Опыт криомоделирования патологии поджелудочной железы Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

52

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ

experimental gastroenterology

ОПЫТ КРИОМОДЕЛИРОВАНИЯ ПАТОЛОГИИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Дорошкевич С. В., Пивченко П. Г., Дорошкевич Е. Ю.

Гомельский государственный медицинский университет, Беларусь

Дорошкевич Сергей Витальевич 246050, Республика Беларусь, Гомель, ул. Ланге, д. 5 Тел.: (10 375 232) 77 6472 E-mail: [email protected]

РЕЗЮМЕ

Целью исследования явилось определение возможностей криомоделирования патологии поджелудочной железы. Локальное холодовое воздействие на поджелудочную железу белой крысы проводили с помощью криохирургического комплекса КСН 3А/В («Хирана», Брно). Охлаждение выполнялось интраоперационно, путем непосредственного соприкосновения криохирургического наконечника с тканью железы. Установлена зависимость локальных морфологических изменений от температуры охлаждения. Моделирование патологии поджелудочной железы на основе локального криовоздействия отличается высокой специфичностью и стабильностью воспроизведения и может быть рекомендовано для изучения механизмов возникновения данной патологии и апробации способов лечения.

Ключевые слова: экспериментальная модель; поджелудочная железа; гипотермия.

SUMMARY

The purpose of the research is to determine the capabilities of cryomodelling of the pathology of the pancreas. Local cold influence of the pancreas of white rat was made with the help of cryosurgical complex KCH 3A/B (Chirana, Brno). Cooling was carried out intraoperatively, by the direct contact of the cryosurgical tip with the tissue of the pancreas. The relation of local morphological changes from the temperature of cooling is established. The modeling of the pathology of the pancreas on the basis of local cryoinfluence differs by high specificity and stability of reproduction and it can be recommended for studying mechanisms of the origin of given pathology and approbation of the ways of the treatment.

Keywords: experimental model; pancreas; hypothermia.

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на значительные достижения современной медицины, острый панкреатит до настоящего времени остается одной из важнейших проблем в хирургии. Медицинское и социальноэкономическое значение проблемы заключается в неуклонном росте заболеваемости. При этом отмечается относительное увеличение тяжелых форм с исходом в панкреонекроз и развитием таких осложнений, как аррозивные кровотечения, сепсис, формирование псевдокист, внутренних и наружных панкреатических свищей [1 - 7].

Неудовлетворенность результатами лечения деструктивного панкреатита побуждает клиницистов к поискам эффективных способов терапевтического

и хирургического лечения. Для решения этих важных задач большое значение имеют экспериментальные исследования, в том числе создание модели заболевания, которая позволила бы раскрыть характер патологического процесса в поджелудочной железе и варианты дальнейшего его развития.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проводились на нелинейных белых крысах весом 160 - 180 граммов. Использовались белые крысы-самцы, что позволило исключить гормональное влияние, связанное с эстральным циклом на течение патологического

процесса. Питание осуществлялось по обычной диете в условиях вивария. Работу проводили с соблюдением правил, предусмотренных Европейской комиссией по надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием экспериментальных животных разных видов.

В течение 18 - 24 часов до воспроизведения эксперимента животные не получали пищу, вода давалась в неограниченном количестве. Крыс выдерживали на голодном режиме с целью стандартизировать условия опыта, вызвать синхронизацию секреторного цикла в клетках поджелудочной железы.

Операции выполнялись с соблюдением правил асептики и антисептики. Под эфирным наркозом производили срединную лапаротомию, отступя на 1 см от мечевидного отростка по белой линии живота длиной 3 см. Для расширения раны во время операции на лабораторных животных использовали ранорасширитель собственной конструкции (патент Республики Беларусь № 3641). В разрез выводили селезеночный сегмент поджелудочной железы вместе с сальником и селезенкой.

Для локальной гипотермии поджелудочной железы использовали криохирургический комплекс КСН 3А/В («Хирана», Брно), применяемый для местного замораживания тканей.

Охлаждение железы осуществляли интраопера-ционно, путем непосредственного соприкосновения криохирургического наконечника собственной конструкции с определенными параметрами его рабочей части, позволяющей осуществить точечные воздействия (патент Республики Беларусь № 3979).

Воздействие низких температур осуществлялось в течение 60 секунд. Применение указанного наконечника позволяет осуществить стандартизацию криовоздействия на поджелудочную железу. Выбор времени воздействия обусловлен, с одной стороны, теплопроводностью криохирургического наконечника, а с другой — анатомическими параметрами поджелудочной железы крысы.

Использовались температурные режимы: -20, -60, -100 и -180 °С, позволяющие в совокупности полно изучить воздействие низких температур.

Снижение температуры поджелудочной железы почти до +5 °С не оказывает заметного влияния на структуру, отмечено лишь обратимое угнетение экзокринной функции [8].

Визуально после криовоздействия хорошо определяется ледяное пятно. Величина участка замораживания зависит от температуры и размера рабочей части криохирургического наконечника, площади и массы замораживаемого участка, его температуры, вида ткани, ее гидрофильности и кровоснабжения [9]. Диаметр сферы замороженной ткани определяется температурой криохирургического наконечника согласно формуле:

Dъ/Dt = 1 + (К(Т — Т))/(Kt(Tt — Т)),

где Dъ — диаметр ледяного шарика в см; Dp — диаметр криохирургического наконечника;

K — температурная проводимость замороженной ткани; Kt — температурная проводимость незамороженной ткани; T. — точка замораживания ткани 0 °С; T — температура криохирургического наконечника; Tt — температура ткани, удаленной от места криовоздействия.

При проведении локальной гипотермии поджелудочной железы сальник и селезенка оставались вне зоны действия повреждающего агента.

Охлажденный участок железы оттаивал в течение 30 секунд, после чего селезеночный сегмент поджелудочной железы вместе с сальником и селезенкой погружали в брюшную полость. Для манипуляций на поджелудочной железе использовали пинцет собственной конструкции (патент Республики Беларусь № 4891).

Операционную рану ушивали послойно наглухо. Для наложения швов применяли иглодержатель собственной конструкции, использование которого позволило существенно оптимизировать проведение оперативного вмешательства (патент Республики Беларусь № 4451).

Сразу после операции животные получали пищу и питье в неограниченных количествах.

Забой животных проводился путем декапитации спустя 5, 30 и 60 минут, через 3, 6, 12 и 24 часа, на 3, 7, 14, 21, 30, 45, 60, 75 и 90-е сутки после локальной гипотермии поджелудочной железы. Указанные сроки забоя предусмотрены для того, чтобы более детально проследить динамику патологического процесса после первичного экзогенного повреждения органа и запуска аутокаталитических процессов до их логического завершения.

Проводилось гистологическое исследование поджелудочной железы с парапанкреатической жировой клетчаткой, брыжейки тонкой и толстой кишки, большого сальника. В работе использована окраска гематоксилин-эозин. Для количественной оценки использовалась морфометрия.

Исследование на наличие сообщения псевдокисты с протоковой системой поджелудочной железы проводили путем пункционного заполнения под давлением коллоидного раствора угля (туши).

Полученные результаты обработали с помощью пакета компьютерных программ статистического анализа Microsoft Excel 2003 и Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Локальное охлаждение ткани поджелудочной железы в температурных режимах: -20, -60, -100 и -180 °С в течение 60 секунд приводит к морфологическим изменениям характерным для панкреатита. Структурные изменения, вызванные криовоздействием, могут быть определены как отечно-геморрагическая форма острого

Б > а

So L 2

О £

Я--

Щ а

Н1Ё £Е

2 ^

a.

Н ч

U

га

L

Б

га

X

<

га

I-

х

ш

2

s

а

ш

с

и

v

m

m

1-Л

№08/2010 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ

панкреатита, которая характеризуется последовательно развивающимися стадиями.

Отечно-геморрагическая стадия (5 минут — 3 часа) характеризуется отеком соединительной ткани железы, дистрофическими изменениями панкреацитов различной степени выраженности и кровоизлияниями.

Морфологические проявления некротической стадии (6 - 24 часа) заключаются в наличии различной величины участков паренхиматозного некроза при слабо выраженной лейкоцитарной реакции.

На стадии расплавления и элиминации (3 - 14-е сутки) выявляется лейкоцитарная инфильтрация очагов некроза, наблюдается рассасывание некро-тизированной ткани железы макрофагами, определяется разрастание молодой соединительной ткани.

Стадия склерозирования и атрофии (21 - 90-е сутки) характеризуется пролиферацией соединительной ткани. Вторичная дифференцировка трубчато-эпителиальных структур поджелудочной железы неполноценна и завершается преимущественно атрофией.

Морфологическая картина острого экспериментального панкреатита зависит от температурного режима криовоздействия. Патоморфологические изменения после охлаждения в температурном режиме -20 °С являются локальными, ограниченными областью криовоздействия и завершаются рубцовой атрофией.

Морфологические изменения после воздействия холодом от -60 до -180 °С более выражены, что обусловлено увеличением площади криогенного повреждения поджелудочной железы.

Локальное криовоздействие в температурном режиме -60 °С приводит к развитию отечногеморрагической формы острого панкреатита (рис. 1 см. на цветной вклейке) с исходом в хронический панкреатит с явлениями склероза и липоматоза органа. В патологический процесс вовлекается па-рапанкреатическая клетчатка. Очаги некроза в ней подвергаются лейкоцитарной инфильтрации и рассасыванию. К завершению эксперимента здесь выявляются скопления зрелой соединительной ткани.

Локальная гипотермия в температурном режиме -100 °С приводит к формированию распространенных жировых некрозов в парапанкреатической клетчатке (рис. 2 см. на цветной вклейке).

Охлаждение в температурном режииме -180 °С вызывает геморрагический панкреонекроз, сочетающийся с поражением парапанкреатической клетчатки, клетчатки брыжейки тонкой и толстой кишки и большого сальника. Развитие серозногеморрагического перитонита приводит к гибели животных на 1 - 3-е сутки после начала эксперимента.

Инфильтративно-некротическая форма парапанкреатита, вызванная локальной гипотермией в температурном режиме -100 °С, трансформируется на 14-е сутки эксперимента в псевдокисту поджелудочной железы (рис. 3 см. на цветной вклейке). Она определяется в верхнем этаже брюшной полости как подвижное,

округлой формы образование, морфологическое исследование которого верифицируется как псевдокиста. Полость псевдокисты изначально замкнута и не сообщается с протоковой системой поджелудочной железы на всем протяжении исследования.

В патогенетическом преобразовании инфильтративно-некротической формы парапанкреатита в псевдокисту поджелудочной железы следует выделить этапы: серозного отека (3 - 6 часов); некроза (12 часов — 1 сутки); инфильтрации (третьи сутки); отграничения (7 - 14-е сутки).

Локальное охлаждение селезеночного сегмента поджелудочной железы в температурном режиме -100 °С приводит к серозному отеку парапанкреатической клетчатки, клетчатки большого сальника и брыжейки кишок уже спустя 3 часа после криовоздействия. К 12 часам в парапанкреатической клетчатке выявляются очаги жировых некрозов, а также мелкие белесые бляшки стеатонекрозов, рассеянных по брыжейке тонкой кишки и париетальному листку брюшины. Очаги жировых некрозов парапанкреатической клетчатки к первым суткам принимают сливной характер. На третьи сутки эксперимента вокруг полей жировых некрозов формируется лейкоцитарная инфильтрация из преимущественно палочкоядерных нейтрофи-лов. К седьмым суткам в парапанкреатической клетчатке поля жировых некрозов окружены демаркационным валом из нейтрофильных лейкоцитов, макрофагов, а также лимфоцитов и фибробластов.

Морфогенез сформированной псевдокисты поджелудочной железы включает стадии быстрой и медленной трансформации.

Стадия быстрой трансформации наблюдается на протяжении с 14-х по 21-е сутки, в течение которых происходят основные патогенетические процессы изменений морфометрических параметров псевдокисты. Установлено увеличение диаметра, возрастание толщины стенки и расширение внутренней полости (р < 0,05). Стадия медленной трансформации — с 21-х по 90-е сутки эксперимента, на этой стадии морфометрические параметры псевдокисты относительно стабильны.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящее время все известные способы моделирования патологии поджелудочной железы разделяют на четыре группы: 1) каналикулярно-гипертензионные; 2) сосудисто-аллергические; 3) травматические; 4) токсико-инфекционные [10]. Указанные модели могут быть использованы в большей степени для изучения эффективности лечения панкреатита и в меньшей мере — для исследования отдельных сторон его патогенеза.

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что в условиях данного эксперимента локальное криовоздействие приводит к возникновению острого панкреатита.

Считают, что в основе возникновения патологических изменений в поджелудочной железе лежат повреждения ацинарной клетки с последующим выходом активированных или самоактивирующихся ферментов в интерстициальную ткань.

Криовоздействие приводит к прямой альтерации ацинарных клеток. Повреждение обусловлено внутри и внеклеточной кристаллизацией воды клетки, сопровождающейся дегидратацией биомолекул и биологических мембран, вызывающих выпадение их компонентов. Имеет значение повышение концентрации электролитов и pH, вызывающие денатурационные изменения биомакромолекул субклеточных структур и других компонентов. Является важным также пространственное сближение биомакромолекул и субклеточных частиц, вызывающее их необратимые структурные перестройки в результате гибридизации и других процессов. Принимают во внимание также кристаллизацию

внутримембранной воды и компонентов важнейших мембранных структур клетки (митохондрии, биомембраны, лизосомы) и каталитических белков, а также придают значение механическим повреждениям структурных компонентов клеток за счет внутри- и внеклеточной кристаллизации воды и роста кристаллов [11].

Повреждение мембран ацинарных клеток при криовоздействии приводит к высвобождению липолитических ферментов, которые резко усиливают прямое повреждающее действие холода и приводит к некробиозу аци-нарных клеток и интерстициальной жировой ткани в зоне замораживания.

Локальное охлаждение может быть использовано для моделирования патологии поджелудочной железы, этиопатогенети-ческие механизмы формирования которой аналогичны клиническим.

Б >

а

So L 2

О і

Я--

Щ а

Н1Ё

2 * h <L

U

Л

L

Б

га

X

<

го

н

X

ш

S

S

a

и

с

и

v

m

ЛИТЕРАТУРА

1. Вашетко Р. В. и др. Острый панкреатит и травмы поджелудочной железы. — СПб.: Питер, 2000. — 320 с.

2. Данилов М. В., Федоров В.Д. Хирургия поджелудочной железы. — М.: Медицина, 1995. — 512 с.

3. Филин В. И., Костюченко А. Л. Неотложная панкреатология. — СПб.: Питер, 1994. — 41б с.

4. Beger H. G. Surgery in Acute pancreatitis // Hepatogastroenterology. — 1991. — Vol. 38. — P. 92 - 9б.

5. Bradley E. L. A clinical based classification system of acute pancreatitis // Arch. Surg. — 1993. — Vol. 128. — P. Б8б - 590.

6. Marshal J. B. Acute pancreatitis: A review with an emphasis on new develoment // Arch. Intern. Med. — 1993. — Vol. I53. — P. 1185 - 1197.

7. Me Fadden D. W., Reber H. A. Management of acute and ,

chronic pancreatitis // Int. J. Pancreotol. — 1994. — Vol. 15,

№ 2. — P. 83 - 90.

8. Шалимов А. А. и др. Гипотермия в хирургии поджелудочной железы // Клин. хир. — 1982. — № 11. — С. 1 - 7.

9. Альперович Б. И., Цхай В. Ф., Хабас Г. Н. Лечение кист и свищей поджелудочной железы // Анн. хир. гепатол. — 2000. — Т. 5,

№ 1. — С. 70 - 76.

10. Шалимов С. А., Радзиховский А. П., Кейсевич Л. В. Руководство по экспериментальной хирургии. — М.: Медицина, 1989. — 272 с.

11. Пушкарь Н. Е., Белоус А. М. Введение в криобиологию. — Киев: Наукова думка, 1975. — 343 с.

1-Л

1-Л