CC BY
266. Borch K., Jonsson K., Petersson F. et al. Prevalence of gastroduodenitis and Helicobacter pylori infection in a general population sample. Relation to symptomatology and life style. Dis. Sci. 2000, 45 (7): 1322-1329.
7. Furuta T., Delchier J.C. Helicobacter pylori and non-malignant diseases. Helicobacter. 2009, 14 (1): 29-35.
8. Gallo N., Zambon C., Navaglia F. et al. Helicobacter pylori infection in children and adults: a single pathogen but a different pathology. Helicobacter. 2003, 8: 21-28.
9. Goh K.L., Chan W.K., Shiota S., Y&maoka Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications . Helicobacter. 2011, 16 (l. 1): 1-9.
10. Jafari F., Shokrzadeh L., Dabiri H. et al. vacA genotypes of Helicobacter pylori in relation to cagA status and clinical outcomes in Iranian populations. Jpn J. Infect. Dis. 2008, 61: 290293.
11. Kim N., Park YS., Cho S.I. et al. Prevalence and risk factors of atrophic gastritis and intestinal metaplasia in a Korean population without significant gastroduodenal disease. Helicobacter. 2008, 13: 245-255.
12. Michara M., Haruma K., Kamada T. et al. The role of the endoscopic findings fort he diagnosis of H. pylori infection: evaluation in a country with high prevalence of atrophic gastritis. Helicobacter. 1999, 4 (1): 40.
13. Ohnishi N., Yuasa H., Tanaka S. et al. Transgenic expression of Helicobacter pylori CagA induces gastrointestinal and hematopoietic neoplasms in mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008, 105: 1003-1008.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Сварваль Алена Владимировна,
197101, Санкт-Петербург, ул.Мира, 14, р.т. (812)232-84-76
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Н.Е.Ястребова, Н.В.Грищенко, М.П.Костинов, О.А.Салкина*, Н.В.Снегова*, Н.П.Ванеева
ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ПНЕВМОКОККОВЫХ ВАКЦИН ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова; *ГНЦ — Институт иммунологии, Москва
Цель. Оценка возможности использования в ИФА в качестве антигенов пневмококковой полисахаридной вакцины Пневмо-23 и конъюгированной вакцины Превенар-7 для определения уровня IgG к капсульным полисахаридам. Материалы и методы. В работе использован метод твердофазного ИФА с сорбцией на полистироле коммерческих вакцин Пневмо-23 и Превенар-7. Анализировали сыворотки крови 41 ребенка до вакцинации и по 8 сывороток детей до и после вакцинации Пневмо-23 и Превенар-7. Уровень IgG выражали в условных единицах. Результаты. Средний уровень антител в группах невакцинированных детей к антигенам обеих вакцин находился в диапазоне 52,3 — 69,1 ед. (р>0,05). Число детей с диагностически значимым уровнем антител (114 — 120 ед.) в контрольной группе составило 2,4% (1/41) в случае использования антигенов Пневмо-23 и 7,3% (3/41) при применении антигенов Превенар-7. После вакцинации Пневмо-23 доля диагностически значимого уровня антител к антигенам Пневмо-23 была в среднем в 1,8 раза выше, чем в довакцинальном периоде у 62,5% детей, а к антигенам Превенар-7 — в 1,6 раза выше у 75,0% детей. После иммунизации вакциной Превенар-7 уровень антител повышался в 3 — 4 раза к антигенам обеих вакцин и достигал диагностически значимого в 100% случаев. Заключение. Пневмококковые
вакцины Пневмо-23 и Превенар-7 могут быть использованы в качестве антигенов для определения антител к капсульным полисахаридам Streptococcus pneumoniae в ИФА. Более высокая чувствительность ИФА на основе Превенар-7 позволяет рекомендовать этот тест для изучения поствакцинального иммунитета у привитых как конъюгированными, так и неконъюгированными полисахаридными пневмококковыми вакцинами.
Журн. микробиол., 2013, № 2, С. 96—101
Ключевые слова: пневмококк, полисахаридные вакцины, поствакцинальный иммунитет, антитела к капсульным полисахаридам
N.E.Yastrebova, N.V.Grischenko, M.P.Kostinov, O.A.Salkina*, N.V.Snegova*, N.P.Vaneeva
EXPERIENCE OF APPLICATION OF PNEUMOCOCCUS VACCINES FOR STUDIES OF HUMORAL IMMUNITY
Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera; *State Scientific Centre — Institute of Immunology, Moscow, Russia
Aim. Evaluate possible use of Pneumo-23 pneumococcus polysaccharide vaccine and Prevenar-7 conjugated vaccine in EIA as antigens for determination of IgG levels against capsule polysaccharides. Materials and methods. Solid phase EIA method with sorption on polystyrol of commercial vaccines Penumo-23 and Prevenar-7 was used in the study. Blood sera of 41 children before immunization and sera of 8 children before and after vaccination with Pneumo-23 and Prevenar-7 were analyzed. IgG level was determined in standard units (u.). Results. Mean level ofantibodies in groups ofunimmunized children against antigens of both vaccines were in the range of 52.3—69.1 u. (p>0.05). The number of children with diagnostically significant level of antibodies (114 — 120 u.) was 2.4% in the control group (1/41) when Pneumo-23 antigens were used and 7.3% (3/41) when Prevenar-7 antigens were used. After vaccination with Pneumo-23 the fraction of diagnostically significant level of antibodies against Pneumo-23 antigens was on average higher by 1.8 times than in pre-vaccination period in 62.5% of children, and against Prevenar-7 antigens — by 1.6 times higher in 75% of children. After immunization with Prevenar-7 vaccine the level of antibodies increased by 3—4 times against antigens ofboth vaccines and reached diagnostically significant in 100% of cases. Conclusion. Pneumo-23 and Prevenar-7 pneumococcal vaccines may be used as antigens for determination of antibodies against capsule polysaccharides of Streptococcus pneumoniae in EIA. Higher sensitivity of EIA based on Prevenar-7 allows to recommend this test for studies of postvaccination immunity in immunized with both conjugated and non-conjugated polysaccharide pneumococcal vaccines.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 2, P. 96—101
Key words: pneumococcus, polysaccharide vaccines, post-vaccination immunity, antibodies against capsule polysaccharides
Заболевания, вызываемые Streptococcus pneumoniae, являются важной проблемой здравоохранения во всем мире [1]. Особенно высок риск заболеваний среди детей до двух лет и лиц пожилого возраста. Надежным способом предотвращения пневмококковой инфекции является специфическая вакци-
7. жмэи 2 № 5183
97
нопрофилактика [3]. Поскольку экспериментально установлена важная роль в защите от пневмококка антител к капсульным полисахаридам, на основе этих антигенов разработаны и успешно применяются два вида пневмококковых вакцин. Одна из них — Пневмо-23 («Санофи Пастер», Франция), содержащая в одной дозе (0,5 мл) по 25 мкг капсульных полисахаридов каждого из 23 наиболее часто встречающихся серотипов пневмококка. Другая — Превенар-7 («Пфайзер», США) — конъюгированная с генно-инженерным дифтерийным анатоксином, содержащая семь или тринадцать серотиповых полисахаридов S.pneumoniae. В вакцине Превенар-7доля каждого полисахарида, конъюгированного с белком, составляет 2 — 4 мкг. Известно, что вакцина Пневмо-23 не обеспечивает защиту новорожденных и детей младшего возраста, поэтому рекомендована к применению лишь с 2 лет. Конъюгированная вакцина стимулирует Т-клеточный иммунитет, ее используют для создания долгосрочной защиты и иммунологической памяти в популяции детей младшего возраста. После начала плановой вакцинации в США и других странах установлена четкая тенденция к снижению инвазивных пневмококковых заболеваний как среди детей первых двух лет, так и в популяции взрослых людей [5, 6]. Оба типа вакцин зарегистрированы и применяются во многих странах, в том числе и в России. Известно, что для контроля над распространением пневмококковой инфекции необходимо проводить мониторирование эффективности вакцинации [1]. Этот показатель можно устанавливать с помощью различных методов, позволяющих выявлять нарастание уровня специфических антител в поствакцинальном периоде. Для им-мунохимических реакций требуются очищенные капсульные полисахариды каждого серотипа пневмококка или тест-системы на их основе. Такими антигенами в настоящее время располагают лишь фирмы-производители вакцин.
Целью настоящего исследования была оценка возможности использования в ИФА в качестве антигенов пневмококковой полисахаридной вакцины Пневмо-23 и конъюгированной вакцины Превенар-7 для определения уровня IgG к капсуль-ным полисахаридам.
В исследование включено 57 детей обоего пола с различными отклонениями в состоянии здоровья и факторами риска, предрасполагающими к развитию ин-вазивных пневмококковых заболеваний. Контрольную группу (непривитых) составил 41 ребенок в возрасте от 8 мес. до 4 лет (средний возраст 2 года 2 мес.). Основную группу, вакцинированных против пневмококковых инфекций, разделили на две подгруппы: в первую вошли 8 детей от 3 до 4 лет (средний возраст 3 года 4 мес.), однократно вакцинированных препаратом Пневмо-23; во вторую — 8 детей от 1 года до 2 лет 8 мес. (средний возраст 1 год 6 мес.), двукратно вакцинированных Превенар-7 с интервалом 45 — 60 дней. Сыворотку крови вакцинированных детей, взятую до и через 6 месяцев после вакцинации, исследовали на наличие антител к вакцинным препаратам.
Исследование проводили в соответствии с разработанным протоколом, соответствующим национальному стандарту РФ (ГОСТ Р 52379-2005 «Национальная клиническая практика») и Международной практике клинических исследований GCP, на базе отделения иммунопатологии у пациентов Института иммунологии и городского консультативно-диагностического центра по специфической иммунопрофилактике (Москва).
Для анализа сывороток крови использовали метод твердофазного ИФА, который осуществляли в следующей последовательности. Сорбцию лунок полисти-рольных пластин ( ООО «Биомедикал», Россия) проводили вакциной Пневмо-23 и Превенар-7. Для этого одну дозу каждой вакцины разводили фотсфатно-соле-
вым буферным раствором (ФСБ) до объема 50 мл. Раствором каждой вакцины сорбировали по 5 пластин (100 мкл/лунка). Длительность сорбции — 2 ч при 37°С и 16 — 18 ч при 8 — 10°С. После отмывки от несвязавшихся антигенов в лунки вносили в дублях по 100 мкл рабочего разведения анализируемых сывороток (1:50), выдерживали 30 мин при 37°С. После отмывки вносили по 100 мкл рабочего разведения конъюгата (антитела диагностические против IgG человека, меченные пероксидазой, производство НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) и инкубировали 30 мин при 37°С. После очередной отмывки лунок ФСБ с твином вносили ТМБ и через 15 мин реакцию останавливали добавлением 50 мкл 0,9М Н^04. Оптическую плотность определяли при 450 нм на отечественном спектрофотометре «ЭФОС-9305» (ОАО «Сапфир», Россия). Результаты выражали в условных единицах рассчитанных по формуле:
ОПанализ
-х100.
ОПк- +0,25
В качестве отрицательного контроля (К-) использовали пул сывороток 100 здоровых доноров станции переливания крови Москвы.
Дети контрольной группы и две группы детей до вакцинации имели в своем составе пациентов с низкими (21,0; 30,2; 33,9; 35,6; 37,5 ед.) и высокими (179,0; 181,12; 200,0 ед.) показателями уровня антител (АТ). При этом по средним значениям уровня специфических АТ к полисахаридным компонентам обеих вакцин (52,3 — 69,1), доле показателей ниже и выше среднего уровня до вакцинации группы детей также достоверно не отличались между собой (р>0,05).
Поскольку общепринято считать диагностически значимым уровнем антител показатели, превышающие средние значения на два-три средних квадратичных отклонения [4], можно предположить, что один (2,4% при использовании антигенов Пневмо-23) или три (7,3% при использовании антигенов Превенар-7) ребенка в контрольной группе и один (12,5% при использовании антигенов Пневмо-23) пациент группы вакцинированных ранее перенесли пневмококковую инфекцию.
Об эффективности вакцинации обеими вакцинами свидетельствовало: повышение показателей средних значений уровня специфических антител; отсутствие низкого уровня антител у каждого вакцинированного пациента; повышение (до 75,0 — 100%) уровня IgG после вакцинации; увеличение до 100,0% доли показателей выше среднего уровня и возрастание уровня АТ в 1,6 — 3,7 раза.
Однако анализ полученных результатов позволил определить некоторые особенности иммунного ответа, обусловленные, вероятно, различной иммуногенно-стью и специфичностью в ИФА при применении двух вакцин.
При использовании в качестве антигена для ИФА вакцины Пневмо-23 показатели средних значений и кратности возрастания уровня АТ после иммунизации гомологичным препаратом были выше, чем при иммунизации вакциной Превенар-7, что, вероятно, свидетельствует о выявлении АТ к полисахаридам серотипов, не входящих в состав Превенар-7. Это предположение подтверждает также факт отсутствия диагностически значимого уровня антител к антигенам Превенар-7 в довакцинальном периоде в группе вакцинированных Пневмо-23 (0/8 против 1/8).
У двух из восьми пациентов после вакцинации Пневмо-23 уровень антител к антигенам этой вакцины не повысился (25%), вероятно, потому, что был достаточно высоким в довакцинальном периоде (80,1; 181,1 ед.). При этом, у всех детей этой группы указанный показатель после иммунизации превышал средние зна-
чения в довакцинальном периоде, и лишь у пяти из восьми (62,5%) человек после вакцинации Пневмо-23 уровень IgG к одноименным антигенам достигал диагностически значимого уровня >14 ед. ^ср.+25).
При использовании в качестве антигена для ИФА вакцины Превенар-7 установлено, что иммунизация обеими вакцинами приводила к возрастанию всех исследованных параметров гуморального иммунитета: в 100% повышался уровень антител, при этом, во всех случаях этот показатель превосходил средний уровень довакцинального периода; повышалась до 75% доля показателей выше диагностического уровня при вакцинации Пневмо-23 и до 100% при использовании одноименной вакцины. Указанные данные свидетельствуют о более высокой чувствительности ИФА на основе антигенов Превенар-7. Дополнительным подтверждением является выявление диагностически значимого уровня АТ у трех детей контрольной группы (7,3%) по сравнению с одним — при использовании антигенов Пневмо-23.
Основным способом борьбы с заболеваниями, вызываемыми пневмококком, является вакцинопрофилактика. Иммунитет у заболевших и привитых обеспечивается за счет образования антител к капсульным полисахаридам. Отсюда — все вакцины для профилактики пневмококковых заболеваний основным компонентом имеют те или иные капсульные полисахариды.
Наибольшее распространение в нашей стране получили вакцины: Пневмо-23, содержащая капсульные полисахариды 23 серотипов пневмококка (1, 2, 3, 4, 5, 6B,7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F и 33F) и Превенар-7, включающая конъюгированные с дифтерийным CRM 197 белком полисахариды 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F и 23F серотипов. Необходимость монитори-рования эффективности вакцинации побудила нас к проведению настоящего исследования.
Поскольку для изучения до- и поствакцинального иммунитета мы не располагали очищенными капсульными полисахаридами S.pneumoniae, на первоначальном этапе было решено воспользоваться для сорбции лунок полистирольных пластин в ИФА вакциной Пневмо-23. Суммарная концентрация полисахаридов составила 11,5 мкг/мл (или 0,5 мкг/мл в расчете на капсульный полисахарид каждого серотипа). Несмотря на то, что концентрация 11,5 мкг/мл примерно соответствует общепринятым значениям (5 — 10 мкг/мл), структура и общий заряд молекул некоторых полисахаридов вакцины могли не позволить им адсорбироваться на полистироле (для антигенов полисахаридной природы плохая сорбция очевидна). С помощью описанного иммуносорбента ранее в ИФА проведен анализ более 500 сывороток крови взрослых и детей разного возраста. Установлена точка отсечения отрицательных показателей ^ср.+25), которая составила 120 ед. [2]. В настоящем исследовании при анализе сывороток крови 41 невакциниро-ванного ребенка этот показатель также приближался к указанному значению (114 ед.).
Уровень антител, необходимый для защиты от пневмококковой инфекции, не установлен, хотя рекомендуют определять антитела при различных заболеваниях, вызванных S. pneumoniae. Имеются данные о том, что после вакцинации в течение 2 — 3 недель концентрация специфических антител может возрастать в два и более раза [7]. Исследования, проведенные нами, свидетельствуют, что применение в качестве антигена в ИФА вакцины Пневмо-23 улавливает примерно двукратное увеличение уровня IgG как после иммунизации детей одноименной вакциной, так и препаратом Превенар-7. При этом, специфичность теста (доля отрицательных реакций в контрольной группе) составила 97,6%, а чувствительность (доля положительных реакций в группе вакцинированных) — от 62,5 до 100% в зависимости от типа вакцинирующего препарата.
В отличие от Пневмо-23 суммарная концентрация капсульных полисахаридов при сорбции на полистироле вакцины Превенар-7 составила 0,32 мкг/мл, а доля каждого серотипового антигена — от 0,04 мкг/мл ( 4, 9V, 14, 19F, 23F, 18C) до 0,08 мкг/мл (6B). При применении антигенов вакцины Превенар-7 в ИФА точка отсечения отрицательных показателей также находилась на уровне 120 ед. Как в случае использования для сорбции антигенов Пневмо-23, так и Превенар-7 установлено, что иммунизация детей вакциной Превенар-7 приводила к 100% увеличению антител до диагностически значимых показателей. Это обстоятельство указывает на большую иммуногенность Превенар-7, а также свидетельствует о том, что ИФА на основе Превенар-7 не выявляет антител к белковому компоненту вакцины. Вероятно, белок, конъюгированный с капсульными полисахаридами пневмококка, обеспечивает высокую сорбционную способность компонентов вакцины Превенар-7 и при очень низких концентрациях делает доступным для взаимодействия со специфическими антителами каждый серотиповой полисахарид.
Высокая чувствительность ИФА на основе Превенар-7 (3 — 4-кратное увеличение уровня IgG после иммунизации обеими вакцинами; увеличение до 75% случаев при применении Пневмо-23 и до 100% при вакцинации Превенар-7 доли лиц, имеющих диагностически значимый уровень антител) и его высокая специфичность (92,7%) позволяют рекомендовать этот тест для изучения поствакцинального иммунитета у привитых как полисахаридными, так и конъюгированны-ми пневмококковыми вакцинами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов А.А., Намазова Л.С., Таточенко В.Н. Пневмококковая инфекция и связанные с ней заболевания — серьезная проблема современного здравоохранения. Педиатрическая фармакология. 2007, 5 (1): 7-12.
2. Ванеева Н.П., Ястребова Н.Е., Костинов М.П. Способ определения наличия поствакцинального иммунитета к антигенам вакцины «Pneumo-23». Патент РФ № 2331074, 10 августа 2008 г.
3. Галицкая М.Г., Намазова Л.С., Федосенко М.В. Пневмококковая инфекция. Новые возможности вакцинопрофилактики. Успехи современной педиатрии. 2008, 7 (3): 103105.
4. Падюков Л.Н., Харитоненков И.Г. Иммунодиагностика инфекций. В: Иммунология инфекционного процесса. В.И. Покровский, С.П. Гордиенко, В.И. Литвинов (ред.). М., 1994, с. 222-249.
5. Black S. et al. Postlicensure surveillance for pneumococcal invasive disease after use of hep-tavalent pneumococcal conjugate vaccine in Nothern California. Infect. Dis. J. 2004, 23: 485489.
6. Eskola J. et al. Efficacy of a pneumococcal conjugate vaccine acute otitis media. NEJM. 2001, 344 (6): 403-409.
7. Musher DM., Watson D.A., Baughn R.E. Does naturally acquired IgG antiboby to cell wall polysaccharide protect human subjects against pneumococcal infection? J. Infect. Dis. 1990, 161 (4): 736-740.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Ястребова Наталия Евгеньевна, д.м.н., 105064, Москва, М.Казенный пер., 5а, р.т. (495) 917-07-41
