CC BY
42
УДК 616.36-008.12-036.72
ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ПАРАМЕТРОВ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ДИФФУЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ
Светлана Арсентьевна КУРИЛОВИЧ1, Маргарита Витальевна КРУЧИНИНА1,
Андрей Александрович ГРОМОВ1, Елена Геннадьевна НЕМЦОВА1,
Владимир Михайлович ГЕНЕРАЛОВ2, Талгат Сальманович БАКИРОВ2,
Махмуд Минахметович ШАКИРОВ3, Владимир Александрович РИХТЕР4,
Дмитрий Владимирович СЕМЕНОВ4
1 НИИ терапии СО РАМН
630089, г. Новосибирск, ул. Бориса Богаткова, 175/1
2 ФГУНГосударственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора 630559, пос. Кольцово, Новосибирская область
3 Институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН
630090, г. Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 9
4 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН 630090, г. Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8
В работе представлены результаты исследования множества параметров эритроцитов, включая их структурно-функциональные характеристики, полученные различными методами (капиллярная вискозиметрия, исследование удельной электропроводности, АТФазной активности мембран, двумерная тонкослойная хроматография, газохроматографический и хромато-масс-спектрометрический анализ, диэлектрофорез в неоднородном переменном электрическом поле, 13С, 31Р, 1Н ЯМР-спектроскопия) при диффузной патологии печени. Использование новых технологий, наряду с клиническими данными, позволяет сделать заключение по целому комплексу вопросов гепатологии (дифференциальная диагностика, оценка степени фиброза печени, генез, активность, осложнения заболевания, контроль эффективности проводимой терапии). Наиболее перспективным представляется метод диэлектрофореза эритроцитов как наименее трудоемкий, имеющий высокую пропускную способность и высокую информативность.
Ключевые слова: патология печени, эритроциты, методы диагностики.
Хроническая диффузная патология печени (ДПП) является широко распространенной с тенденцией к дальнейшему росту заболеваемости [1, 2]. Основными этиологическими факторами повреждения печени остаются вирусы
и алкоголь. Для алкоголя печень является основным органом-мишенью, поскольку в ней происходит метаболизм большей части этанола
[3]. Однако не у всех лиц, злоупотребляющих спиртными напитками, развивается клиничес-
Курилович С.А. — д.м.н., проф., зав. лабораторией гастроэнтерологии, e-mail: [email protected] Кручинина М.В. — д.м.н., ведущий научный сотрудник, сотрудник лаборатории гастроэнтерологии, e-mail: [email protected]
Громов А.А. — к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории клинических и биохимических исследований, e-mail: [email protected]
Немцова Е.Г. — аспирант, младший научный сотрудник лаборатории гастроэнтерологии, e-mail: [email protected]
Генералов В.М. — к.т.н., ведущий научный сотрудник, зав. лабораторией биофизического анализа, e-mail: [email protected]
Бакиров Т.С. — к.т.н., старший научный сотрудник лаборатории биофизического анализа, e-mail: [email protected]
Шакиров М.М. — старший научный сотрудник лаборатории биохимических и биофизических методов исследования, e-mail: [email protected]
Рихтер В.А. — к.б.н., зам. директора по научной работе, зав. лабораторией биотехнологии, e-mail: [email protected]
Cеменов Д.В. — к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии, e-mail: [email protected]
ки значимое поражение печени: частота выявления у них цирроза на вскрытии не превышает 10-15 %, в то время как у 1/3 изменения печени вообще отсутствуют. Инфицирование вирусами В и С лиц с хронической алкогольной интоксикацией, по данным эпидемиологического исследования, в 100 % случаев ассоциировано с наличием диффузного поражения печени. Еще одной злободневной проблемой становится неалкогольная жировая болезнь печени, которая также может прогрессировать в цирроз печени. Знание предикторов такого прогрессирования в различных популяциях чрезвычайно важно. Кроме того, при разной патологии печени, как приобретенной, так и наследственной, нередко наблюдается неконъюгированная (непрямая) гипербилирубинемия, требующая дифференциального диагноза. Поэтому вопросы современной и качественной диагностики и дифференциальной диагностики, влияния различных факторов на течение и прогноз болезни, установления степени фиброза (стадии болезни) весьма актуальны. Решение их возможно только на базе знаний патогенетических механизмов развития болезни под действием разных этиологических факторов.
Известно множество методов и подходов для диагностики ДПП, одни из которых позволяют определить этиологию процесса, его биохимическую, вирусологическую активность, другие - стадию заболевания, степень компенсации, выраженность фиброза, третьи позволяют определить наличие осложнений. Многие из диагностических методик обладают достаточной чувствительностью, специфичностью, стали «золотым стандартом» гепатологии, как, например, биопсия печени. Недостатками большинства методов являются, как правило, высокая трудоемкость, себестоимость, необходимость применения широкой номенклатуры различных ингредиентов, субъективизм, иногда противодействие со стороны пациента и т. д. [1, 2, 4].
Поэтому поиск новых подходов и методов верификации диагноза при ДПП остается «задачей номер один». С этой точки зрения весьма интересны структурно-функциональные параметры эритроцитов. Эритроцит - биологическая субстанция, которая обеспечивает транспорт кислорода и участвует в поддержании гомеостаза в органах и тканях организма. В силу своей многочисленности эритроциты преимущественно определяют основные физикохимические свойства крови. Поскольку между расстройствами функций печени и гомеостазом крови существует тесная связь, то для широкой клинической практики ценным диагностичес-
ким критерием состояния печени является использование характеристик эритроцитов. Кроме того, данные литературы свидетельствуют, что эритроцит можно рассматривать как универсальную модель для изучения изменений цитоплазматических мембран и метаболизма клеток организма, в том числе гепатоцитов [5, 6]. С другой стороны, клетки красной крови являются уникальными объектами для исследования, поскольку они легко доступны, достаточно устойчивы, «несут информацию» за последние 3-4 месяца, требуют минимальных затрат при исследовании, их показатели обладают достаточной чувствительностью и специфичностью, позволяют отразить целый комплекс показателей печени.
Цель настоящего сообщения - продемонстрировать возможности использования различных параметров эритроцитов для диагностики ДПП, чему была посвящена серия исследований, выполненных в лаборатории гастроэнтерологии НИИ терапии СО РАМН при комплек-сировании с различными учреждениями. Обследование пациентов выполнено с одобрения Комитета биомедицинской этики НИИ терапии СО РАМН.
В нормальной клеточной мембране формируется своеобразная, тонко сбалансированная система регуляции ее структуры и деятельности основных ферментных систем. Структурные перестройки в нормальной мембране зависят от температуры и при определенных условиях приводят к изменению электрических характеристик мембраны, показателей деятельности основных ферментных систем. Посредством термотропного фазового перехода обеспечивается, очевидно, связь между структурой и электрическими свойствами, функциями ферментов мембраны клетки. Поэтому первым шагом в наших исследованиях стало изучение структурно-функциональных свойств эритроцитов в зависимости от температуры, что позволило судить о тонких сдвигах в системе биополимеров под действием этанола при патологии печени алкогольного генеза. С целью обнаружения термотропных фазовых переходов в области +34-41 °С использовали метод капиллярной вискозиметрии взвесей эритроцитов, их «теней» и гемоглобина в зависимости от температуры [7]. Для определения №+, К+-АТФазной активности применяли способ, предложенный М.Ф. Некрасовой и соавт. [8]. Электрические свойства взвесей «теней» эритроцитов и гемоглобина определяли, используя устройство для измерения электропроводности биологических тканей и жидкостей [9].
У пациентов (n = 88, средний возраст 42,4 ± ± 2,2 года) наличие патологии печени сопровождалось повышением вязкости в высокотемпературной области (+38-41 °С) и увеличением абсолютных величин удельной электропроводности «теней» эритроцитов во всем интервале температур (р < 0,02) [10]. При этом абсолютные значения величин константы Михаэлиса-Мен-тен (Кт) и максимальной скорости гидролиза АТФ (Vmax) при исследовании АТФ-азной активности в области физиологических температур были достоверно ниже (р < 0,05), чем в группе контроля (n = 36, 38,4 ± 1,14 года) (рис. 1).
Характерным в подгруппах с наличием признаков патологии печени оказался фазовый переход при +39 °С, который регистрировался как в ранние, так и в отдаленные сроки абстиненции. Особенно убедительным это оказалось в подгруппе с явными признаками патологии печени, где даже спустя 3-4 недели после последнего алкогольного эксцесса перегиб при +39 °С наблюдался в 86,6 % случаев. Выраженность и длительность сохранения данного пика увеличивались по мере утяжеления патологии печени, что подтверждено и пошаговым регрессионным анализом. Углубление патологии печени коррелировало со смещением низкотемпературного пика в более низкотемпературную область (+36 °С - при умеренных, +35 °С - при явных признаках патологии печени) (r = +0,56, р < 0,02). При обследовании пациентов с различной степенью поражения печени все три метода исследования структурно-функциональных свойств эритроцитов оказались достаточно информативными, взаимно дополняя друг друга.
Поскольку состояние фазового перехода связано с перестройками как в белковых, так и в липидных компонентах, детальное исследование липидного спектра мембран у пациентов с алкогольным поражением печени позволило установить тонкие сдвиги в нем. Определение содержания фосфолипидов в эритроцитах проводили методом двумерной тонкослойной хроматографии по методу Шталь Э. [11], жирнокислотного состава мембран эритроцитов -методами газохроматографического и хроматомасс-спектрометрического анализа метиловых эфиров жирных кислот [11]. Мембраны эритроцитов выделяли по методике J.T. Dodge [12]. Липидный и жирно-кислотный состав мембран эритроцитов при алкогольном поражении печени (n = 54, 38,4 ± 1,14 года) характеризовался увеличением относительного содержания холестериновой фракции, насыщенных жирных кислот и более низким уровнем общих липидов и фосфолипидов, триглицеридов, эфиров
Т,°С
—О— с повреждением печени ....□— без повреждения печени
Рис. 1. Зависимость величины константы Михаэли-са-Ментен (Кп) от температуры (Т, °С) для N0+, К+-АТФазы эритроцитов с явными признаками поражения печени и без них. Достоверность отличий: * — от группы больных без повреждения печени, * — р<0,05, ** — р<0,01, *** - р<0,0001
холестерина и ненасыщенных жирных кислот (особенно полиненасыщенных - докозотетрае-новой, докозогексаеновой) по сравнению с контролем (р < 0,01-0,05). Соотношение концентраций холестерина и фосфолипидов возрастало за счет снижения уровня общих фосфолипидов (уменьшалось содержание фосфатидилхолина, фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина и сфингомиелина при увеличении относительного содержания лизофракций фосфолипидов) (р < 0,02-0,05) [13]. Доля полиненасыщенных жирных кислот среди всех жирным кислот в мембранах эритроцитов является высоко достоверным независимым маркером внезапной коронарной смерти [14], поэтому параметры эритроцитов весьма важны и для прогноза патологии, сопутствующей ДПП.
Изменения структуры мембран эритроцитов неизбежно приводят к изменениям их функциональных параметров. Изучение электрических и вязкоупругих характеристик эритроцитов проводили на четырех фиксированных частотах методом диэлектрофореза в неоднородном переменном электрическом поле. У пациентов с алкогольным поражением печени выявлены прямые взаимосвязи уровня холестериновой
фракции в мембранах эритроцитов с обобщенными показателями вязкости (г = +0,64, р < 0,02), жесткости (г = +0,47, р < 0,05), электропроводности (г = +0,57, р < 0,03) и обратные - с амплитудой деформации эритроцитов (г = -0,72, р < 0,01), поляризуемостью при частоте 106 Гц (г = -0,53, р < 0,05) [13, 15]. Полученные зависимости позволили судить об изменениях в структуре мембран эритроцитов по изменениям электрических и вязкоупругих параметров клеток красной крови.
Одной из важнейших проблем гепатологии является определение стадии заболевания, степени выраженности фиброза печени, скорости его прогрессирования, так как это, независимо от этиологического фактора, определяет прогноз болезни и выбор терапии. Характеристика стадии болезни в гепатологическом диагнозе является обязательным компонентом после этиологии и активности. Золотым стандартом оценки степени фиброза печени (стадии заболевания) остается морфологический (гистологический) метод, однако его инвазивность, необходимость пункционной биопсии печени, сложности интерпретации результатов при небольшом размере биоптата, неудовлетворительная воспроизводимость заключений, данных разными морфологами и т. д. стимулируют разработку неинвазивных или малоинвазивных способов оценки степени фиброза. Разработка метода диэлектрофореза эритроцитов в неоднородном переменном электрическом поле (ДЭФ в НПЭП) [16], а также ЯМР-спектроскопия и морфометрия эритроцитов позволяют предполагать наличие корреляций между некоторыми параметрами эритроцитов и степенью фиброза печени. Для доказательства этой гипотезы параметры эритроцитов были изучены вышеописанными методами в пилотном исследовании у 19 пациентов (от 35 до 60 лет) с ДПП различного генеза (вирусный, алкогольный, смешанный), с разной степенью фиброза печени по данным морфологического исследования. У 5 человек был легкий или умеренный фиброз ^1^2), у 14 - выраженный ^3-Р4), т. е. прецирротичес-кое состояние или цирроз печени. Группа сравнения ^0) состояла из 33 мужчин сопоставимого возраста, у которых при полном клиническом и инструментальном исследовании не выявлено признаков поражения печени и сердца.
Морфология эритроцитов исследовалась в мазках периферической крови, окрашенных по Романовскому в световом микроскопе стандартными методиками. При оценке морфологии эритроцитов была использована классификация Г.И. Козинца и Ю.А. Симоварта [17], к дефор-
мированным клеткам относили дегенеративно измененные эритроциты (формы с признаками дегенерации, причудливой формы, шизоциты, пойкилоциты).
Показатели морфометрии эритроцитов существенно отличались в зависимости от выраженности фиброза печени. Если в группе здоровых без фиброза ^0) дискоциты составляли 80-85 %, деформированные эритроциты -5-10 %, сфероциты - 10 % , то при нарастании фиброза наблюдалось снижение процентного содержания нормальных форм эритроцитов и рост числа патологических форм эритроцитов (рис. 2). Так, уже при наличии легкого или умеренного фиброза ^1-Р2) на долю дискоцитов пришлось только 55-60 %, на долю деформированных эритроцитов - 10-15 %, на долю сферо-цитов - 10 %, а 15 % составили триангулоциты, эхиноциты, стоматоциты и др. При выраженном фиброзе ^3^4) до 20-25 % возрастала доля деформированных эритроцитов, до 25-30 % -сфероцитов, и еще 10-15 % эритроцитов были асимметричными или двуямочными, нормальных двояковогнутых клеток оставалось всего 35-40 %. При этом отмечено набухание почти всех типов эритроцитов вследствие нарушения осмотического равновесия в крови.
ЯМР-спектроскопия также выявила ряд особенностей, свойственных выраженному фиброзу печени. Так, по данным 13С ЯМР-спектро-скопии, фиброз F3-F4 оказался ассоциирован с повышенными интенсивностями пиков, отражающих резонансы ряда неароматических аминокислот (химический сдвиг, миллионные доли): цистеина (174,2-57,3-26,0), глицина (173,0-42,0), глутаминовой кислоты (181,8—175,1-55,2-27,634,0), метионина (174,8-54,7-30,5-29,6-14,7) (р < 0,001-0,05), и сниженными площадями большей части остальных пиков спектра (2, 5-
12, 16, 18, 24, 26), содержащими резонансы как ароматических, так и неароматических аминокислот (р < 0,01-0,05).
При исследовании методом 31Р ЯМР-спектро-скопии у пациентов со степенью фиброза F3-F4 были больше площади резонансов глюкозо-6-фосфатов, АМФ, ИМФ, пирофосфатов, 2,3-ДФГ (р < 0,003-0,05) и меньше интенсивности резонансов АТФ (а, в и у), УТФ (а и у), НЬ- и М^-АТФ, в- и а-АДФ по сравнению с аналогичными в подгруппе пациентов со степенью фиброза F1-F2 (р < 0,0001-0,05). Большие по площади пост-у-АТФ-плато, пост-а-АТФ-плато достоверно чаще регистрировались у больных со степенью фиброза F3-F4 и в большинстве случаев (74,6 %) это было сопряжено с отрицательной клинической и биохимической динамикой.
Группа сравнения (БО) 1-я группа (Р1-Р2) 2-я группа (РЗ-Р4)
10 % 10-14 % 15 %
Рис. 2. Морфометрия эритроцитов при различной степени фиброза печени
Чувствительность ЯМР-спектроскопии эритроцитов ('Н, 13С, 31Р) для оценки степени фиброза печени составила 85,71 %, специфичность -80 %, прогностическая ценность положительного результата метода - 92,31 %, отрицательного -66,67 %, индекс точности - 84,21 %.
При изучении электрических и вязкоупругих характеристик эритроцитов оказалось, что у больных со степенью фиброза F3-F4 преобладали деформированные, предгемолитические формы эритроцитов (р < 0,05) (см. рис. 2). У этих пациентов была больше доля клеток с положительным диэлектрофорезом и поляризуемость на высоких частотах 0,5 и 1 МГц (р < 0,001-
0,05), меньше - поляризуемость клеток на низких частотах (0,05 и 0,1 МГц) (р < 0,01-0,001). При степени фиброза F3-F4 были увеличены значения обобщенных показателей жесткости, вязкости, среднего радиуса, индекса агрегации, деструкции, а также электрической проводимости мембраны эритроцитов и снижены амплитуды деформации под действием НПЭП (р < 0,001-0,05) (рис. 3).
Диагностическая точность метода диэлектрофореза эритроцитов в определении степени
фиброза печени оказалась удовлетворительной: 68,42 % при чувствительности 71,43 %, специфичности 60 %, прогностической ценности положительного результата 83,33 %, отрицательного - 42,86 %.
Для различной степени фиброза печени рассчитаны дискриминирующие значения интегральных интенсивностей резонансов ЯМР-спектров, электрических и вязкоупругих характеристик эритроцитов.
Таким образом, данные, полученные с помощью неинвазивных аппаратных методов (ДЭФ эритроцитов в НПЭП и ЯМР-спектроскопия), позволяют делать заключения о стадии ДПП (т. е. степени выраженности фиброза печени) [16, 18 -24]. Кроме того, исследование параметров эритроцитов данными методами позволило выявить особенности биохимической активности процесса, связанные с генезом заболевания. Установленные корреляции между показателями диэлектрофореза и ЯМР-спектроскопии отражают патогенетические сдвиги в мембранах клеток.
У пациентов с различной этиологией процесса наблюдалось изменение положения рав-
Рис. 3. Разделение и деформация эритроцитов у лиц: а — группы сравнения; Ь — больных со степенью фиброза Г1-Г2; с, й — больных со степенью фиброза Г3-Г4 в неоднородном переменном электрическом поле при частотах: а, Ь, с — 1 МГц, й — 0,1 МГц
Область отрицательного диэлектрофореза
г г 1 1 • я 4 5/ и б/ 7 8 ^СО (Нг) ^ / Область \ / положительного я’ диэлектрофореза Равновесные частоты
Рис. 4. Зависимость степени поляризации эритроцитов от частоты неоднородного переменного электрического поля. Показаны положения равновесных частот: 1 — у больных с хроническими вирусными гепатитами, 2 — у лиц группы сравнения, 3 — у больных с алкогольным поражением печени
новесной частоты в НПЭП: при вирусной этиологии процесса равновесная частота была достоверно чаще (р < 0,05) смещена в область более низких частот (0,1 МГц), в то время как при алкогольном и смешанном генезе заболевания - напротив, в область более высоких частот (более 0,5 МГц) при условии одинакового представительства разных стадий заболевания в группах (рис. 4).
Наиболее жесткими, вязкими и плохо деформируемыми оказались эритроциты больных с патологией печени алкогольного и смешанного генеза, достоверно отличаясь по этим параметрам от клеток пациентов с поражениями печени вирусами гепатита С и В (р < 0,0001-0,05) (см. таблицу). Получены высокодостоверные сильные обратные корреляции жесткости эритроцитов и амплитуды деформации (г = -0,78, р < 0,002). Соответственно, индекс агрегации эритроцитов в растворе диэлектрика был наибольшим при алкогольном и смешанном генезе заболевания.
Высокая электропроводность мембран и относительная поляризуемость прямо коррелировали с показателями, характерными для синдрома цитолиза (АсАТ, АлАТ; концентрация в сыворотке крови железа), воспалительного синдрома (изменение белково-осадочных проб, повышение уровней ^О, ^М, ^А) и синдрома печеночно-клеточной недостаточности (снижение содержания в сыворотке крови общего белка, особенно альбуминов, протромбина, холестерина) и обратно - с биохимическими проявлениями синдрома холестаза (повышение активности экскреторных ферментов щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтранспептидазы). Гипербилирубинемия с повышением содержания как прямой, так и непрямой фракций ока-
залась обратно связанной с величиной среднего радиуса эритроцитов (для общего билирубина г = -0,916, р < 0,004; для прямого билирубина г = -0,859, р < 0,013; для непрямого билирубина г = -0,847, р < 0,016). Повышение уровня общего холестерина положительно коррелировало с жесткостью клеток, а содержание холестерина липопротеинов высокой плотности - с электропроводностью мембран (г = +0,259, р < 0,05) и относительной поляризуемостью (г = +0,272, р < 0,042).
Наиболее убедительные корреляции электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов получены с резонансами карбоксильной, олефиновой, областей замещенных метилом групп на 13С ЯМР-спектрах взвесей эритроцитов. Величины поляризуемости, долей клеток с положительным и отрицательным диэлектрофорезом продемонстрировали разнонаправленный характер связей с характеристиками резонансов углеродного спектра, зависящий от частоты НПЭП. Обратные корреляции между величинами интенсивности сигналов АТФ (а, в и у, НЬ-АТФ, Мg-АТФ) и значениями электропроводности, относительной поляризуемости, жесткости, среднего радиуса, индекса агрегации, вязкости и прямые связи - с амплитудой деформации эритроцитов под действием НПЭП являются отражением сниженной способности клеток к деформации при уменьшении в них запасов макроэргических соединений. Корреляции с интенсивностью монофосфатных пиков, высотой 2,3-дифосфоглицерата, неорганических фосфатов и окружающих их пиков свидетельствуют о включении компенсаторных механизмов по мере прогрессирования патологического процесса. У пациентов с алкогольным поражением печени проявились обратные зависимости между электропроводностью, относительной поляризуемостью, жесткостью, средним радиусом, индексом агрегации, вязкостью и высотой пиков у-УТФ , а-АДФ, интенсивностью резонанса а-УТФ, причем сила связей возрастала по мере утяжеления процесса в печени [15, 19, 20].
В последующем детальное изучение фракционного состава фосфолипидной фракции мембран эритроцитов и динамики электрических и вязкоупругих характеристик эритроцитов при ДПП на фоне фосфолипидзамещающей терапии послужило патогенетическим основанием назначения эссенциальных фосфолипидов (ЭФЛ) при этой патологии. У 38 пациентов (возраст от 36 до 57 лет) с хроническим гепатитом вирусного, алкогольного и смешанного генеза были исследованы фосфолипидный состав мембран эритроцитов и электрические и вязкоупругие
Таблица
а
к
е
п
и
и
г
о
лоо
т
п
й
о
н
Л
/Й ^ е
ин
пе
І I § ^
1 I
ио
»■ ^
£ -Н
I 8
р
Ё 'з
§ с* о ^ ин ре ег ^ ?
V
5 с рн
о* £ хи хл ^ £
а
е
у
и
р
т
е
§
а
р
е
и
к
£
&
я
сц
Индекс деструкции эритроцитов, % < < < < < < ОО 'О * * ОО * * +1 +1 'Ч ^ с-- гч о о <4 +1 +1 ^ ^ 40 00~
Емкость клеточной мембраны, 10-14 Ф < < •г £ ^ о оо | ^ ^ £ со сК ^ г- £ со О О ^ т гч ^
Электропроводность, 10-5 см/м < < ^ СО О * ^ о * ^ ГЧ СО О 1.П -н -н -Н Г— ОО її ^ С ■ СО
Поляризуемость при 106 МГц, 10-15 м3 < < ^ і І ^ ^ 00 о о о ^ -Н -Н !! сэ г~ ^ 5 ^ ^ ^ 40 сэ о
Амплитуда деформации эритроцитов при 106 МГц, 10-6 м < < < о * < ^ 40 * СО -н щ ГЧ <Э СЭ ^2 “Н ^ СО ^ ^ ° о
Обобщенный показатель вязкости, Па • с 0,70 ± 0,180і 0,71 ± 0,125 0,97 ± 0,178 1,05 ± 0,170*л
Индекс агрегации эритроцитов, усл. ед. ^ СО ^ СЧ СО ГЧ ^ СО ,0 ,0 ,0 ,0 0, 0, 0, 0, -н -н -н -н ^ о ^ ,5 ,5 ,6 ,7 0, 0, 0, 0,
Обобщенный показатель жесткости, 10-6 Н/м л о оо 1 0 0 1, ,9 -и -и -н ,7 ,0 ,73 ,1 ^ ^ 0^
Группа больных (этиология поражения печени) 1-я (вирус гепатита В, п = 31) 2-я (вирус гепатита С, п = 28) 3-я (смешанный генез, п = 34) 4-я (алкогольное поражение, п = 53)
И параметры эритроцитов в динамике лечения
ЭФЛ. На фоне курсовой терапии ЭФЛ отме-
§ ^ чено достоверное увеличение пластичности,
я £ поляризуемости, емкости, скорости движения
о || эритроцитов к электродам и снижение величин
3 2 обобщенных показателей вязкости, жесткости,
§ [3 электропроводности, индексов агрегации и де-
° [3
V щ
«г Е-
5 с
в « ран гепатоцитов и служить патогенетическим
О
о о"
V ^ 5
5 <
^ <
В ев
&
- ^ £
КМси сен (1
^ (О ь
струкции (р < 0,001-0,05), что может отражать улучшение функционального состояния мемб-
обоснованием применения ЭФЛ. Особенно выраженным оказалось изменение электрической емкости мембран эритроцитов (р < 0,001), отражающей степень диспротеинемии при ДПП. Получены прямые корреляции этого показатели я ля с уровнем альбуминов (г = 0,511, р < 0,044)
® 5 и обратные с содержанием гамма-глобулинов
* з (г = -0,476, р < 0,05). В динамике лечения отме-
1/-г § чено снижение активности трансаминаз, кото-
<= ° рые зависели от электроповодности (г = 0,927,
а, £ р < 0,003 для АлАТ иг = 0,520, р < 0,048 для
Ц & АсАТ) и поляризуемости (г = -0,908, р < 0,005
с I | <
* . <
я д" эритроцитов может быть использована не толь-
га § ко для диагностики ДПП, но и для контроля за
5 V эффективностью проводимой терапии.
я Изучение особенностей электрических и
и ® вязкоупругих параметров эритроцитов у па-
^ циентов с непрямыми гипербилирубинемиями
" ч-т § позволило использовать полученные данные
“ сг сэ в целях дифференциальной диагностики [26].
Й а а В исследование включено 28 пациентов (муж-
^ И Л чины в возрасте от 17 до 67 лет) с непрямыми
6 с и |
для АлАТ и г = -0,63, р < 0,004 для АсАТ) [25]. Таким образом, методика диэлектрофореза
гипербилирубинемиями, 20 из которых (71,4 %) < . ^ наблюдались с диагнозом «синдром Жильбера», оставшиеся - с диагнозом «непрямая ги-
и § пербилирубинемия неясного генеза». Группа
больных с непрямыми гипербилирубинемиями разнородна по поведению эритроцитов в неоднородном переменном электрическом поле. Для пациентов с синдромом Жильбера характерны
| ^ ^ умеренно сниженная пластичность эритроци->3 а о, тов на фоне слегка повышенных обобщенных
« 13 \/ показателей вязкости, жесткости, емкости и
н2 ^
Ой ^
(О & ®
^ а с ный лизис эритроцитов на низких частотах с | § ^ последующей умеренно повышенной агрегаци-о Ц о ей клеток по сравнению с группой контроля и
электропроводности мембран клеток, единич-
больных с эритроцитарными непрямыми гипер-билирубинемиями (р < 0,0001-0,05). Для паци-« о ентов, непрямая гипербилирубинемия которых (а о т определяется состоянием эритроцитов, типична Е з я значительно сниженная поляризуемость на всех ^ частотах, резко повышенная склонность клеток ч (я к гемолизу и образованию агрегатов при сохра-
ненной или слегка сниженной деформируемости эритроцитов (р < 0,001-0,02). Высокие значения индекса деструкции на всех частотах определяют высокие значения индекса агрегации, поскольку высвобождающийся при разрушении эритроцитов АДФ является мощным индуктором образования агрегатов, в том числе и лей-коцитарно-тромбоцитарных [27].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, исследование параметров эритроцитов, включая их структурно-функциональные характеристики, различными методами (капиллярная вискозиметрия, исследование удельной электропроводности, АТФазной активности мембран, двумерная тонкослойная хроматография, газохроматографический и хро мато-масс-спектрометрический анализ, диэлектрофорез в НПЭП, 13С, 31Р, 1Н ЯМР-спектро-скопия) позволяет, наряду с клиническими данными, сделать заключение по целому комплексу вопросов при диффузной патологии печени, в частности, решить некоторые вопросы дифференциальной диагностики, оценить степень фиброза печени, контролировать эффективность проводимой терапии. Наибольшую ценность, на наш взгляд, представляет метод диэлектрофореза эритроцитов в НПЭП как наименее трудоемкий, имеющий высокую пропускную способность и высокую информативность.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гастроэнтерология. Национальное руководство / Под ред. В. Т. Ивашкина, Т.Л. Лапиной. М., 2008. 700 с.
Gastroenterology. National guidance / Eds. V.T. Ivashkin, T.L. Lapina. M., 2008. 700 p.
2. Подымова С.Д. Болезни печени. М., 1993. 544 с.
Podymova S.D. Liver diseases. M., 1993. 544 p.
3. Маевская М.В. Патогенез алкогольной болезни печени и роль генетической предрасположенности в ее развитии // Клинич. перспективы гастроэнтерол., гепатол. 2004. (5). 2-11.
Maevskaya M. V. Pathogenesis of alcoholic liver disease and the role of genetic predisposition to its development // Klinich. perspektivy gastroenterol., gepatol. 2004. (5). 2-11.
4. Руководство по лабораторным методам диагностики / Под ред. проф. А.А. Кишкуна. М., 2007. 800 с.
Guidelines for laboratory diagnostic techniques / Ed. prof. A.A. Kiskun. M., 2007. 800 p.
5. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. М., 1997. 624 c.
Gennis P. Biomembranes: Molecular structure and function. M., 1997. 624 p.
6. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е. А. Физиология и патофизиология эритроцита. Томск, 2004. 202 c.
Novitsky V.V., Ryazantseva N.V., Stepovaya E.V. Physiology and pathophysiology of the erythrocyte. Tomsk, 2004. 202 p.
7. Куницын В.Г., Хавин П.П., Куимов А.Д. Реологические свойства взвесей эритроцитов больных острым инфарктом миокарда в области физиологических температур // Бюл. экспер. биол. мед. 1983. (5). 64-67.
Kunitsyn V.G., Khavin P.P., Kuimov A.D. Rheo-logical properties of suspensions of red blood cells of patients with acute myocardial infarction in the field of physiological temperature // Byul. exper. biol. med. 1983. (5). 64-67.
8. Некрасова М.Ф. Структура и функции эрит-роцитарных мембран в норме и при поздних токсикозах беременных отечно-нефротического ряда: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Новосибирск, 1988.
Nekrasova M.F. Structure and function of erythrocyte membranes in normal and late toxicosis of edematous-nephrotic range pregnants: abstract of thesis ... candidate of medical sciences. Novosibirsk, 1988.
9. Пат. 2076621 РФ. Способ воздействия вращающимся электрическим полем низкой частоты на лабораторных животных / А.Д. Белкин, Р.Ш. Ибрагимов; опубл.10.04.1997.
Patent 2076621 RF. Method of exposure of rotating electric field of low frequency to laboratory animals / A.D. Belkin, R.Sh. Ibragimov; published 10.04.1997.
10. Куницын В.Г., Курилович С.А., Волчен-ко М. В. Изменение удельной электропроводности «теней» эритроцитов и гемоглобина при алкоголизме // Бюл. экспер. биол. мед. 1993. (12). 595598.
Kunitsyn V.G., Kurilovich S.A., Volchenko M.V. Changing the conductivity of «shadows» of red blood cells and hemoglobin at alcoholism // Byul. exper. biol. med. 1993. (12). 595-598.
11. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов: Пер. с англ. М., 1975. 536 с.
Kates M. Technique of lipidology. Isolation, analysis and identification of lipids: Trans. from English. M., 1975. 536 p.
12. Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan D.J. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes // Arch. Bio-chem. Biophys. 1963. 100. 118-130.
13. Кручинина М.В., Курилович С.А., Громов А.А. и др. Алкогольное поражение печени: взаимосвязь электрических, вязкоупругих характеристик эритроцитов и структуры их мембран // Вестн. НГУ 2008. 6. (2). 96-103.
Kruchinina M.V., Kurilovich S.A., Gromov A.A. et al. Alcoholic liver disease: correlation between electrical, viscoelastic properties of red blood cells
and the structure of their membranes // Vestn. NGU.
2008. 6. (2). 96-103.
14. De Backer G., Ambrosioni E., Borch-John-sen K. et al. European guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. Third Joint Task Force of European and Other Societies on Cardiovascular Disease Prevention in Clinical Practice // Eur. Heart. J. 2003. 24. 1601-1610.
15. Kyрилович С.А., ^учинина М.В., Генералов В.М. и др. Электрические параметры и структура мембран эритроцитов при диффузных заболеваниях печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2009. ХІХ. (2). 30-36.
Kurilovich S.A., Kruchinina M.V., Generalov V.M. et al. Electrical parameters and the structure of erythrocyte membranes in diffuse liver diseases // Ros. zhurn. gastroenterol., gepatol., koloproktol.
2009. XIX. (2). 30-36.
16. Пат. 2296327 РФ. Способ дифференциальной диагностики заболеваний печени I В.М. Генералов, Т.С. Бакиров, А.В. Пак и др.; опубл. 27.03.2007.
Patent 2296327 RF. Method of differential diagnosis of liver diseases / V.M. Generalov, T.S. Bakirov, A.V Pak et al.; published 27.03.2007.
17. Kзинец Г.И., Симоварт Ю.А. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови в норме и при заболеваниях системы крови. Таллин: Валгус, 1984. 116 с.
Kozinets G.I., Simovart Yu.A. Surface architectonics of peripheral blood cells in health and blood system disorders. Tallin: Valgus, 1984. 116 p.
18. Kfyучинина М.В., Kyрилович С.А., Парулико-ва М.В., Шакиров М.М. ЯМР-спектроскопия эритроцитов у больных с патологией печени (предварительные результаты) // Эксперим. клинич. гастроэнтерол., гепатол. 2003. Прил. 2. 28-33.
Kruchinina M. V., Kurilovich S.A., Parulikova M.V., Shakirov M.M. NMR spectroscopy of red blood cells in patients with liver pathology (preliminary results) // Experim. klinich. gastroenterol., gepatol. 2003. Suppl. 2. 28-33.
19. ^учинина М.В., Kрилович С.А., Парули-кова М.В. и др. Особенности вязкоупругих и электрических характеристик эритроцитов у больных с гепатитами и циррозами печени // Материалы 5-й Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием «Кли-нико-эпидемиологиче^ие и этноэкологические проблемы заболеваний органов пищеварения». Красноярск, 2005. 230-238.
Kruchinina M.V., Kurilovich S.A., Parulikova M. V. et al. Features of the viscoelastic and electrical properties of red blood cells in patients with hepatitis and cirrhosis // Proceedings of the 5th East-Siberian gastroenterology conference with international participation «The clinical, epidemiological and ethno-
environmental problems of digestive diseases». Krasnoyarsk, 2005. 230-238.
20. ^учинина М.В., Kрилович С.А., Парулико-ва М.В. и др. Электрические и вязкоупругие свойства эритроцитов у больных с диффузной патологией печени // Докл. АН. 2005. 401. (5). 701-704.
Kruchinina M.V., Kurilovich S.A., Parulikova M. V. et al. Electric and viscoelastic properties of red blood cells in patients with diffuse hepatic pathology // Dokl. AN. 2005. 401. (5). 701-704.
21. ^учинина М.В., Kрилович С.А., Парули-кова М.В. и др. Вязкоупругие и электрические характеристики эритроцитов при различной степени фиброза печени // Вестн. НГУ. 2005. 3. (4). 43-52.
Kruchinina M. V., Kurilovich S.A., Paruliko-va M. V. et al. Viscoelastic and electrical characteristics of erythrocytes in varying degrees of hepatic fibrosis // Vestn. NGU. 2005. 3. (4). 43-52.
22. ^учинина М.В., Kрилович С.А., Парулико-ва М.В. и др. 31Р ЯМР-спектроскопия эритроцитов и фиброз печени: пилотное исследование // Бюл. СО РАМН. 2006. (4). 23-28.
Kruchinina M.V., Kurilovich S.A., Parulikova M. V. et al. 31P NMR spectroscopy of red blood cells and liver fibrosis: a pilot study // Byul. SO RAMN. 2006.
(4). 23-28.
23. Kruchinina M.V., Generalov V.M., Kurilovich
S.A. et al. Viscoelastic and electric characteristics of erythrocytes at different degrees of hepatic fibrosis // J. Global Toxin Rev. 2007. 10. 25-36.
24. ^учинина М.В., Kрилович С.А., Шакиров M.M., K^лагина Е.А. 13С ЯМР-спектроскопия эритроцитов в диагностике фиброза печени: пилотное исследование // Материалы 8-й Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием «Клинико-эпидемиологические и этноэкологические проблемы заболеваний органов пищеварения». Красноярск, 2008. 297-303.
Kruchinina M.V., Kurilovich S.A., Shakirov M.M., Kulagina E.A. 13C NMR spectroscopy of erythrocytes in the diagnosis of liver fibrosis: a pilot study // Proc. 8th East-Siberian gastroenterology conference with international participation «The clinical, epidemiological and ethno-environmental problems of digestive diseases». Krasnoyarsk, 2008. 297-303.
25. Kypилович С.А., ^учинина М.В., Громов А. А. и др. Обоснование применения эссенциальных фосфолипидов при хронических заболеваниях печени: динамика электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов // Эксперим. клинич. гаст-роэнтерол. 2010. (11). 46-52.
Kurilovich S.A., Kruchinina M.V., Gromov A.A. et al. Substantiation for the use of essential phospholipids in chronic liver diseases: dynamics of electrical and viscoelastic parameters of erythrocyte // Experim. klinich. gastroenterol. 2010. (11). 46-52.
26. Кручинина М.В., Курилович С.А., Светлова И.О. и др. Диэлектрофорез эритроцитов: новые возможности в диагностике непрямых гипербили-рубинемий // Бюл. СО РАМН. 2009. (3). 29-35.
Kruchinina M.V., Kurilovich S.A., Svetlova I.O. et al. Dielectrophoresis of red blood cells: new possi-
bilities in the diagnosis of indirect hyperbilirubinemia // Byul. SO RAMN. 2009. (3). 29-35.
27. Исследование системы крови в клинической практике / Под ред. Г.И. Козинца, В.А. Макарова. М., 1997. 480 с.
The blood system investigation in clinical practice / Eds. G.I. Kozinets, V.A. Makarov. M., 1997. 480 p.
EXPERIENCE IN APPLYING NEW TECHNOLOGIES FOR LEARNING COMPLEX OF PARAMETERS OF ERYTHROCYTES AT DIFFUSE LIVER DISEASES
Svetlana Arsentevna KURILOVICH1, Margarita Vitalievna KRUCHININA1,
Andrey Aleksandrovich GROMOV1, Elena Gennadievna NEMTSOVA1,
Vladimir Mikhailovich GENERALOV2, Talgat Sal’manovich BAKIROV2,
Makhmud Minakhmetovich SHAKIROV3, Vladimir Aleksandrovich RIKHTER4,
Dmitry Vladimirovich SEMENOV4
1 Institute of Internal Medicine SB RAMS 630089, Novosibirsk, Boris Bogatkov str., 175/1
2 Federal Service for Surveillance in Consumer Rights Protection and Human Welfare Federal State Unitary Enterprise State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector»
630559, Novosibirsk region, Novosibirsk district, Koltsovo
3 N.N.Vorozhtsov Novosibirsk Institute of Organic Chemistry SB RAS 630090, Novosibirsk, AkademikLavrentiev av., 9
4 Institute of Chemical Biology and Fundamental medicine SB RAS,
630090, Novosibirsk, Akademik Lavrentiev av., 8
The results of the study on parameter set of red blood cells, including their structural and functional characteristics obtained with different methods (capillary viscometry, study of conductivity, investigation of membranes ATPase activity, two-dimensional thin-layer chromatography, gas-chromatography and gas chromatography-mass spectrometry analysis, dielectrophoresis in a nonuniform alternating electric field, 13C, 31P and JH NMR spectroscopy) at diffuse liver disease have been presented. Using new technologies along with clinical data allows us to conclude on a range of issues of Hepatology, in particular to solve some problems of differential diagnosis, to assess the degree of liver fibrosis (with fairly high levels of sensitivity and specificity), the genesis of the activity, the complications of the disease, the therapy effictieveness control. The most promising method of erythrocytes dielectrophoresis being the least labor-consuming has high throughput and information capacity.
Key words: liver pathology, erythrocytes, diagnostic methods.
Kurilovich S. A. - doctor of medical sciences, professor, head of the laboratory of gastroenterology, e-mail: [email protected]
Kruchinina M.V. - doctor of medical sciences, leading researcher of the laboratory of gastroenterology, e-mail: [email protected]
Gromov A.A. - candidate of medical sciences, senior researcher of the laboratory of clinical and biochemical studies, e-mail: [email protected]
Nemtsova E.G. - postgraduate student, junior researcher of the laboratory of gastroenterology, e-mail: [email protected]
Generalov V.M. - candidate of technical sciences, leading researcher, head of the laboratory of biophysical analysis, e-mail: [email protected]
Bakirov T.S. - candidate of technical sciences, senior researcher of the laboratory of biophysical analysis, e-mail: [email protected]
Shakirov M.M. - senior researcher of the laboratory of biochemical and biophysical research methods, e-mail: [email protected]
Richter V.A. - candidate of biological sciences, deputy director for research, head of the laboratory of biotechnology, e-mail: [email protected]
Semenov D.V. - candidate of biological sciences, senior researcher of the laboratory of biotechnology, e-mail: [email protected]
