CC BY
86
Опыт молекулярно-генетического анализа при наследственных болезнях нервной системы в Республике Таджикистан
Н.Ю. Абрамычева, Р.А. Рахмонов, Т.В. Мадаминова, М.С. Степанова
В статье представлены результаты молекулярно-генетического анализа семей с наследственными болезнями нервной системы, зарегистрированными на территории Гиссарского района Таджикистана. Впервые в указанной популяции идентифицировны на ДНК-уровне следующие молекулярные формы заболеваний: спиноцеребеллярная атаксия 2-го типа (ген АТХЫ2), болезнь Фридрейха (ген ГХЫ), наследственная спастическая параплегия 4-го типа (ген БРАЭТ). Полученный опыт клинико-генетических сопоставлений и дальнейшее расширение таких исследований должны стать основой для совершенствования системы медико-генетического консультирования семей с наследственными болезнями нервной системы и профилактики наследственной неврологической патологии в Республике Таджикистан. Ключевые слова: наследственные болезни нервной системы, молекулярно-генетический анализ, мутации, ДНК-диагностика, Республика Таджикистан.
Чрезвычайно сложной проблемой современной клинической неврологии, имеющей несомненную социальную значимость, остаются наследственные болезни нервной системы (НБНС) [1]. Это связано не только с их тяжелым течением, нередким фатальным исходом и отсутствием патогенетических методов лечения, но и с выраженным клинико-генетическим полиморфизмом основных групп НБНС. Так, для болезни Паркинсона в настоящее время известно уже более 20 самостоятельных генетических ло-кусов, сходная ситуация характерна также для наследственных дистоний, спиноцеребеллярных атаксий (СЦА) и других наследственных заболеваний [2-8].
Важно отметить, что, несмотря на относительную редкость отдельных нозологических форм НБНС, их общая распространенность довольно высокая. Об этом свидетельствуют результаты многочисленных популяционных исследований [9-12]. При этом в конкретных популяциях может наблюдаться особенно высокая концентрация случаев определенных форм патологии: ярким примером является чрезвычайно высокая частота СЦА 1-го типа (СЦА1) в Якутии [13]. Таким образом, большое значение имеет оценка распространенности НБНС в различных популяциях мира,
Наталья Юрьевна Абрамычева - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. V неврологического отделения ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва. Рахматулло Азизович Рахмонов - профессор, зав. кафедрой неврологии Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сино, Душанбе.
Тахмина Ворисовна Мадаминова - аспирант кафедры неврологии Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сино, Душанбе. Мария Сергеевна Степанова - канд. биол. наук, науч. сотр. V неврологического отделения ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва.
а также установление частот соответствующих мутаций в генах, вызывающих развитие изучаемых заболеваний. Эти данные лежат в основе мероприятий, направленных на разработку мер профилактики НБНС, включая пренатальную ДНК-диагностику, медико-генетическое консультирование и диспансерное наблюдение за семьями, отягощенными наследственной патологией [1, 10, 11].
В Республике Таджикистан отсутствуют современные эпидемиологические сведения о НБНС. Проведенные ранее эпидемиологические исследования в отдельных регионах страны носили ограниченный характер и были посвящены лишь определенным нозологическим формам НБНС. Так, на территории Исфаринского района республики была выявлена форма аутосомно-доминантного эссенциально-го тремора, сцепленная с хромосомой 3д13 - локус ЕТМ1 [12, 14]. Имеются также работы, посвященные эпидемиологическим аспектам НБНС в отдельных регионах Республики Таджикистан [12, 15].
Целью исследования явилось обобщение первого опыта молекулярно-генетической диагностики НБНС в семьях, проживающих на территории Гиссарского района Таджикистана. Работа проводилась в рамках проекта по изучению НБНС, осуществляемого под эгидой Международной ассоциации организаций в области неврологии и нейронаук.
Материал и методы исследования
Исследование проводилось на кафедре неврологии с основами медицинской генетики Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сино и ДНК-лаборатории V неврологического (нейрогенетичес-кого) отделения ФГБНУ "Научный центр неврологии". Были исследованы образцы ДНК большой группы пациентов с различными формами НБНС, проживающих на территории
ТЛ,»М.Ш$»5-и.14-ММЛ» ТЛ 1СА1 0 95ЭЭ
_
26
44
¿я. __ей
о 40 м -1М. Яо 1М Зи и? ЛЛ
V 26 ■
0 44
. . Ь 11 .1 I А.. { 111
Рис. 1. Результат фрагментного анализа гена ЛТХЫ2 (программное обеспечение GeneMapper). На верхней электрофореграмме приведен положительный контроль: гетерозиготное носительство патологического аллеля с числом копий CAG-повторов, равным 38 (при норме <30 повторов), нормальный аллель содержит 22 повтора. На средней и нижней электрофореграммах представлен анализ образцов ДНК пациентов Р.Ш. и Г.З.: в обоих случаях выявлено гетерозиготное носительство мутантного аллеля с числом копий 44 (нормальный аллель содержит 26 повторов).
Гиссарского района Республики Таджикистан и вошедших в ведущийся в этом регионе регистр НБНС [15]. Клиническая картина в изученных случаях соответствовала СЦА (с ауто-сомно-доминантным или аутосомно-рецессивным наследованием) или спастическим параплегиям (СПП).
Молекулярно-генетический анализ включал, в зависимости от особенностей клинического фенотипа и характера наследования болезни, поиск мутаций в генах аутосом-но-доминантных СЦА1, СЦА2, СЦА3 и СЦА6 (ЛТКЫ1, ЛТКЫ2, ЛТХЫ3, ОЛОЫ11Л4 соответственно), болезни Фридрейха (ЯХЫ), а также наиболее частой формы наследственной СПП - СПП 4-го типа (СПП4; ген БРЛБТ).
Мутационный скрининг включал: 1) фрагментный анализ ампликонов - для заболеваний, характеризующихся экспансией тандемных тринуклеотидных повторов [16]; 2) прямое секвенирование кодирующей области гена БРЛБТ.
Результаты и обсуждение
Те или иные мутации в изучаемых генах были выявлены в четырех обследованных семьях - одной семье с аутосом-но-доминантной СЦА, двух семьях с аутосомно-рецессив-ной СЦА и одной семье с наследственной (аутосомно-до-минантной) СПП.
В семье с аутосомно-доминантной СЦА у пробанда и ее дяди была выявлена типичная тринуклеотидная мутация (экспансия СДО-повторов) в гене ЛТХЫ2 (рис. 1). Это позволяет на молекулярном уровне классифицировать выявлен-
ное заболевание как СЦА2. Приводим краткие выписки из историй болезни.
Семья Р.-Г.
Пациентка Р.Ш., 1987 г.р., жалобы на неустойчивость и шаткость походки, изменение речи, почерка, дрожание рук и головы, слабость в ногах, головокружение. Считает себя больной примерно с 22 лет, заболевание началось с неустойчивости при ходьбе и постепенно прогрессирует. Тем же заболеванием страдала мать, которая умерла от сердечно-сосудистой патологии (инфаркт миокарда) в возрасте 56 лет, а также двое родственников по материнской линии - дядя (см. ниже) и бабушка. Неврологический статус: конвергенция сохранна, нистагма нет. Речь скандированная. Сухожильные рефлексы с рук снижены, с ног - не определяются; мышечный тонус в руках и ногах снижен. Патологических знаков нет. Координаторные пробы (пальце-носовая, пальце-пальцевая, пяточно-коленная) выполняет с интенцией. Отмечается тремор в руках (постуральный, интенционный), тремор головы. В пробе Ромберга резко неустойчива, отклоняется назад. Походка шаткая, с широко расставленными ногами. Чувствительных нарушений не выявлено. Функция тазовых органов не нарушена. Когнитивные функции сохранны. Компьютерная томография (КТ) головного мозга: признаки атрофии мозжечка.
Клинический диагноз: аутосомно-доминантная СЦА.
Рис. 2. Результат анализа гена FXN в агарозном геле. Нормальные аллели указаны стрелками, область мутантных аллелей обозначена фигурной скобкой. Дорожка TJ3 -пациентка А.Х., дорожка TJ4 - пациент А.А., дорожка TJ5 -пациентка С.М., дорожка TJ6 - пациент С.Мр., дорожка TJ7 -пациент С.Мх., в дорожках K+ и К- исследованы мутантный и нормальный контроли соответственно, дорожки FD29 и FD26 - контроли с гетерозиготностью по экспансии повторов в гене FXN. Крайняя правая дорожка - маркер размера (GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder).
Результат исследования гена ATXN2 методом фраг-ментного анализа: выявлено гетерозиготное носительство патогенной мутации по типу экспансии CAG-повторов (нормальный аллель содержит 26 повторов, мутантный - 44 повтора, см. рис. 1).
Пациент Г.З., дядя вышеописанной пациентки, 1954 г.р. Жалобы те же, но более выраженные. Возраст начала заболевания - около 35 лет. В неврологическом статусе отмечаются сходные симптомы, однако на момент осмотра самостоятельно передвигаться больной уже неспособен, ходит только с поддержкой. Резко выражены тремор рук и дизартрия: речь невнятная, трудноразличимая. Компьютерная томография головного мозга не проводилась. По данным фрагментного анализа выявлена идентичная мутация с тем же количеством повторов в обоих аллелях гена ATXN2.
Таким образом, фенотип у обоих пациентов вполне соответствовал описанной клинической картине СЦА2: для этой формы СЦА, в частности, типично сочетание прогрессирующих нарушений координации с угнетением сухожильных рефлексов [16], что и имело место у описанных выше больных родственников.
В двух обследованных нами семьях с аутосомно-ре-цессивной СЦА у пробандов и их больных сибсов выявлена значительная экспансия тандемных GAA-повторов в гене FXN в гомозиготном состоянии (рис. 2). Такой тип молекулярного дефекта соответствует болезни Фридрейха. Приводим краткие выписки из историй болезни.
Семья А.
Пациентка А.Х., 1993 г.р. Жалобы на шаткость при ходьбе, невозможность самостоятельно передвигаться, слабость и дрожание в руках и ногах, изменение речи и почерка. Болеет с 12 лет. Брак родителей родственный (двоюродные сибсы); в семье те же симптомы, но менее выраженные, имеются у младшего брата (см. ниже). Неврологический статус: нистагма нет, речь дизартричная. Парезов нет, сухожильные рефлексы и мышечный тонус в
руках и ногах резко снижены; патологических знаков нет. Координаторные пробы выполняет, но с трудом, при этом выявляется отчетливый интенционный тремор. В пробе Ромберга стоять не может, ходит только с поддержкой. Отмечаются гипотрофии дистальных отделов ног и деформация стоп (стопы Фридрейха - из-за изменений стоп больная была направлена с диагнозом "невральная амио-трофия"). Четких чувствительных нарушений нет. Электрокардиограмма (ЭКГ) без особенностей; КТ, магнитно-резонансная томография (МРТ) не проводились.
Клинический диагноз: болезнь (атаксия) Фридрейха.
Диагноз подтвержден при молекулярно-генетическом тестировании. Результат исследования гена FXN методом фрагментного анализа: выявлено гомозиготное носительст-во патогенной мутации по типу экспансии GAA-повторов (оба аллеля >700 повторов, дорожка TJ3 на рис. 2).
Пациент А.А., младший брат пробанда, 1998 г.р. Болеет в течение 2 лет. Заболевание началось со слабости ног. При осмотре: со стороны черепных нервов - без особенностей. Умеренное снижение сухожильных рефлексов и мышечного тонуса в конечностях. Отмечается умеренная гипотрофия нижних конечностей, стопы Фридрейха. Координаторные пробы выполняет удовлетворительно. В пробе Ромберга неустойчив, походка шаткая, на расставленных ногах. Чувствительных нарушений нет. Электрокардиограмма без особенностей; КТ, МРТ не проводились. При ДНК-диагностике идентифицирована гомозиготная мутация в гене FXN, число копий GAA-повторов в обоих аллелях >700 (дорожка TJ4 на рис. 2).
Семья С.
Пациентка С.М., 1987 г.р., жалуется на невозможность самостоятельно передвигаться и обслуживать себя, шаткость туловища, значительное дрожание рук и ног, головокружение. Заболевание началось в возрасте 14-15 лет с небольшого дрожания в руках и в дальнейшем неуклонно прогрессировало в довольно быстром темпе. Брак родителей родственный (двоюродные сибсы); в семье тем же заболеванием страдают два младших брата (см. ниже). Неврологический статус: нистагма нет, конвергенция в норме. Речь скандированная, "мозжечковая". Сила мышц в руках и ногах снижена до 4 баллов; тонус мышц рук и ног низкий. Сухожильные рефлексы с рук резко снижены, с ног - не определяются. Патологических знаков нет. Координаторные пробы выполнить не может, грубо промахивается. В пробе Ромберга стоять не может из-за атаксии. Отмечается грубый тремор в руках, ногах, голове, усиливающийся при волнении и движениях. Больная полностью зависима от посторонних, в том числе в приеме пищи. Нарушений поверхностной и глубокой чувствительности нет. Отмечается деформация стоп по типу стопы Фридрейха. Электрокардиограмма без особенностей; МРТ, КТ не проводились.
Клинический диагноз: болезнь (атаксия) Фридрейха.
Диагноз подтвержден молекулярно-генетически. Результат исследования гена ЯХЫ методом фрагментного анализа: выявлено гомозиготное носительство патогенной мутации по типу экспансии ОАД-повторов (оба аллеля >750 повторов, дорожка Т]5 на рис. 2).
Пациент С.Мр., младший брат пробанда, 1989 г.р. Возраст начала заболевания - около 15-16 лет. Симптомы заболевания идентичны таковым у сестры, но менее выраженные. Кроме того, в отличие от арефлексии ног у сестры у больного отмечается повышение сухожильных рефлексов в ногах. Способен себя обслуживать, ходит самостоятельно (с пошатыванием). На КТ головного мозга выявлена негрубая гипотрофия мозжечка. При ДНК-диагностике идентифицирована такая же гомозиготная мутация в гене ЯХИ, число копий ОДД-повторов в обоих аллелях >700 (дорожка на рис. 2).
Пациент С.Мх., другой младший брат пробанда, 1996 г.р., у которого заболевание началось 2 года назад. Отмечается незначительно выраженный интенционный тремор рук при координаторных пробах, неустойчивость при ходьбе. В пробе Ромберга неустойчив, отклоняется назад. Сила мышц достаточная, сухожильные рефлексы с рук средней живости, с ног - повышены. Мышечный тонус слегка снижен. Патологических знаков нет. Деформации стоп нет. На КТ головного мозга: гипотрофия мозжечка. При ДНК-диагностике идентифицирована гомозиготная мутация в гене ЯХЫ, число копий ОДД-повторов в обоих аллелях >750 (дорожка ТЯ на рис. 2).
В обследованных семьях с подтвержденной на молекулярном уровне болезнью Фридрейха имела место определенная вариабельность клинической картины. Так, наряду с классической сухожильной арефлексией, отмечавшейся у обоих пациентов в первой семье, у больных во второй семье наблюдалась как арефлексия (у пробанда), так и отчетливая пирамидная симптоматика с повышением рефлексов (у обоих братьев). Пирамидная симптоматика вплоть до спастической атаксии описана в ряде случаев при болезни Фридрейха, но подобная внутрисемейная вариабельность встречается весьма редко и объясняется, по-видимому, действием неустановленных генов-модификаторов. Особенностью в описанных нами случаях явилось отсутствие значимых нарушений глубокой чувствительности и изменений на ЭКГ. Интересно, что в семье С. была выявлена определенная корреляция между тяжестью клинической картины и степенью экспансии ОДД-повторов в мутантном гене: у старшей сестры (С.М.) более выраженная мутация с числом повторов >750 характеризовалась заметно более тяжелыми клиническими проявлениями; в то же время у ее брата (С.Мр.) при сопоставимой длительности болезни число повторов в гене оказалось меньшим (>700), что сопровождалось более мягким течением болезни.
Еще в одной обследованной нами семье, в которой у 9 родственников в четырех поколениях наблюдались
Рис. 3. Фрагмент сиквенса гена БРЛБТ. Стрелка указывает на область точковой мутации (ТСД>ТОД, р.вег381Х).
симптомы болезни Штрюмпелля (наследственной СПП), нами была выявлена гетерозиготная мутация в гене БРЛБТ (рис. 3). Приводим выписку из истории болезни.
Семья К.
Пациент К.А., 1960 г.р. Жалобы на скованность в ногах, затруднения при ходьбе. Заболевание началось в возрасте 22-23 лет и очень медленно прогрессировало на протяжении десятилетий. В семье больны еще два его родных брата (остальные 5 сибсов здоровы), у одного из которых больны двое детей. Аналогичное заболевание зарегистрировано также у матери пробанда, у деда по линии матери, у младшего брата деда и у его сына. Неврологический статус: отмечается грубый нижний спастический парапарез с гиперрефлексией, гипертонусом и стопными патологическими рефлексами (Бабинского, Оппенгейма, Гордона, Шефера), клонусы стоп и коленных чашечек. Руки сравнительно интактны. Походка спастическая, передвигается самостоятельно. Чувствительных нарушений нет. Функция тазовых органов не нарушена.
У двух больных братьев пробанда заболевание началось в том же возрасте и протекало совершенно стереотипно.
При скрининге кодирующей области гена БРЛБТ (17 эк-зонов) в образце ДНК пробанда выявлена точковая нонсенс-мутация в 9-м экзоне (р.Эег381Х, ТСД>ТОД). Мутация приводит к замене серина-381 на стоп-кодон. С учетом такого молекулярного дефекта, в данной семье с очевидным аутосомно-доминантным наследованием болезни может быть диагностирована СПП4.
Таким образом, проведенное нами исследование позволило впервые в популяции Республики Таджикистан идентифицировать на ДНК-уровне ряд молекулярных форм НБНС - СЦА2, болезнь Фридрейха, СПП4. Диагностированные заболевания относятся к числу наиболее частых
в нейрогенетике: так, например, болезнь Фридрейха считается самой часто встречающейся среди всех форм дегенеративных атаксий [16], а СПП4 является наиболее распространенным вариантом аутосомно-доминантной болезни Штрюмпелля (наследственной СПП). Отметим, что при всех диагностированных формах клиническая картина была довольно типичной, с незначительным внутрисемейным полиморфизмом и наличием клинико-генетических корреляций. Можно предположить, что наблюдавшиеся особенности фенотипов (например, отсутствие сенсорных расстройств и кардиомиопатии у пациентов с болезнью Фридрейха) являются характерными для таджикской популяции, что нуждается в дальнейшем изучении.
Полученные результаты, а также расширение молеку-лярно-генетических исследований в таджикской популяции должны стать научной основой для совершенствования системы медико-генетического консультирования семей с НБНС и профилактики наследственной неврологической патологии в Республике Таджикистан.
Список литературы
1. Наследственные болезни нервной системы: Руководство для
врачей / Под ред. Ю.Е. Вельтищева, П.А. Темина. М., 1998.
2. Загоровская Т.Б. и др. // Журн. неврол. и психиатр. 2004. № 8. С. 66.
3. Иллариошкин С.Н. и др. // Журн. неврол. и психиатр. 2000. № 8. С. 60.
4. Иллариошкин С.Н. и др. // Неврол. журн. 2002. № 5. С. 47.
5. Иллариошкин С.Н., Иванова-Смоленская И.А. Дрожательные гиперкинезы: Руководство для врачей. М., 2011.
6. Illarioshkin S.N. et al. // J. Neurol. 1996. V. 243. P. 506.
7. Illarioshkin S.N. et al. // Eur. J. Neurol. 2007. V. 14. P. 413.
8. Periquet M. et al. // Am. J. Hum. Genet. 2001. V. 68. P. 617.
9. Ветрова Н.В. Генетическая эпидемиология моногенных болезней нервной системы у населения Ростовской области: Авто-реф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2012.
10. Гринберг Я.И. Комплексное медико- и популяционно-генети-ческое изучение населения Республики Башкортостан: Авто-реф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2009.
11. Проскокова Т.Н. Наследственные заболевания нервной системы в Хабаровском крае (популяционный, клинико-генеалоги-ческий, молекулярно-генетический анализ): Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 2007.
12. Рахмонов Р.А. Наследственные болезни нервной системы в Таджикистане: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 2004.
13. Платонов Ф.А. и др. // Мед. генет. 2004. № 5. С. 242.
14. Illarioshkin S.N. et al. // Russ. J. Genet. 2002. V. 38. № 12. P. 1447.
15. Рахмонов Р.А., Мадаминова Т.В. // Анн. клин. экспер. неврол. 2014. №4. С. 15.
16. Иллариошкин С.Н. и др. //Генетика. 1995. № 11. С. 1478.
НЕРВНЫЕ БОЛЕЗНИ
г\
———- «2 Uli
АТМОСФЕРА
t TTt tiJf// < ■ f Tf
новости кардиологи и
Продолжается подписка на научно-практический журнал
"НЕРВНЫЕ БОЛЕЗНИ"
Журнал выходит 4 раза в год. Стоимость подписки на полгода по каталогу агентства "Роспечать" - 420 руб., на один номер - 210 руб.
Подписной индекс 81610.
Продолжается подписка на научно-практический журнал
'дтмосФЕРД. новости кардиологии
Журнал выходит 4 раза в год. Стоимость подписки на полгода по каталогу агентства "Роспечать" - 380 руб., на один номер - 190 руб.
Подписной индекс 37211.
Подписку можно оформить в любом отделении связи России и СНГ. Редакционную подписку на эти и любые другие журналы издательства "Атмосфера" ^_можно оформить на сайте http://atm-press.ru или по телефону: (495) 730-63-51
