ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ПАНЕЛИ ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ СЛЕДУЮЩЕГО ПОКОЛЕНИЯ AMPLI SEQ CANCER HOT SPOT V.2 У КАЗАХСТАНСКИХ ПАЦИЕНТОВ С ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ ПИЩЕВОДА Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

ОНКОЛОГИЯ И РАДИОЛОГИЯ ONCOLOGY AND RADIOLOGY

УДК. 616-006.61. 577.21

Опыт применения панели для секвенирования следующего поколения AmpliSeq Cancer HotSpot v.2 у казахстанских пациентов с плоскоклеточным раком пищевода

С.Е. Рахимова1, Д. Саматкызы1, У.А. Кожамкулов1, У.Е. Каиров1, А.С. Шарип1 , А.Б. Молкенов1 , Ю.В. Жуков2 , М.Х. Омаров2 , М.Е. Тулеутаев2, А.Р. Акильжанова1

'Назарбаев Университет, ЧУ «National laboratory Astana», Лаборатория геномной и Персонализированной медицины, г. Нур-Султан, Казахстан 2Многопрофильный медицинский центр акимата г.Нур-Султан

Плоскоклеточный рак пищевода является распространенным и смертельным заболеванием с неблагоприятным прогнозом среди злокачественных новообразований пищевода. Известно, что данная гистологическая форма рака возникает из клеток эпителия которые покрывают слизистую пищевода. Нами был проведен комплекс современных молекулярно-биологических методов исследований для таргетного секвенирования ДНК из опухолевой ткани. В данной статье приведены мутации выявленные в генах - мишенях в исследуемой выборке, характерные для плоскоклеточного рака пищевода.

Ключевые слова: Плоскоклеточный рак, таргетное секвенирование, мутации, Казахская популяция, ДНК-библиотеки, PTPN11, SMAD4

Введение

Рак пищевода - это мультифакториальное заболевание, которое занимает седьмое место среди наиболее часто диагностируемых злокачественных заболеваний в мире. Рак пищевода имеет два основных гистологических подтипа: аденокарцинома и плоскоклеточный рак пищевода [1]. В 2018 году по данным Global Cancer Statistics общее количество больных с впервые в жизни установленным раком пищевода составило 572,034 на 100 000 населения, что составило 3,2% в общей структуре онкологических заболеваний. Согласно данным исследований в Казахстане за 2017 год заболеваемость раком пищевода составило 6,8 на 100 000 населения [2]. За 2018 год, согласно данных Globocan (World health Organization) в Казахстане выявлено 1615 новых случая рака пищевода, зафиксировано 1261 смертельных случаев. Согласно многих источников именно данный подтип рака пищевода преобладает в Средней и Восточной Азии, преимущественно в Китае (88,84%) [3].

Плоскоклеточный рак пищевода (ПКРП), является смертельным заболеванием с неблагоприятным прогнозом. Пациенты с ПКРП имеют низкую 5-летнюю выживаемость (15%), преобладающей причиной смерти являются метастазы, которые наиболее часто затрагивают печень, легкие, регионарные лимфатические узлы, кости и надпочечники [4]. Основные симптомы заболевания - дисфагия, боли в грудной клетке, снижение веса проявляются чаще всего во II стадии заболевания (TNM классификация). Генетический анализ опухолевой ткани пациентов может привести к открытию новых потенциальных диагностических, прогностических и терапевтических маркеров [5].

Технология секвенирования нового поколения (NGS) успешно используется для исследования различных видов рака. Существует три основных типа NGS - секвенирования ДНК,

которые могут использоваться для идентификации геномных мутаций: секвенирование полного генома (WGS), секвенирование полного экзома (WES) и целевое секвенирование (TS) [6]. Таргетное секвенирование (TS) охватывает конкретные гены или регионы генома, ассоциация которых с тем или иным видом рака установлена. Преимуществом данного метода, является развитие разнообразия и удешевление существующих на сегодня методов обогащения целевых регионов, что в итоге отражается на стоимости исследования. На сегодняшний день обнаружен большой спектр геномных изменений при ПКРП с помощью технологий высокопроизводительного секвенирования, известны мутации в генах - TP53 (наиболее часто встречающаяся мутация при ПКРП), RB1, CDKN2A, PIK3CA, Notch1, NFE2L2, ADAM29 и FAM135B, MIR548K. [7]. Так же, методом полногеномного секвенирования, по последним данным, были выявлены мутации в генах ZNF750, FAT1, PTCH1, FAT2, FBXW7, KMT2D, NOTCH1 и TP63 [8]. Материалы и методы

На базе лаборатории проведен комплекс современных молекулярно-биологических методов исследования, включающих в себя: выделение ДНК из парафиновых блоков опухолевой ткани и ее качественная и количественная характеристика, подготовка библиотек для таргетного секвенирования, валидация библиотек и проведение секвенирования на платформе MiSeq.

В исследование были включены образцы ДНК от 5 пациентов с установленным диагнозом - плоскоклеточный рак пищевода. Протокол исследования, карты участников исследования и формы информированного согласия прошли одобрение в Локальной Этической комиссии ЦНЖ NLA (№20 от 22.09.2017). Характеристика образцов опухолевой ткани приведена в таблице 1.

_Вестник КазНМУ №3-2020

Таблица 1 - Характеристика участников исследования

Наименование Возраст Пол Основной диагноз Гистологическое

образца заключение

NU33 61 Женский С-r н/3 грудного отдела пищевода T3N1M0 III ст. Дисфагия III степени плоскоклеточный рак пищевода без ороговения

NU35 64 Мужской C-r среднегрудного отдела пищевода T1N1M0 ИБ ст. Остаточные явления после перенесенного туберкулеза легких умеренно Дифферен цированный плоско клеточный рак

NU37 80 Мужской C-r грудного отдела пищевода T2N0M0 IBst. Дисфагия 3-4 ст. умеренно дифферен цирован ный рак пищевода с ороговением

NU38 59 Мужской C-r грудного отдела пищевода Т2Н0М0 II ст. Полипоз желудка. ИБС, атеро-склеротический кардиосклероз плоско клеточный рак пищевода

NU48 50 Женский C-r нижнегрудного отдела пищевода Т2Н1М0 ЦБ ст. ИБС. АГ-III, риск III плоскоклеточный ороговевающий рак

ДНК из парафиновых блоков была выделена с использованием набора ReliaPrep™ FFPE gDNA Miniprep System (Promega). Все процедуры выполнены согласно протокола фирмы-изготовителя.

Подготовка библиотек проводилась согласно протокола AmpliSeq for Illumina Cancer HotSpot Panel v2 Reference Guide (Document #1000000039402v03, April, 2018). Панель AmpliSeq Cancer HotSpot v.2 охватывает около 2800 соматических мутаций hotspot регионов 50 целевых онкогенов и генов онкосупрессоров, представленных в базе COSMIC. Гены входящие в панель AmpliSeq Cancer HotSpot v.2: ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, EZH2, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11 GNAS, GNAQ, HNF1A, HRAS, IDH1, JAK2, JAK3, IDH2, KDR, KIT KRAS, MET, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53, VHL. Многие мутации онкогенов и генов онкосупрессоров могут быть выявлены на основе этой таргетной панели, отсутствие мутаций в исследуемых генах не исключает наличие таковых в других частях генов, которые не покрываются данной панелью.

Онкопанель AmpliSeq Cancer HotSpot v.2 состоит из 207 ампликонов с кумулятивным размером 22 kb, средняя длина ампликона около 106 п.н. В конечном итоге формируется 1 пул для парноконцевого чтения. Данная панель охватывает SNVs (single nucleotide variants) и indels (insertions/deletions). Валидация и нормализация библиотек проведена двумя походами на основе флуориметра Qubit с использованием интеркалирующего красителя и на основе чипа HS DNA Chip на платформе Bioanalyser/Agilent. Секвенирование проведено на оборудовании MiSeq/Illumina. Анализ результатов проведен на платформе BaseSpace/Illumina. Для сравнительного анализа и поиска известных мутаций были использованы базы данных COSMIC, ClinVar, NCBI. Результаты и обсуждение

Геномная ДНК, выделенная из парафиновых блоков согласно вышеприведенного протокола отвечала качественным и количественным критериям. Концентрация составляла 12-20 ng/ul. Далее, для выполнения таргетного секвенирования подготовлено 5 библиотек, проведена их нормализация и пулирование согласно протоколу изготовителя набора. Секвенирование проведено на платформе MiSeq, основные показатели приведены ниже в таблице 2.

Таблица 2 - Статистические показатели секвенирования

Прочтение Q score %>Q30 Плотность кластеров % кластеров, прошедших фильтр

Read 1 90,2% 92,4 489±13 96,98±0,46

Read 2 87,87

Totals 90,2% 90,14 489±13 96,98±0,46

Согласно, результатов, представленных в таблице 2 данные секвенирования хорошего качества, плотность кластеров оптимальна для использованного набора, практически все

кластеры прошли через фильтр (96,98±0,46). Результаты анализа качества секвенирования по каждому образцу представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Общая характеристика результатов секвенирования

наименование образца % Q30 bases uniformity of coverage (Pct>0.2*mean) % on target aligned read amplicon mean coverage

NU33 79,04 8,7 0,03 0.1

NU35 87,73 75,36 44,79 404.8

NU37 89,78 74,88 41,49 368.3

NU38 76,77 94,69 95,92 402.5

NU48 93,51 92,27 96,88 1073.1

Так как вышеуказанные показатели в таблице 3 оценивают в целом запуск прибора и весь пул библиотек, необходимо оценить конкретные библиотеки по отдельным образцам.

Поэтому оценивались показатели - Coverage Uniformity (однородность покрытия) и Percent On-Target Aligned Reads

(процент выравнивания таргетных регионов) представленные В таблицах 4 и 5 представлены основные генетические

в таблице 5. варианты, выявленные в исследуемых образцах.

Таблица 4 - Основные генетические варианты, идентифицированные на основе таргетного секвенирования образца NU38

Тип мутации Наименование гена dbSNP COSMIC ClinVar

SNV, missense PIK3CA rs2230461 C0SM1420971 benign

SNV, synonymous FGFR3 rs7688609

SNV, synonymous PDGFRA rs781449082

SNV, synonymous PDGFRA rs1873778 benign

SNV, synonymous PDGFRA rs2228230 C0SM22413 benign

Insertion KDR rs3214870 C0SN17154192

SNV, missense KDR rs1870377 C0SM149673 not provided

SNV, missense KDR rs757407936

SNV, Intron Variant KDR rs7692791 C0SN8870412

SNV, synonymous APC rs41115 C0SM3760869 benign

MNV HMGXB3 rs386693509

Deletion/intron variant NPM1 rs397792554

SNV, synonymous EGFR rs1050171 C0SM1451600 benign, likely benign

SNV, missense MET rs55985569 C0SM706 benign, likely benign

SNV, missense MET rs200074800 C0SM4644770 uncertain significance

SNV, synonymous RET rs1800861 C0SM4418405 benign

SNV, missense PTPN11 rs121918462 C0SM13019 pathogenic

stop_gained SMAD4 rs377767332 pathogenic

Согласно представленных данных в таблице 4, у образца NU38 выявлено 2 инсерции, 2 делеции и 62 CNVs вариантов. Следует отметить патогенные мутации, согласно базе данных С1^аг, выявлены в генах РТРЖ1(ге121918462) и SMAD4 (ГБ377767332).

Ген РТРЖ1 - ген семейства белков тирозинфосфатазы, нерецепторного типа 11 и относится группе онкогенов. Ген РТРЖ1 отвечает за синтез белка, который посредством SHP-2 белка регулирует пути передачи сигналов для RAS/MAPK сигнального пути, который в свою очередь связан с такими важными для клетки функциями как рост, деление (пролиферация), дифференциация и миграция клеток. Мутации в гене РТРЖ1 приводят к озлокачествлению клеток. В основном выявлены ассоциативные связи мутаций гена РТРЖ1 с развитием рака молочной железы, рака легких, рака печени, колоректального рака, рака простаты, реже при

плоскоклеточном раке пищевода [9-11]. Выявленный вариант миссенс мутаций в нашем образце ТЬ|г73Пе (218С>Т ) в гене РТРЖ1 согласно баз данных ОМ1М, С1^аг характерен для острого миелоидного лейкоза, синдрома Нунан, метахондроматоза и других заболеваний. Ген SMAD4 - ген семейства SMAD, факторов транскрипции, регулирует трансдукцию TGF-p и ингибирует пролиферацию клеток. Мутации в гене SMAD4 приводят к нарушению работы ТвР-р и вызывают потерю регуляции роста клеток, что лежит в основе канцерогенеза. Мутации в гене SMAD4 характерны для многих видов рака (рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников и толстого кишечника), в том числе и для плоскоклеточного рака пищевода [9-11]. По последним данным оба этих гена относят к группе генов, отвечающих за множественные типы рака, входящие в группу ^уег-генов.

Таблица 5 - Генетические варианты, идентифицированные на основе таргетного секвенирования образца NU48

Тип мутации Наименование гена dbSNP C0SMIC ClinVar

SNV, Intron Variant ERBB4 rs839541 C0SN19690034 not reported

SNV, synonymous FGFR3 rs7688609 likely benign allele

SNV, synonymous PDGFRA rs1873778 benign

SNV, synonymous KIT rs55986963 C0SM21983 benign

Insertion KDR rs3214870 C0SN17154192

SNV, Intron Variant KDR rs7692791 C0SN 8870412

SNV, synonymous APC rs41115 C0SM3760869 benign

multiple nucleotide variation HMGXB3 rs386693509 not reported

Deletion/intron variant NPM1 rs397792554

SNV, Intron Variant RET rs201492792

SNV, synonymous RET rs1800861 C0SM4418405 benign

SNV, Intron Variant FLT3 rs2491231 C0SM3999060

SNV, missense TP53 rs1042522 C0SM250061 benign ,uncertain significance,drug-response allele

SNV, Intron Variant STK11 rs2075606 C0SN 6666958

У образца NU48 было выявлено 1 инсерция, 1 делеция и 11 CNVs вариантов. Согласно данных, представленных в таблице 5 все обнаруженные генетические варианты были классифицированы как доброкачественные.

В целом, по результатам секвенирования из 5 образцов ДНК у двух образцов (NU38, NU48) на основе таргетной панели выявлены мутации. Была выявлена 1инсерция, 1 делеция и 11 CNVs вариантов для образца NU48 и 2 инсерции, 2 делеции и

Вестник КазНМУ №3-2020

62 CNVs вариантов для образца NU38, из них встречаются в обоих образцах мутации в генах PDGFRA, KDR, APC, RET, FGFR3 и др. У образца NU38 согласно сравнительному анализу с базой ClinVar выявлено 2 патологические мутации в генах PTPN11(rs121918462) и SMAD4 (rs377767332). Мутации в указанных генах характерны для плоскоклеточного рака пищевода. Выводы

Таким образом, технология секвенирования нового поколения при изучении плоскоклеточного рака пищевода будет способствовать разработке скрининговых, диагностических и прогностических мероприятий, разработке таргетной терапии на основе выявленных биомаркеров.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Li J., Wang X., Zheng K., Liu Y., Li J., Wang S., Liu K., Song X., Li N., Xie S., Wang S. The clinical significance of collagen family gene expression in esophageal squamous cell carcinoma // PeerJ. - 2019. - №7. - 7705 р.

2 Адильбек Н. Баймусанов, Адылжан С. Масадыков, Зухра С. Сиязбекова, Гульнар М. Шалгумбаева. Эпидемиология рака пищевода в республике Казахстан в 2008-2017 годах // Наука и здравоохранение - 2019. - №2, Т.21. - С. 83-90.

3 Weilin Pu, Chenji Wang, Sidi Chen, Dunmei Zhao, Yinghui Zhou, Yanyun Ma, Ying Wang, Caihua Li, Zebin Huang, Li Jin, Shicheng Guo, Jiucun Wang and Minghua Wang. Targeted bisulfite sequencing identified a panel of DNA methylation-based biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) // Clinical Epigenetics. - 2017. - №9. - 129 р.

4 Yanan Jiang, Jing Zhang, Jimin Zhao, Zhenzhen Li, Hanyong Chen, Yan Qiao, Xinhuan Chen, Kangdong Liu and Ziming Dong. TOPK promotes metastasis of esophageal squamous cell carcinoma by activating the Src/GSK3p/STAT3 signaling pathway via Y-catenin // BMC Cancer. - 2019. - №19. - 1264 р.

5 E. Visser, I. A. Franken, L. A. A. Brosens, W. W. J. de Leng, E. Strengman, J. A. Offerhaus, J. P. Ruurda, R. van Hillegersberg. Targeted next-generation sequencing of commonly mutated genes in esophageal adenocarcinoma patients with long-term survival // Diseases of the Esophagus. - 2017. - №30. -Р. 1-8.

Учитывая что, рак пищевода у каждого конкретного пациента индивидуален и содержит уникальный набор генетических мутаций, методы молекулярно-генетического

профилирования позволят получить информацию для более глубокого понимания сложных взаимодействий факторов внешней среды и генотипа, способствующих развитию и прогрессированию заболевания. Лечение плоскоклеточного рака пищевода может быть улучшено путем разработки таргетных препаратов, действие которых будет направлено на специфические молекулярно-генетические изменения обнаруженные у пациента.

Работа выполнена в рамках ГФ КН МОН РК: АР05134722

6 Findlay Bewicke-Copley a, Emil Arjun Kumar, Giuseppe Palladino, Koorosh Korfi, Jun Wang. Applications and analysis of targeted genomic sequencing in cancer studies // Computational and Structural Biotechnology Journal. - 2019. - №17. - P. 1348-1359.

7 Song Y., Li L., Ou Y., et al. Identification of genomic alterations in oesophageal squamous cell cancer // Nature. - 2014. -V.509. - P. 91-95.

8 Dutta M., Nakagawa H., Kato H., Maejima K., Sasagawa S., Nakano K., Sasaki-Oku A., Fujimoto A., Mateos R., Patil A., Tanaka H., Miyano S., Yasuda T., Nakai K., Fujita M. Whole genome sequencing analysis identifies recurrent structural alterations in esophageal squamous cell carcinoma // PeerJ. -2020. - №8. - 9294 p.

9 Lu1 J., Liu S., Qi B., Yao W., et al. Genetic Mutations in Human Esophageal and Gastric Cardia Cancers Detected by Ampliseq Sequencing // J Clin Med Genom. - 2015. - V.3. - P. 1-14

10 Singhi A.D., Foxwell T.J., Nason K., et al. Smad4 Loss in Esophageal Adenocarcinoma Is Associated With an Increased Propensity for Disease Recurrence and Poor Survival // Am J Surg Pathol. - 2015. - V.39(4). - P. 487-495.

11 Miura J.T., Xiu J., Thomas J., George B., et al. Tumor profiling of gastric and esophageal carcinoma reveal different treatment options // Cancer Biology & Therapy. - 2015. -V.16:5. - P.764-769.

С.Е. Рахимова1, Д. Саматкызы1, У.А. Кожамкулов1, У.Е. Каиров1, А.С. Шарип1 , А.Б. Молкенов1 , Ю.В. Жуков2 , М.Х. Омаров2 , М.Е. Тулеутаев2, А.Р. Акильжанова1 'Назарбаев Университетi, XK«National laboratory Astana», Геномдык, жэне дербестенд'р'лген медицина зертханасы, Нур-Султан, ^аза^стан. 2Нур-Султан к,аласы экiмдiгiнiн ШЖ^ «Кепсалалы медицина орталыт»

ЖАЛПАК ЖАСУШАЛЫ 0ЦЕШ КАРЦИНОМАСЫ БАР КАЗАКСТАНДЫК НАУКАСТАРДА ЖАН.А БУЫНДЫ СЕКВЕНИРЛЕУ AMPLISEQ CANCER HOTSPOT V.2 ПАНЕЛ1 ЭД1С1МЕН КОЛДАНУ ТЭЖ1РИБЕС1

ТYЙiн: 0нештн жалпак жасушалы карциномасы - бул енештн кlатерлi iсiктерi арасында кауiптi болжаммен жи кездесетiн жэне eлiмге экелетiн ауру. К,атерл! idicriH бул гистологиялык тYрi енештн беткi кабатын камтитын эпителий жасушаларынан пайда болатыны белгiлi. Бiз заманауи молекулалык - биологиялык зерттеу эдктерЫн, кешенiн жYзеге асырдык, сонын негiзiнде iсiк тiнi материалынан ДНК-

ны TapreTTi секвенирлеу эдiсiн еткык. Бул мак,алада 6i3 Казак,стандык, пациенттерден алынтан ДНК Yлriлepiндeri жалпак, жасушалы карциномасына сэйкес анык,талтан мак,сатты-гендер туралы хабарлаймыз. ТYЙiндi сездер: ецештн, жалпак жасушалы карциномасы, Таргетт секвенирлеу, мутациялар, казак популяциясы, ДНК кiтaпхaнaлapы, PTPN11, SMAD

S. Rakhimova1, D. Samatkyzy1, U. Kozhamkulov1, U. Kairov1, A. Sharip1 , A. Molkenov1 ,

Y. Zhukov2 , M. Omarov2 , M. Tuleutayev2, A. Akilzhanova1 Nazarbayev University, PI «National laboratory Astana», Laboratory of Genomic and Personalized Medicine, Nur-Sultan, Kazakhstan 2Multidisciplinary Medical Center of the akimat of Nur-Sultan City

THE EXPERIENCE OF APPLICATION AMPLISEQ CANCER HOTSPOT V.2 PANEL ON NEXT GENERATION SEQUENCING PLATFORM OF KAZAKHSTANI PATIENTS WITH ESOPHAGEAL SQUAMOUS-CELL CARCINOMA

Resume: Squamous-cell carcinoma of the esophagus is a common and fatal disease with a poor prognosis among malignant neoplasms of the esophagus. It is known that this histological form of cancer arises from epithelial cells that cover the esophageal mucosa. We have operated a complex of modern molecular biological research methods, as a result targeted

sequencing of DNA from tumor tissue was carried out. In this article, we report identified mutations in target genes, which are characteristic to squamous cell carcinoma in DNA samples from Kazakhstani patients.

Keywords: Squamous-cell carcinoma, targeted sequencing, mutations, Kazakhstani population, DNA library, PTPN11, SMAD