CC BY
38
УДК: 616-006.441
опыт диагностики редких опухолей системы крови
у лабораторных мышей
в.н. Манских, о.С. ганчарова
ГОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», г. Москва 119992, г. Москва, Ленинские горы, стр. 73, e-mail: [email protected]
Представлены четыре случая редко встречающихся опухолей у лабораторных мышей: мастоцитомы нижнечелюстного лимфатического узла, мегакариоцитарного лейкоза, эритробластомы селезёнки (недиссеминированного эритролейкоза), лимфомы маргинальной зоны селезёнки, причём три последние неоплазмы были впервые диагностированы как спонтанные новообразования у животных без генетических модификаций. Особое внимание было обращено на диагностические признаки и особенности таких опухолей в сравнении со случаями, описанными в литературе.
Ключевые слова: опухоли у лабораторных мышей, мастоцитома, лимфома маргинальной зоны селезёнки, эритробластома селезёнки, мегакариоцитарный лейкоз.
EXPERIENCE IN DIAGNOSING RARE BLOOD SYSTEM TUMORS IN LABORATORY MICE
V.N. Manskikh, O.S. Gancharova M.V. LomonosovMoscow State University, Moscow 73, Leninskie Gory, 119992-Moscow, Russia, e-mail: [email protected]
The paper presents 4 cases of rare tumors in laboratory mice: mastocytoma of mandibular lymph node, megakaryocyte leukemia, splenic erythroblastoma (non-disseminated erythroleukemia) and splenic marginal zone lymphomas. The last 3 neoplasms were first diagnosed as spontaneous tumors in animals without genetic modification. Particular attention was drawn to the diagnostic features and characteristics of these tumors in comparison with the cases described in the literature.
Key words: tumors in laboratory mice, mastocytoma, splenic marginal zone lymphomas, splenic erythroblastoma, megakaryocyte leukemia.
Опухоли системы крови являются одними из самых часто встречающихся новообразований у лабораторных мышей. Однако помимо мажорных неоплазм, таких как фолликулярная, лимфобласт-ная, диффузная крупноклеточная лимфомы и миелоидный лейкоз, встречаются и более редкие опухоли, которые недостаточно описаны в литературе, и их диагностика может представлять известные трудности. Настоящая статья посвящена описанию серии верифицированных авторами случаев редких спонтанных опухолей системы крови у лабораторных мышей с акцентированием внимания на их диагностических особенностях.
Материал и методы
Материалом для данной работы послужили сопроводительные документы к гистологическим образцам, протоколы вскрытий и гистологические препараты, хранящиеся в архиве гистопа-тологической лаборатории НИИ митоинженерии МГУ им. М.В. Ломоносова. Все исследования производились с соблюдением этических правил
Европейской директивы FELASA-2010. Гистологические образцы фиксировались 10 % формалином на фосфатном буфере (рН=7,4) и подвергались стандартной процедуре гистологической проводки (через изопропанол) для заливки в парафин. Срезы толщиной 4 мк окрашивали гематоксилин-эозином и, в зависимости от задач, по Ван-Гизону, Массону, Браше, Перльсу, Лепене, толуидиновым синим, быстрым синим люксолем по Клюверу-Бареру, ШИК, азур-эозином по Гимза. Опухоли диагностировали, ориентируясь на критерии ВОЗ [4] и более поздние классификации Bethesda Group [7, 10]. Результаты и обсуждение Мастоцитома мандибулярного лимфатического узла. Мышь СВА, самец, возраст 816 дней, конвенциональный виварий Института экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина, спонтанная смерть.
Волосяной покров на туловище возле правой передней конечности имеет проплешину, покрытую корочками. На некропсии в районе поднижнече-
В.Н.
Рис. 1. Микрофото.
Мастоцитома нижнечелюстного лимфатического узла, капсула отделяет опухолевую ткань (верхняя половина рисунка) от поднижнечелюстной слюнной железы. Окраска гематоксилином и эозином, х400
люстной слюнной железы было обнаружено беловатое узловое образование 9^5x4 мм (массой 234 мг), плотной консистенции, окружённое капсулой. Масса селезёнки (76 мг) была несколько больше по сравнению с обычной массой селезёнки у старых животных (30-60 мг). Кроме описанной опухоли, при некропсии и гистологическом исследовании у данной мыши были выявлены гепатоцеллюляр-ная карцинома и тотальная гнойная пневмония (основная причина смерти) с массивными плазмо-цитарными перибронхиальными инфильтратами, характерными для инфекции Mycoplasma pulmonis. Прочие органы изменений не имели.
Гистологическое исследование показало, что узел состоит из солидной ткани, образованной полигональными клетками с небольшими тёмными круглыми ядрами и широкой мелкозернистой эозинофильной цитоплазмой (рис. 1). Митозы среди клеток опухоли отсутствовали. Строма в опухоли была очень скудной, а от ткани слюнной железы её отделяла хорошо выраженная капсула. Инфильтрации лимфоцитами не отмечено, однако были обнаружены структуры, в которых легко узнать остатки мозговых тяжей лимфатического узла. При обработке толуидиновым синим зернистость в цитоплазме клеток опухоли демонстрировала яркое метахроматическое окрашивание, однако реакция с синим быстрым люксолем была негативной. Окраска толуидиновым синим выявила
Г, О.С. ГАНЧАРОВА
замещение красной пульпы селезёнки лаброцитами и отдельные тучные клетки в синусоидах печени, которые не обнаруживались на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином.
Мастоцитома (мастоцитарная саркома) - исключительно редкая опухоль, встречающаяся с частотой порядка 1:5000 животных [8, 9]. Несмотря на очень специфическую морфологию лаброцитов, диагностика этой неоплазмы довольно сложна. Опухолевые тучные клетки сильно отличаются от своего нормального аналога и по общей морфологии (эпителиоидные, веретеновидные), и по характеру роста (трабекулярные и солидные структуры). Цитоплазма их может иметь любые тинкториальные свойства, до яркой эозинофильной окраски включительно [4, 7-9] (как было в нашем случае), поэтому необходимость применения ме-тахроматических реакций для поиска признаков тучноклеточной дифференцировки может быть совсем неочевидной.
Ещё одним малоизвестным моментом служит то, что гранулы в эозинофильной цитоплазме клеток совсем другой опухоли - онкоцитомы - дают такое же метахроматическое окрашивание, как и тучные опухолевые элементы [11]. Однако гранулы в клетках онкоцитомы являются многочисленными митохондриями и дают позитивное окрашивание с синим быстрым люксолем [11], тогда как в гранулах тучных клеток эта реакция отрицательна (что и наблюдалось в нашем случае). Инфильтрация тучными клетками печени и красной пульпы селезёнки тоже вполне подтверждает диагноз мастоцитомы, хотя в целом лейкемизация этих опухолей происходит крайне редко. Также рекомендуемой диагностической реакцией является определение высокой активности хлорацетатэстеразы [4, 7], которая, однако, является общим маркером всех миелоид-ных клеток и может быть утеряна при длительном хранении материала в формалине.
Эритроидный лейкоз (эритробластома селезёнки). Линия BALB/c, самец, возраст 763 дня, SPF-виварий Института биоорганической химии РАН им. Шемякина и Овчинникова (группа из 400 животных в возрасте от 12 до 30 мес). Спонтанная гибель.
Макроскопически определялись кахексия, умеренная спленомегалия (размеры: 19x5x3 мм, масса 190 мг) с небольшим булавовидным утолщением селезёнки на каудальном конце. Цвет селезёнки
был темно-красный, без чёткого рисунка на разрезе. Печень была уменьшена в размере и массе (0,89 г), имела небольшие желтоватые нечёткие пятна на поверхности и заметные признаки аутолиза. В других органах изменений не выявлено.
Гистологическое исследование селезёнки показало полное замещение её красной и белой пульпы диффузной тканью, состоящей из эритроидных клеток разной степени зрелости (рис. 2, А). Среди них встречалось некоторое количество эритробла-стов и базофильных нормобластов, однако гораздо больше оказалось число полихроматофильных и оксифильных клеток (рис. 2, Б), что было особенно хорошо видно на препаратах, окрашенных по Гимза. Митозы встречались часто. Особо выделялся большой полиморфизм ядер эритроидных клеток - отмечены многочисленные бинуклеарные формы и ядра в форме трефа. При окраске по Браше большинство клеток не проявляло пиронинофилии, однако давало положительную реакцию Лепене на гемоглобин. В других органах изменений не выявлено. Костный мозг не был взят для исследования по техническим причинам.
Эритроидный лейкоз у мышей диагностируется по эритроидной морфологии опухолевых клеток, экспрессии ими CD71+ и Ly-76(Ter119)ы или другим доступным маркерам эритроидного ростка [4, 7], в том числе и гемоглобину [2, 4]. В нашем случае указанные антитела против антигенов мыши были недоступны, поэтому таким маркером выступила окраска на гемоглобин по Лепене, которая дала положительный результат. Особенность случая состояла в изолированном опухолевом поражении селезёнки, которое может быть названо «эритро-бластомой». Такая форма эритроидной неоплазии в классификациях отсутствует, однако миелоидные саркомы у мышей описаны [7]. Всего в мировой литературе до настоящего времени описано 2 случая спонтанной эритроидной лейкемии у лабораторных мышей (все в виде диссеминированного лейкоза) [2], хотя этот тип неоплазм может быть индуцирован онкогенными вирусами Раушера, Грэффи и Фрейнда. Селезёнка считается первичным очагом эритролейкемии, откуда затем идёт её гематогенное распространение с преимущественным поражением печени, но без вовлечения лимфатических узлов [4].
Мегакариоцитарный лейкоз. Линия SJL, самка, возраст 12 мес, SPF-виварий Института биооргани-
Рис. 2. Микрофото. Эритроидный лейкоз (эритробластома) селезёнки: А - замещение пульпы диффузной тканью. Окраска гематоксилином и эозином, *50; Б - морфология эритроидных опухолевых клеток. Окраска гематоксилином и эозином, *1000.
ческой химии РАН им. Шемякина и Овчинникова. Контрольное животное в эксперименте с индукцией хронического гломерулонефрита. Спонтанная гибель.
При некропсии были обнаружены увеличенная серовато-коричневая селезёнка (23*5*3 мм, масса 320 мг) и полнокровная красно-коричневая печень, тоже увеличенная (2 610 мг). Почки имели большую массу (правая - 0,34 мг, левая - 0,32 мг) и тёмно-коричневую поверхность с заметными желтоватыми пятнами. Лимфатические узлы разных групп: мандибулярные (правый и левый - 10*7*6 и 5*5*5 мм соответственно), медиастинальные (5*3*3 мм), левый паховый
В.Н. МАНСКИХ, О.С. ГАНЧАРОВА
32 -
Рис. 3. Микрофото. Мегакариоцитарный лейкоз: А - замещение структур селезёнки опухолевой тканью с большим числом мегакариоцитов.
Окраска гематоксилином и эозином, х50; Б - морфология опухолевых клеток. Окраска гематоксилином и эозином, х1000
(3x3x1 мм) и мезентериальный (20x5x3 мм) - резко увеличены, содержали участки кровоизлияний. Петли тощей кишки были спаяны между собой сероватой тканью в неразделимый конгломерат, размером 20x15x15 мм, причём части кишечника проксимальнее опухоли были резко расширены и переполнены застойным содержимым (кишечная непроходимость).
Микроскопическая картина поражений была достаточно выразительна. Вся красная и почти вся белая пульпа селезёнки замещена опухолевой тканью, состоящей из бластов и многочисленных мегакариоцитов разной степени зрелости (рис. 3). Митозы были нередки. Нормальные структуры в
увеличенных лимфатических узлах также были целиком замещены гомогенной тканью, состоящей из бластных клеток. Аналогичная картина имелась в разрастаниях опухолевой ткани в брюшной полости с вовлечением петель кишечника. Инфильтраты из бластов обнаруживались в печени и в почках. В крови на срезах крупных сосудов отмечены отдельные бластные клетки, огромные скопления тромбоцитов и их агрегаты.
Мегакариоцитарный лейкоз у мышей - очень редкая форма неоплазм крови, возникающая при наличии в геноме ретровируса (MuLV) [4, 5]. Напротив, реактивная гиперплазия мегакариоцитар-ного ростка в красной пульпе селезёнки - довольно известная форма ответа на инфекцию, интоксикацию или опухоль [4]. В данном случае дифференциальный диагноз основывался на том, что системное поражение возникло как единственный случай у контрольного SPF-животного достаточно зрелого возраста, в котором обычно появляются опухоли у мышей, т.е. инфекции и интоксикации исключены.
Гистологически картина характеризовалась обилием не только мегакариоцитов на разных стадиях созревания, но и бластов с субтотальным замещением ими ткани селезёнки и лимфатических узлов. Реакция на ацетилхолинэстеразу и окрашивание антителами к тромбоцитарному гликопротеину lib/ IIIa или CD41, рекомендуемые для подтверждения мегакариоцитарной природы лейкоза [4, 7], в данном случае не требовались, так как опухолевые клетки проявляли выраженную склонность к созреванию. Впрочем, эти окраски и не могли быть проведены, поскольку для них требуется свежий материал, который невозможно было сохранить до момента исследования. Важно отметить, что в нашем случае, как и в тех, которые описаны другими авторами, активная дифференцировка мегакариоцитов была видна только в селезёнке, а в других сайтах инфильтраты состояли почти исключительно из бластных клеток.
Лимфома маргинальной зоны селезёнки. Линия BALB/c, самка, возраст 25 мес, SPF-виварий Института биоорганической химии РАН им. Шемякина и Овчинникова (группа из 60 животных одного возраста). Эвтаназия.
Макроскопически были отмечены только спленомегалия (размеры селезёнки: 27^5^3 мм) и небольшое увеличение фолликулов белой
пульпы. Гистологически (рис. 4) было выявлено резкое расширение светлой маргинальной зоны с тенденцией к слиянию фолликулов. Расширенная маргинальная зона состояла из клеток типа центро-бластов, центроцитов и моноцитоидных элементов без выраженного полиморфизма и с редкими митозами. В центре фолликулов и в красной пульпе были отмечены скопления гемосидерофагов. В печени и лёгких имелись небольшие инфильтраты (перипортальные и перибронхиальные), состоящие в основном из малых лимфоцитов.
Диагноз в нашем случае особых трудностей не представлял ввиду очень характерной гистологической картины, полностью отвечающей диагностическим критериям лимфомы маргинальной зоны селезёнки низкого грейда (резкое увеличение маргинальной зоны фолликулов за счёт пролиферации бластных клеток, центроцитоподобные и моноцитоидные клеточные элементы) [3, 6, 10]. Эту опухоль можно назвать условно-редкой неоплазмой мышей, поскольку она встречается, иногда в высоком проценте случаев, у ряда генетически-модифицированных и довольно экзотических линий (нокаут по гену р53, носители вируса мышиной лейкемии NFS.V+, линии NZB, AKXD RI и некоторых других) [1, 3, 6]. Однако у животных из линий, наиболее часто используемых для тестирования канцерогенной активности (BALB/c, C57BL, DBA), случаи лимфомы маргинальной зоны селезёнки пока не описаны, что связано, по-видимому, как с низкой частотой встречаемости этой опухоли, так и с недостаточной осведомленностью исследователей о её диагностических критериях (это новообразование не упоминается в классификации ВОЗ [4], хотя имеется в классификации Bethesda Group [10]). Можно предположить, что такие случаи обычно оказывались в одной рубрике с наиболее похожими на них, но несравненно более частыми фолликулярными лимфомами, и что в дальнейшем сообщения об этих неоплазмах у мышей будут публиковаться чаще.
В заключение мы хотели бы высказать благодарность проф. В.М. Перельмутеру за важные замечания при обсуждении сложных и нетривиальных случаев дифференциальной диагностики опухолей у лабораторных животных.
Рис. 4. Микрофото. Лимфома маргинальной зоны селезёнки. Окраска гематоксилином и эозином, *50
ЛИТЕРАТУРА
1. Chiang Y.J., Difilippantonio M.J., Tessarollo L., Morse H.C., Hodes R.J. Exon 1 disruption alters tissue-specific expression of mouse p53 and results in selective development of B cell lymphomas // PLoS One. 2012. Vol.7 (11). e49305. doi: 10.1371/journal.pone.0049305.
2. Edamoto H., Suwa K., Tamura K. Spontaneous Erythroid Leukemia in a 6-Wk-Old Male Crlj:B6C3F1 Mouse // J. Toxicol. Pathol. 2007. Vol. 20. P. 101-104.
3. Fredrickson T.N., LennertK., Chattopadhyay S.K., MorseH.C. 3rd, Hartley J.W. Splenic marginal zone lymphomas of mice // Am. J. Pathol. 1999. Vol. 154 (3). Р. 805-812.
4. Frith C.H., Ward J.M., Harleman J.H. et al. Hematopoietic system // International classification of rodent tumors. The mouse. Berlin: Springer, 2001. P. 417-451.
5. Hao X., Shin M.S., Zhou J.X., Lee C.H., Qi C.F., Naghashfar Z., Hartley J.W., Fredrickson T.N., Ward J.M., Morse H.C. 3rd. Histologic and molecular characterizations of megakaryocytic leukemia in mice // Leuk. Res. 2006. Vol. 30 (4). Р. 397-406.
6. Hori M., Xiang S., Qi C.F., Chattopadhyay S.K., Fredrickson T.N., Hartley J.W., Kovalchuk A.L., Bornkamm G.W., Janz S., Copeland N.G., Jenkins N.A., Ward J.M., Morse H.C. 3rd. Non-Hodgkin lymphomas of mice // Blood Cells Mol. Dis. 2001. Vol. 27 (1). Р. 217-222.
7. Kogan S.C., Ward J.M., AnverM.R., Berman J.J., Brayton C., Cardiff R.D., Carter J.S., de Coronado S., Downing J.R., Fredrickson T.N., Haines D.C., Harris A.W., Harris N.L., Hiai H., Jaffe E.S., MacLennan I.C., Pandolfi P.P., Pattengale P.K., Perkins A.S., Simpson R.M., Tuttle M.S., Wong J.F., Morse H.C. 3rd. Bethesda proposals for classification of non-lymphoid hematopoietic neoplasms in mice // Blood. 2002. Vol. 100 (1). Р. 238-245.
8. Lewis D.J., Offer J.M. Malignant mastocytoma in mice // J. Comp. Pathol. 1984. Vol. 94 (4). Р. 615-620.
9. Majeed S.K. Mast cell tumours in CD-1 mice // Arzneimittelforschung. 1991. Vol. 41 (2). Р. 175-178.
10. Morse H.C. 3rd, Anver M.R., Fredrickson T.N., Haines D.C., Harris A.W., Harris N.L., Jaffe E.S., Kogan S.C., MacLennan I.C., Pattengale P.K., Ward J.M. Bethesda proposals for classification of lymphoid neoplasms in mice // Blood. 2002. Vol. 100 (1). Р. 246-258.
11. Pilch B.Z. Head and Neck Surgical Pathology. Philadelphia: Lippincott Williams&Wilkins, 2000. 736 p.
Поступила 25.02.14
