцидоз
15 1723-1 L138ins G178X Муковисцидоз
16 1868-1 f508del NA Муковисцидоз
17 1906-3 f508del 406-6T>c Муковисцидоз
18 1916-3 f508del NA Муковисцидоз
19 1926-3 f508del NA Муковисцидоз
20 1928-3 f508del NA Муковисцидоз
21 1947-3 f508del 4015delA Муковисцидоз
22 1984-3 f508del NA Муковисцидоз
23 1993-1 1677delTA r117c Муковисцидоз
24 1996-1 G542X 4428insGA Муковисцидоз
25 1996-3 W1282X r1066c Муковисцидоз
26 2010-1 E92K [E217G (;) H1085R] Муковисцидоз
27 2055-1 f508del 4382delA Муковисцидоз
28 2126-3 L138ins NA Муковисцидоз
29 2140-1 f508del l1077p Муковисцидоз
30 2203-1 f508del E92K Муковисцидоз
31 2299-1 1248+1G>A 2118del4 Муковисцидоз
32 2305-1 f508del 3667ins4 Муковисцидоз
33 2381-1 f508del NA Муковисцидоз
34 2413-1 f508del s945l Муковисцидоз
35 2481-1 f508del W1282R Муковисцидоз
36 2483-1 f508del Y84X Муковисцидоз
37 2484-1 f508del s945l Муковисцидоз
38 2524-1 f508del 1898+1G>c Муковисцидоз
39 576-1 3849+10kbc>T G480s Муковисцидоз
40 683-3 G542X W1310X (TGG>TGA) Муковисцидоз
41 800-1 f508del 3272-11A>G Муковисцидоз
42 868-1 1677delTA 3199del6 Муковисцидоз
43 871-1 f508del L1335p Муковисцидоз
44 957-1 1677delTA s1159f Муковисцидоз
Таблица 3
Мутации, впервые выявленные у пациентов методом MPs
№ Образец Новая мутация Новая мутация Диагноз
1 118MB 2043delG 1716+1G>A Муковисцидоз
2 119MB R334W NA Муковисцидоз
3 125MB W75R NA Муковисцидоз
4 160MB F508del W1282X Муковисцидоз
5 2342-1 4374+1G>A 4374+1G>A Муковисцидоз
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 1. Мутация Q1038X в гене CFTR, идентифицированная методом MPS. Визуализация в геномном браузере IGV.
Рис. 2. Мутация W1310X в гене CFTR, идентифицированная методом MPS. Визуализация в геномном браузере iGV.
Analyzes 118MB.vcf Show
E SeqDB Variants
0 Custom Variants [У] dbSNP Variants [V] Unannotated Variants
I □ SeqDB References □ Custom References
Variant display preferences
0
Show variants for 0 CFTR 0РАН
Hgalt
r^ pQrseq
Lob
~ Gene Name Effect Type Genotype Variant Quality
Pathogenic SeqDB Variants HI
2 2043deKà Pathogenic SeqDB Variants Heterozygous with reference
rs213950 Non pathogenic dbSNP Variants Homozygous (variant) *
rs213965 Unknown dbSNP Variants Homozygous (variant) Ж
rs 11978434 Unknown dbSNP Variants Homozygous (variant) ж
rs 1042077 Unknown dbSNP Variants Homozygous (variant) *
rs213989 Unknown dbSNP Variants Homozygous (variant)
rs 1800136 Unknown dbSNP Variants Homozygous (variant)
CFTR chr7:117175505-117175505(A>G) Unknown ¡Unannotated Variants Heterozygous with reference V
10 CFTR chr7:117246636-117246636(G >A) Unknown Unannotated Variants Homozygous (variant) V
И РАН rs772897 Untested dbSNP Variants Homozygous (variant)
12 РАН rs 12580432 Untested dbSNP Variants Homozygous (variant) *
13 РАН rs 1042503 Untested dbSNP Variants Homozygous (variant)
14 РАН rs2037639 Untested dbSNP Variants Homozygous (variant)
Regions
Target Regions Coverage: 100.0%
Chromosome Ichr7
Position
1117175523- 117175523
117292930- 117292932
Displaying 14 variant(s)..
Region Quality
x
Рис. 3. Аннотация генетических вариантов в программе VariFmd™, образец 118МВ. Патогенные варианты выделены насыщенным цветом; варианты, проаннотированные в базе данных dbSNP, выделены серым цветом; неаннотированные варианты выделены белым цветом. На нижней панели указаны целевые регионы с низким покрытием.
диагноз в 75,5% случаев. Разнообразие идентифицированных минорных аллелей, включая обнаружение двух новых мутаций в столь малой выборке, подтверждает высокую аллельную гетерогенность МВ в российской популяции. Таким образом, проведение расширенного ДНК-анализа гена CFTR в качестве второго этапа после получения отрицательного результата при тестировании на частые мутации служит целесообразным инструментом молекулярной диагностики.
Полученные результаты показали эффективность применения тест-системы на основе таргетного секвенирования для подтверждающей молекулярно-генетической диагностики МВ в сложных случаях, когда рутинные методы оказались недостаточно информативны. Однако при использовании столь чувствительных методов возникает необходимость интерпретации новых находок и трансляции данных в клиническую форму. Программное обеспечение, поставляемое с тест-системой VariFind™ Neoscreen assay, осуществляет автоматическую аннотацию найденных вариантов, что позволяет минимизировать работу по поиску информации о редких вариантах во внешних источниках (рис. 3).
Опыт успешного применения тест-системы в качестве второго этапа ДНК-диагностики открывает перспективы внедрения MPs-технологий в рутинную практику молекулярно-диагностических лабораторий. Определение показаний к назначению анализа и выбор оптимальных диагностических протоколов должны стать предметом дальнейших исследований.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 2-5, 8, 12-15 см. REFERENCES)
1. Шерман В.Д., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И., Кусова З.А. К вопросу о неонатальном скрининге на муковисцидоз в РФ. В кн.: Сборник тезисов: X Национальный конгресс "Муковисцидоз у детей и взрослых. 20 лет Российскому центру муковисцидоза". Ярославль; 2011: 26-31.
6. Симакова Т.С., Брагин А.Г., Зайцева М.А., Павлов А.Е. Роль высокопроизводительного секвенирования в неонатальном скрининге наследственных нарушений обмена веществ. Медицинская генетика. 2013; 12 (9): 11-3.
7. Петрова Н.В. Молекулярно-генетические и клинико-генотипические особенности муковисцидоза в российских популяциях: Автореф. дисс. ... докт. биол. наук. М.; 2009.
9. Регистр больныхмуковисцидозом в Российской Федерации. 2013 год. М.: ИД «Медпрактика-м»; 2015.
10. Руковичкин Д.В. Клинико-генотипический полиморфизм муко-висцидоза среди населения Краснодарского края: Дисс. . канд. мед. наук. Краснодар; 2007.
11. Петрова Н.В., Васильева Т.А., Тимковская Е.Е., Капранов Н.И., Зинченко Р.А. Анализ редких мутантных аллелей в гене CFTR у российских больных. В кн.: Сборник тезисов: XIНациональный конгресс "Муковисцидоз у детей и взрослых. Взгляд в будущее». М.; 2013: 66-9.
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
references
1. sherman V.D., Kashirskaya N.Yu., Kapranov N.I., Kusova Z.A. on the issue of neonatal screening for cystic fibrosis in the Russian Federation. In: Abstracts: X National Congress "Cystic Fibrosis in Children and Adults. Russian Center of Cystic Fibrosis 20th Anniversary. " [Sbornik tezisov: X Natsional'nyy kongress "Mukovistsidoz u detey i vzroslykh. 20 let Rossiyskomu tsentru mukovistsidoza"]. Yaroslavl'; 2011: 26-31. (in Russian)
2. Castellani C., Cuppens H., Macek M.Jr., Cassiman J.J., Kerem E., Durie P. et al. Consensus on the use and interpretation of cystic fibrosis mutation analysis in clinical practice. J. Cyst. Fibros. 2008; 7 (3): 179-96.
3. Eshaque В., Dixon B. Technology platforms for molecular diagnosis of cystic fibrosis. Biotechnol. Adv. 2006; 24 (1): 86-93.
4. Lefterova M.I., shen P., odegaard J.I., Fung E., Chiang T., Peng G. et al. Next-generation molecular testing of newborn dried blood spots for cystic fibrosis. J. Mol. Diagn. 2016; 18 (2): 267-82.
5. Kulkarni s., Pfeifer J. Clinical Genomics: A Guide to Clinical Next Generation Sequencing. London: Elsevier Inc., Academic Press; 2015.
6. simakova T.s., Bragin A.G., Zaytseva M.A., Pavlov A.E. The role of high-throughput sequencing in the neonatal screening of inherited metabolic disorders. Meditsinskaya genetika. 2013; 12 (9): 11-3. (in Russian)
7. Petrova N.V. Molecular Genetics, Clinical and Genotypic Features of Cystic Fibrosis in the Russian Populations: Diss. Moscow; 2009. (in Russian)
8. Richards s., Aziz N., Bale s., Bick D., Das s., Gastier-Foster J. et al. standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet. Med. 2015; 17 (5): 405-24.
9. Register of Cystic Fibrosis Patients in the Russian Federation. Year 2013 [Registr bol'nykh mukovistsidozom v Rossiyskoy Federatsii. 2013 god]. Moscow: ID "Medpraktika-m"; 2015. (in Russian)
10. Rukovichkin D.V. The Clinical and Genotypic Polymorphisms Mu-kovistsmdoza Population of Krasnodar Territory: Diss. Krasnodar; 2007. (in Russian)
11. Petrova N.V., Vasil'eva T.A., Timkovskaya E.E., Kapranov N.I., Zinchenko R.A. Analysis of rare mutant alleles in the CFTR gene in Russian patients. In: Abstracts: XINational Congress "CysticFibrosis in Children and Adults. A Glance at the Future" [Sbornik tezisov: XINatsional'nyy kongress "Mukovistsidoz u detey i vzroslykh. Vzg-lyadv budushchee"]. Moscow; 2013: 66-9. (in Russian)
12. Ferec C., Casals T., Chuzhanova N., Macek M.Jr., Bienvenu T., Hol-ubova A. et al. Gross genomic rearrangements involving deletions in the CFTR gene: characterization of six new events from a large cohort of hitherto unidentified cystic fibrosis chromosomes and meta-analysis of the underlying mechanisms. Eur. J. Hum. Genet. 2006; 14 (5): 567-76.
13. Merlo C.A., Boyle M.P. Modifier genes in cystic fibrosis lung disease. J. Lab. Clin. Med. 2003; 141 (4): 237-41.
14. Chen R., shi L., Hakenberg J., Naughton B., sklar P., Zhang J. et al. Analysis of 589,306 genomes identifies individuals resilient to severe Mendelian childhood diseases. Nat. Biotechnol. 2016; 34 (5): 531-8.
15. Cohen-Cymberknoh M., simanovsky N., Hiller N., Gileles-Hillel A., shoseyov D., Kerem E. Differences in disease expression between primary ciliary dyskinesia and cystic fibrosis with and without pancreatic insufficiency. Chest. 2014; 145 (4): 738-44.
Поступила 30.11.16 Принята к печати 15.01.17
