CC BY
30ОПЫТ ИССЛЕДОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ СВОЙСТВ МЕСТНЫХ КРОВООСТАНАВЛИВАЮЩИХ СРЕДСТВ
RESEARCH EXPERIENCE OF VARIOUS PROPERTIES OF LOCAL HEMOSTATIC AGENTS
I Липатов Вячеслав Александрович Северинов Дмитрий Андреевич Пучкова Елена Леонидовна
Курский государственный медицинский университет
ILipatov Vyacheslav Alexandrovich Severinov Dmitry Andreevich Puchkova Elena Leonidovna
Kursk State Medical University
E-mail: drli@yandex.ru
Резюме
Кровотечение во время операции или на ранних послеоперационных сроках остается одной из главных проблем хирургии, в частности хирургии паренхиматозных органов. На современном этапе широко используются различные местные кровоостанавливающие средства. Для выбора конкретного гемостатика в условиях определенных операций необходимо иметь представления о свойствах различных аппликационных кровоостанавливающих средств, их эффективности, особенностях биодеградации и пр. С этой целью разрабатываются методики изучения свойств гемостатических средств в опытах in vitro и in vivo. Цель исследования. Описание этапов и основных методов исследования различных свойств губчатых гемостатических средств на основе с учетом личного опыта авторов.
Ключевые слова: кровотечение, гемостаз, хирургия, эндовидеохирургия, местные кровоостанавливающие средства, печень, травма
Summary
Bleeding during surgery or in the early postoperative period remains one of the main problems of surgery, in particular surgery of parenchymal organs. At the present stage, various local hemostatic agents are widely used. To select a specific hemostatic agent in certain operations, it is necessary to have an understanding of the properties of various application hemostatic agents, their effectiveness, features of biodegradation, etc. For this purpose, methods for studying the properties of hemostatic agents in in vitro and in vivo experiments are being developed. Purpose of research. Description of the stages and main methods of research of various properties of spongy hemostatic agents based on the authors ' personal experience.
Key words: bleeding, hemostasis, surgery, endovideosurgery, local hemostatic agents, liver, trauma
Библиографическая ссылка на статью
Липатов В.А., Северинов Д.А., Пучкова Е.Л. Опыт исследования различных свойств местных кровоостанавливающих средств // Innova. - 2021. -
№ 1 (22). - С. 20-24.
DOI: 10.21626/innova/2021.1/03
References to the article
Lipatov V.A., Severinov D.A., Puchkova E.L. Research experience of various properties of local hemostatic agents // Innova. - 2021. - No 1 (22). - P. 20-24.
Введение
Кровотечение, развивающееся во время или после оперативного вмешательства, до сих пор остается одной из главных проблем хирургии, в том числе хирургии паренхиматозных органов [1]. Кровотечение приводит к увеличению времени вмешательства, а значит, к удлинению периода пребывания пациента под действием наркоза, что может послужить причиной развития различных патологических состояний [2].
Возникновение послеоперационного
кровотечения часто требует повторного оперативного вмешательства. С целью быстрой и эффективной интраоперативной остановки кровотечения используют местные
гемостатические средства. Наибольшее распространение в современной практике получили такие формы гемостатиков как губки, мембраны, гели и порошки [3]. Местные кровоостанавливающие средства удобны в использовании, позволяют визуально оценить эффективность гемостаза.
В настоящее время популярны гемостатики из коллагена, на основе желатина,
производных целлюлозы с добавлением различных лекарственных средств [4].
Выбирая кровоостанавливающее
средство для каждого конкретного случая, необходимо основываться на знании физико-механических свойств гемостатиков, области их применения, особенностей биодеградации, времени остановки кровотечения, возможности возникновения побочных реакций.
Эту информацию можно получить в результате проведения доклинических испытаний средств - в опытах in vitro, in vivo [5]. Важным фактором выбора того или иного средства является информирование
практикующих хирургов об особенностях применения таких средств, их эффективности.
Цель исследования - описание этапов и основных методов исследования различных свойств губчатых гемостатических средств на основе личного опыта авторов.
Описание исследования. Изучение свойств образцов губчатых гемостатических имплантов проводилось в несколько этапов.
Результаты и обсуждение
Исследование мнений врачей-хирургов. В качестве основного метода исследования мнения врачей-хирургов использовали анонимное анкетирование. Анкеты были разработаны с помощью интерактивного инструмента Google Forms
(https://www.google.ru/forms). Распространение анкет и приглашение респондентов к участию в опросе проводилось через сеть Интернет при поддержке региональных и федеральных органов управления здравоохранением, региональных отделений Общероссийской общественной организации «Российское общество хирургов» [6, 7].
Оценка физико-механических и манипуляционных свойств. Исследование физико-механических и химических свойств губчатых гемостатических средств проводилось на базе лаборатории экспериментальной хирургии и онкологии научно-исследовательского института экспериментальной медицины федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Осуществляли изучение следующих параметров:
1. Остаточная деформация при сжатии на 50% толщины в проекции геометрического центра образца [8]. Для этого измеряли толщину образца до и после сжатия на 50% его толщины, а также через 5, 10 и 30 минут после сжатия с помощью стенда электромеханического РЭМ 0,2-1 (производитель 00 «Метротест», Россия).
2. Сорбционная способность единицы массы и единицы объёма губки. Образцы выдерживали в подогретой до 37°C дистиллированной воде, затем центрифугировали, измеряли массу центрифужного образца [9].
3. Полная пористость. Образцы помещали в орто-ксилол, центрифугировали, измеряли массу пробирки с образцом до центрифугирования и после извлечения центрифужного образца [10].
4. Кислотность. Водородный показатель (pH) растворов измеряли согласно модифицированной методике, описанной в ГОСТ 12523-77 «Целлюлоза, бумага, картон. Метод определения величины рН водной вытяжки» [11].
Исследование влияния аппликационных гемостатических материалов на образование сгустка крови и на концентрацию кальция в эксперименте in vitro. Оценку влияния тестируемых образцов на образование сгустка крови проводили, исследуя показатель «время свертывания» согласно разработанной методике (Патент РФ № 2700165 от 13.09.2019 г. «Способ сравнительного изучения влияния хирургических материалов на процесс образования сгустка крови in vitro»).
В утренние часы в стерильных условиях натощак у 10 здоровых доноров-добровольцев (юноши 19-23 лет), не имеющих в анамнезе патологии системы гемостаза, забирали кровь из кубитальной вены.
Производили рекальцификацию
стабилизированной цитратом цельной крови в коагулометре АПГ2-02-П (производитель ООО ЭМКО, г. Москва, Россия). Каждое исследование включало в себя оценку времени свертывания в двух кюветах коагулометра одновременно, что позволяет увеличить точность и снизить погрешность исследования, согласно правилам выполнения коагулометрических исследований. По изменению величины времени свертывания до внесения тестируемых материалов (контрольная группа) в исследуемую пробу и после (экспериментальные группы) судили об их влиянии на процесс образования сгустка крови in vitro [12].
Влияние гемостатических материалов на концентрацию кальция оценивали по разработанной ранее методике («Способ сравнительного исследования эффективности локальных кровоостанавливающих средств в эксперименте in vitro» Патент РФ № 2709517 от 18.12.2019 г.). В утренние часы в стерильных условиях натощак у 10 здоровых доноров-добровольцев (юноши 19-23 лет), не имеющих в анамнезе патологии системы гемостаза, забирали кровь объемом 4 мл из локтевой вены вакуумным способом в вакутайнеры, содержащие активатор свертывания. В течение 15 секунд с момента взятия крови на дно
пробирки погружали тестируемый образец, далее пробирки вновь закупоривали и помещали в термостат, где инкубировали в течение 30 минут при температуре +370С, затем пробирки с образцами центрифугировали для получения сыворотки крови. Полученную сыворотку помещали в эппендорфы, транспортировали в клинико-диагностическую лабораторию
экспериментально-биологической клиники
ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России, на базе которой выполняли исследование оценки концентрации кальция [13].
Исследование кровоостанавливающей активности в условиях эксперимента in vivo (в остром опыте). Исследование выполняли в стерильных условиях операционного блока лаборатории экспериментальной хирургии и онкологии НИИ Экспериментальной медицины ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России с соблюдением международных и отечественных норм гуманного обращения с лабораторными животными:
Директива 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях, приказ Минздрава России № 199н от 01 апреля 2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», приказ Министерства здравоохранения СССР № 755 от 12 августа 1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» и пр. [14].
Под общей ингаляционной анестезией (наркозный аппарат RWD Life Science R340 Isoflurane, производитель: Hi Tech North Rd, Nanshan Dist., Shenzhen, Guangdong Province, China, концентрация изофлюрана во вдыхаемой газовой смеси - 3%, поток воздуха - 0,4 л/мин) после стандартной трехкратной обработки операционного поля крысам-самцам линии Вистар (массой 200-250 гр) производили срединную лапаротомию, после чего в рану выводили левую долю печени и выполняли краевую резекцию последней (отсекали участок 10x5x5 мм). Данное вмешательство сопровождалось обильным паренхиматозным кровотечением. На кровоточащую область разреза накладывали исследуемое
гемостатическое средство с известной массой, позволяющее полностью укрыть поверхность раны (1,0x1,0 см). В ходе эксперимента оценивали объем кровопотери (объем крови, впитанный одним образцом), время кровотечения. Объем кровопотери (V) определяли гравиметрическим методом по Е.М. Левитэ с помощью аналитических весов AND GH-252 (производитель компания A&D Company, Limited, Япония) : разница в массе тестируемого материала до операции (m1, г) и
после (m2, г) его пропитывания кровью в ходе операции. Визуально регистрировали продолжительность кровотечения (t, сек), отнимая от раны образец каждые 10 секунд, отметив окончание кровотечения отсутствием его пропитывания, момент остановки кровотечения фиксировали с помощью секундомера. На каждую экспериментальную группу лабораторных животных была заведена документация в виде протокола операции [15].
Исследование в условиях хронического эксперимента in vivo реакции ткани, безопасности применения тестируемых образцов. Исследование выполняли на кроликах-самцах породы «Советская шиншилла» массой 2,5 - 4 кг в стерильных условиях операционного блока лаборатории экспериментальной хирургии и онкологии НИИ ЭМ КГМУ. Оперативное вмешательство выполняли с помощью видеоэндоскопического комплекса (научно-производственная фирма «Крыло», г. Воронеж).
После обработки операционного поля стандартным методом и его отграничения в мезогастрии производили лапароцентез иглой Veresh, выполняли наложение
карбоксиперитонеума с предустановленными параметрами: давление 7 мм рт. ст., поток 1 л/мин. В брюшную полость устанавливали оптическую канюлю и 5-мм эндоскоп, после чего производили ревизию брюшной полости и идентификацию печени. Затем последовательно устанавливали 2 троакара диаметром по 3 мм каждый для инструментов-манипуляторов согласно модифицированной методике, предложенной Todd R. Tams, Clarence A. Rawling в 2011 году при операциях на печени у мелких домашних животных. После чего с помощью эндоскопического диссектора тупо разделяли паренхиму средней доли печени в краниальном направлении на расстоянии 5 см от ее края на всю глубину браншей диссектора (12 мм), диссектор вводили в рану и разводили ее края на всю ширину браншей (20 мм). В ране развивалось паренхиматозное кровотечение. Затем в рану помещали полотно тестируемого образца размерами 1x1 см и плотно фиксировали прижатием инструмента («Способ лапароскопического моделирования рваной раны печени у лабораторных животных для исследования гемостатических материалов» (заявка на Евразийский патент
№ 2020111028, 17.03.2020 г.). После достижения локального гемостаза производили эвакуацию CO2 из брюшной полости, удаляли троакары, раны в местах стояния последних ушивали узловыми швами.
В послеоперационном периоде антибактериальную терапию животным не проводили [16].
До операции, а также на 1, 3, 7, 15, 30 сутки после операции у каждого животного
производили забор крови из наружной яремной вены согласно разработанной методике («Способ катетеризации наружной яремной вены для забора венозной крови у кроликов в хроническом эксперименте» заявка на патент РФ № 2020111028, 17.03.2020 г.) [17].
После чего на базе экспериментально-биологической клиники оценивали:
концентрацию гидроксипролина с помощью мультиячеечного сканера Microplate Reader Labsystems Multiskan MCC/340 (производитель Thermo Fisher Scientific, США) согласно модифицированной методике Cissell D.D. et all (2017 r.) ;
концентрацию ACT, АЛТ, билирубина, щелочной фосфотазы с помощью набора реактивов и автоматического биохимического анализатора ACCENT 200 (производитель - PZ Cormay S.A., Польша, выпуск 2016 г., введен в эксплуатацию в 2017 г., серийный номер WN-5A106171) ;
показатели общего клинического анализа крови (эритроциты, Ht, Hb, тромбоциты, лейкоциты) автоматическим гематологическим анализатором «RT-7600S» версия для ветеринарии производства компании RAYTO LIFE AND ANALYTICAL SCIENCES CO Ltd., КНР [18].
Также на указанных выше сроках каждому животному производили контрольно-динамическую лапароскопию, при выполнении которой макроскопически оценивали: выраженность спаечного процесса по методу, разработанному профессором В.А. Липатовым (Липатов В.А. Концепция профилактики послеоперационного спаечного процесса брюшной полости с применением барьерных средств (экспериментально-клиническое
исследование) : дис...д-ра мед. наук Курск, гос. мед. университет, Курск, 2013 г.).
Выведение животных из эксперимента осуществлялось методом цервикальной дислокации под ингаляционным наркозом на 30 сутки после операции. Была проведена аутопсия с изъятием травмированного участка печени с имплантированным образцом.
Гистологический материал фиксировали в 10% забуференном нейтральном формалине в течении 7 суток. По стандартной методике изготавливали парафиновые блоки и микропрепараты, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопирование производили посредством световой микроскопии с помощью медицинского микроскопа МИКМЕД-6 (АО «ЛОМО», г. Санкт-Петербург) на увеличениях *Ю0 и х400. Для морфометрической оценки производили фотографирование микропрепаратов с помощью C-mount (резьбовое соединение типа C) камеры E3CMOS12000КРА на основе сенсора Sony
IMX226 и программы Scope Tek ScopePhoto (версиях 86, 3.1.268).
На полученных микрофотографиях измеряли толщину капсулы, размер центральных вен печени, количество двухъядерных гепатоцитов, размеры гепатоцитов и их ядер [19].
Выводы
Изучение свойств гемостатических материалов представляет собой длительный процесс, требующий использования
высокотехнологичного оборудования, наличия определенных навыков у исследователя. Исследование свойств аппликационных гемостатических средств необходимо проводить не только в экспериментах in vitro и in vivo, но и основываясь на экспертной оценке средств практикующими хирургами. Это имеет важное значение для применения гемостатиков в практическом здравоохранении.
Так, знание физико-механических свойств образцов позволяет сделать вывод о манипуляционных особенностях различных губок, оценить возможность их применения в эндовидеохирургии. Наличие информации о скорости биодеградации имплантов из различных материалов определяет
приоритетную область их использования. Только анализируя полученные данные по результатам всестороннего исследования, можно говорить об эффективности конкретного средства.
Литература
1. Липатов, В.А. Локальные гемостатики в хирургии XXI века (обзор литературы) [Электронный ресурс] /
B.А. Липатов, Д.А. Северинов, А.Р. Саакян II Innova. - 2019 - № 1 (14). - С. 16-21. - Режим доступа: http://innomagazine.ru / (Дата обращения: 20.10. 2020).
2. Сравнительная эффективность аппликационных гемостатических средств местного действия при остановке экспериментального паренхиматозного и артериального кровотечения / В.В. Давыденко, Т.Д. Власов, И.Н. Доброскок [и др.] II Вестник экспериментальной и клинической хирургии. -2015. - № 2. - С. 186-194.
3. К вопросу о методологии сравнительного изучения степени гемостатической активности аппликационных кровоостанавливающих средств / В.А. Липатов,
C.B. Лазаренко, К.А. Сотников [и др.] II Новости хиругии.-2018. - Т. 26. № 1. - С. 81-95.
4. Исследование особенностей поверхности аппликационных гемостатических имплантов / В.А. Липатов, C.B. Лазаренко, Д.А. Северинов, A.A. Ушанов II Вестник экспериментальной и клинической хирургии. -
2019. - Т. 12. № 4. - С. 261-265.
5. Особенности применения гемостатических материалов местного действия в хирургии / О.Э. Луцевич, A.A. Гринь, A.A. Бичев, В.В. Шепелев II Московский хирургический журнал. - 2016. - № 3 (1). - С. 12- 20.
6. Липатов, В.А. Применение карбоксиметилцеллюлозы в экспериментальной хирургии паренхиматозных органов /
B.А. Липатов, Т.Н. Кудрявцева, Д.А. Северинов // Наука молодых. - 2020. - Т. 8. № 2. - С. 269-283.
7. Контроль локального гемостаза с помощью препаратов окисленной целлюлозы / A.M. Чернявский, И.А. Григорьев, Н.И. Ткачева [и др.] II Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. -2014. - № 8. - С. 71-75.
8. Исследование деформации губчатых аппликационных гемостатических материалов / В.А. Липатов, Д.А. Северинов, М.Д.З. Наимзада, Е.Л. Пучкова II Исследования в медицине и практике. - 2020. - Т. 7, № 3. -
C. 21-32.
9. Чижиков, Г.М. Сравнительный анализ гемостатической активности новых средств для остановки капиллярно-паренхиматозного кровотечения (эксперимент in vivo) / Г.М. Чижиков II Вестник экспериментальной и клинической хирургии. -2012. - № 1. - С. 20-22.
10. Целлюлоза, бумага, картон. Метод определения pH водной вытяжки: ГОСТ 12523-77. - [Введ. 1978-01-01]. - М.: Изд-во стандартов, 1978. - 6 с.
11. Легонькова, O.A. Исследование эксплуатационных свойств полимерных перевязочных средств. Раны и раневые инфекции / O.A. Легонькова, В.Г. Васильев, Л.Ю. Асанова II Журнал им. Проф. Б.М. Костюченка. - 2015. - № 2. - С. 32-39.
12. Легонькова, O.A. Современные раневые покрытия: их свойства и особенности / O.A. Легонькова, A.A. Алексеев II Вестник Росздравнадзора. - 2015. - № 6. - С. 66-68.
13. Легонькова, O.A. Сорбционные и физико-механические свойства биоматериалов, используемых в качестве перевязочных средств / O.A. Легонькова, В.Г. Васильев, В.Г. Асанова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2015. - № 10. -С. 7-13.
14. Гольдштейн, Р.В. О разрушении при сжатии / Р.В. Гольдштейн, Н.М. Осипенко // Физическая мезомеханика. - 2018. - № 21 (3). -С. 86-102.
15. Тактика лечения осложненного повреждения печени у детей с применением миниинвазивных технологий / М.П. Королев, Р.Г. Аванесян, Г.М, Лепехин, Т.В. Амирханян II Детская медицина Северо-Запада. - 2018. -№ 1 (7).- С.159-160.
16. Бледнов, A.B. К вопросу о методологии сравнительного изучения степени гемостатической активности аппликационных кровоостанавливающих средств / A.B. Бледнов // Новости хирургии.-2006. - Т. 14. № 1. - С. 9-19.
17. Доклиническая оценка эффективности местных гемостатических препаратов (экспериментальное исследование) / В.В. Бояринцев, А.Б. Юдин, В.Б. Назаров [и др.] // Медицина катастроф. - 2010. - № 3. - С. 23-25.
18. Современные химические гемостатические средства местного действия / В.Н. Бордаков, М.В. Доронин, П.В. Бордаков, В.П. Реутский II Медицинский вестник МВД. -2018. - № 4(95).- С. 19-26.
19. Медушевская А.И. Анализ ассортимента гемостатических лекарственных средств / А.И. Медушевская, С.Э. Ржеусский // Вестник фармации. - 2018. - № 4 (82). - С. 54-59.
20. Тактика кровосбережения при обширных резекциях печени / Г.Э. Черкасов, H.H. Багмет, И.Н. Соловьева, Г.А. Шатверян II Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. - 2020. -№ 7. - С. 111-118.
