CC BY
65
УДК 616-006.04
ОПУХОЛЕВЫЙ СУПРЕССОР ARF АКТИВИРУЕТ СЕЛЕКТИВНУЮ АУТОФАГИЮ МИТОХОНДРИЙ - МИТОФАГИЮ © Будина А.П.1'2, Соловьев А.С.1
1 Смоленская государственная медицинская академия, Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, 28 2Институт Вистар, США, 19104, Филадельфия, ул. Спрус, 3601
Резюме: Неуклонный рост частоты онкологических заболеваний диктует необходимость изучения молекулярных механизмов канцерогенеза и принципов работы опухолевых супрессоров. В данном исследовании была изучена роль опухолевого супрессора ARF в активации селективной деградации митохондрий (митофагии). В экспериментах на клетках остеосаркомы человека было показано, что повышение экспрессии ARF приводит к деполяризации мембран митохондрий и активации аутофагии, при которой поврежденные митохондрии целенаправленно доставляются в аутофагосомы и элиминируются в процессе митофагии.
Ключевые слова: аутофагия, митохондрии, митофагия, опухолевый супрессор, ARF
ARF TUMOR SUPPRESSOR ACTIVATES SELECTIVE DEGRADATION OF MITOCHONDRIA - MITOPHAGY Budina A.P.12, Soloviev A.S.1
1Smolensk State Medical Academy, Russia, 214019, Smolensk, Krupskaya St., 28 2The Wistar Institute, USA, 19104, Philadelphia, Spruce St., 3601
Summary: Increased rate of cancer cases contributes to the necessity to study molecular mechanisms of malignant transformation as well as molecular basis of tumor suppression by tumor suppressor genes. In this paper the role of ARF tumor suppressor in activating selective degradation of mitochondria (mitophagy) is discussed. With a osteosarcoma cell line, it was demonstrated that ARF overexpression leads to mitochondrial membrane depolarization and autophagy activation, in which damaged mitochondria are selectively delivered to autophagosomes for degradation by the process called mitophagy.
Key words: autophagy, mitochondria, mitophagy, tumor suppressor, ARF
Введение
Опухолевый супрессор ARF (от английского Alternative Reading Frame) кодируется Ink4a/ARF локусом, который находится на 9 хромосоме и подвергается мутациям в 40% опухолей человека [1-10]. Уровень ARF (белок p14 у человека и p19 у мышей) в нормальных клетках очень низок. Однако в ответ на активацию онкогенов, таких как ras, myc, E2F1, E1a, v-Abl и других, экспрессия ARF значительно увеличивается. Активированный ARF стабилизирует опухолевый супрессор p53, что приводит к остановке клеточного цикла и запрограммированной гибели клетки. В то же время ARF может действовать как опухолевый супрессор независимо от присутствия p53 в клетке и повышение его экспрессии в опухолевых клетках приводит к остановке клеточного цикла и апоптозу даже при отсутствии в них опухолевого супрессора p53 [13]. Данные наблюдения привели к активному поиску механизмов с помощью которых ARF подавляет канцерогенез. Было показано, что ARF взаимодействует в ядре с нуклеофосмином (B23), что сопровождается ингибированием синтеза и транспорта рРНК в цитоплазму, уменьшением количества зрелых рибосом и приводит к нарушению роста опухолевых клеток [3, 7]. Также было показано, что ARF регулирует транскрипцию онкогенов Myc, E2F1 и DP1 путем непосредственного взаимодействия с ними. Данная функция ARF не зависит от статуса p53 в клетке [4].
Было установлено, что ARF локализуется в митохондриях и индуцирует неселективную аутофагию [2, 9]. В последние десятилетия благодаря усовершенствованию технологических приемов было доказано существование селективной аутофагии [11, 14], в том числе селективной деградации митохондрий (митофагии) [6]. Оказалось, что митофагия играет важное значение в жизни клеток как в нормальных условиях, так и при патологии [8, 12]. Однако молекулярные
механизмы активации митофагии до конца не выяснены. В то же время изучение механизмов защиты клетки от дисфункции митохондрий позволит найти более эффективные пути борьбы с онкологическими и нейродегенеративными заболеваниями.
Целью исследования являлось изучение роли транскрипционного фактора АИР в процессе селективной деградации митохондрий.
Объектом исследования служили клетки остеосаркомы человека (U2OS) с внедренным в них вектором ARF. Экспрессия ARF в данной клеточной линии контролируется присутсвием в среде доксициклина. Культивирование клеток в присутствии 100 нг/мл доксициклина приводит к увеличению продукции ARF до уровня, сравнимого с количеством ARF в некоторых опухолях. Локализация транскрипционного фактора ARF в митохондриях подтверждалась выделением митохондриальной фракции (Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells, PIERCE, США) и последующим анализом ее методом Вестерн блоттинга с использованием антител к ARF (Abcam, США), GRP75 и PCNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, США). Мембранный потенциал митохондрий измерялся флоуцитометрическим анализом с использованием Guava Mitochondrial Depolarization Kit (Millipore, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Способность ARF индуцировать аутофагию/митофагию изучалась после повышения экспрессии ARF следующими методами: 1) методом иммуноблотинга с использованием антител к белкам p62/SQSTM1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, США), LC3 (Novus Biologicals, США), актин (Sigma, США), p53 (Calbiochem, США) и белкам митохондрий BAK NT (Upstate, США) и NIX (Sigma, США); 2) методом иммуноцитофлюоресцентного анализа с использованием плазмиды, содержащей маркер аутофагии белок LC3, меченный зелёной флюоресцентной меткой и маркера митохондрий MitoTracker Red CMXRos (Invitrogen, США); 3) методом иммуноцитофлюоресцентного анализа массы митохондрий с использованием клеток остеосаркомы, содержащих митохондриальный маркер DsRed (Clontech, США), с последующей оценкой количества митохондрий с помощью программы ImageJ.
Ошибки измерений анализировали путем расчета стандартного отклонения по формуле:
где о - стандартное отклонение, xi - ьй элемент выборки, т - среднее арифметическое значение выборки, п - объем выборки. В каждом случае проводили не менее 3 измерений. Высота полосы ошибки измерения на представленных графиках равняется одному стандартному отклонению.
Результаты исследования и их обсуждение
Исследования показали, что увеличение экспрессии ARF в клетках остеосаркомы сопровождалось деградацией белка p62 (входит в состав аутофагосомы и деградирует в процессе аутофагии) и накоплением расщепленной формы белка LC3, что свидетельствует об активации ARF опосредованной аутофагии. Наблюдалось также повышение экспрессии p53 в результате индукции ARF, что соответствует хорошо изученной роли ARF по стабилизации опухолевого супрессора p53 (рис. 1-A). Для доказательства митохондриальной локализации белка ARF была выделена митохондриальная фракция из клеток остеосаркомы до и после индукции ARF. Вестерн блоттинг анализ показал, что часть белка ARF действительно локализуется в митохондриях (рис. 1-Б). Отсутствие в этой фракции цитоплазматического/ядерного белка PCNA и присутствие митохондриального белка GRP75 служили контролем чистоты митохондрий в данном эксперименте.
Учитывая, что митохондриальный трансмембранный потенциал (Дут) тесно связан с функциональным состоянием митохондрий в клетке, мы измерили Дут в U2OS-ARF клетках с отсутствием, либо повышенным уровнем опухолевого супрессора ARF. Кроме того, в качестве положительного контроля к данному эксперименту было проанализировано изменение Дут в клетках остеосаркомы инкубированных с протонофором CCCP (carbonyl cyanide ш-chlorophenyl
Методика
X (xi - m) 2
n- 1
Иуёга/опе), способным разобщать окислительное фосфорилирование путём повышения протонной проводимости через бислойные участки мембраны. Флоуцитометрический анализ выявил, что повышение экспрессии АКР в клетке приводит к деполяризации митохондрий до уровня, сравнимого с СССР.
Рис. 1. Активация опухолевого супрессора АИР индуцирует неселективную аутофагию и деполяризацию мембран митохондрий: А - Вестерн блоттинг анализ клеточного лизата, полученного до и после активации АИР в и208-АЯР клетках, достигнутой инкубацией их с доксициклином в течение 48 часов; Б - вестерн блоттинг анализ содержания АИР в митохондриальной фракции клеток остеосаркомы после повышения экспрессии белка доксициклином; В - количественный анализ клеток содержащих деполяризованные митохондрии в клетках И208-АЯР с повышенной экспрессией АИР или после их инкубации с ионофором СССР (в % по сравнению с контролем)
Известно, что изменение мембранного потенциала митохондрий является ключевым звеном в запуске митохондриального пути каспазного каскада во время апоптоза. В то же время было показано, что АИР не активирует митохондриальный путь активации апотоза [1]. Учитывая эти данные можно предположить, что опухолевый супрессор АИР активирует селективную аутофагию митохондрий, с помощью которой клетка элиминирует поврежденные митохондрии.
Для проверки данного предположения был использован метод изучения митофагии - исследование локализации аутофагосом с митохондриями с помощью конфокальной микроскопии. Активация деградации митохондрий сопровождается образованием аутофагосом, в которые доставляются поврежденные митохондрии. Таким образом, при использовании различных флуоресцентных меток для аутофагосом (например зеленой метки) и для митохондрий (например красной метки) можно наблюдать наложение спектров при активации митофагии. Следуя данной методике, мы трансфецировали клетки остеосаркомы И208-АКР двумя векторами: 1) вектором рБзКеё-МНо, содержащим красный флуоресцентный белок БзИеё слитый с сигналом локализациии в митохондриях от эукариотической формы цитохром с-оксидазы; 2) вектором вРР-ЬСЭ, содержащим белок аутофагосом ЬС3, меченный зеленой меткой вРР. Внедрение вектора рБзКеё-МИо в клетки привело к флуоресцентному окрашиванию 100% митохондрий. Внедрение вРР-ЬС3 вектора необходимо для регистрации аутофагосом, так как при активации аутофагии белок ЬС3 накапливается на аутофагосомах, что приводит к накоплению вРР в цитоплазматических вакуолях-аутофагосомах. Была проведена конфокальная микроскопия полученной клеточной культуры после инкубации клеток с доксициклином (для повышения экспрессии АИР) по сравнению с контролем. Результаты микроскопии показали, что в клетках с повышенным содержанием АИР маркер митохондрий Мко-БзКеё локализован в тех же субклеточных компартментах, что и зеленый белок аутофагосом вРР-ЬС3 (рис. 2-А, наложение спектров указано стрелками). Эти данные говорят об активации деградации митохондрий при экспресии АИР.
Для исследования влияния активности АКР - опосредованной аутофагии на количество митохондрий проводилось культивирование клеток остеосаркомы с мечеными красным флуорохромом митохондриями в присутствии доксициклина в течении 48 часов. Изменение флуоресценции оценивали методом конфокальной микроскопии. Было найдено, что количество клеток, содержащих митохондрии было значительно меньше после индукции АКР по сравнению с контролем. Количественный анализ площади митохондрий показал, что в результате экспрессии АКР площадь клеток содержащих митохондрии уменьшилась в 5 раз (рис. 2-В). Митохондрии, не подвергшиеся деградации, формировали взаимосвязанную тубулярную сеть (рис. 2-Б, указано стрелкой). Можно предположить, что изменение морфологии митохондрий защищает их от митофагии так как, по-видимому, размер тубулярных органелл превышает размер аутофагосом.
Рис 2. Опухолевый супрессор АКР активирует селективную деградацию митохондрий: А и Б -иммуноцитофлуоресцентный анализ клеточной линии и208-АКР до и после активации АКР, достигнутой инкубацией клеток с доксициклином в течение 48 часов; В - таблица отражает количественный анализ площади клеток, содержащих меченные флуорохромом митохондрии в эксперименте
Рис. 3. ARF активирует деградацию белков митохондрий клеток остеосаркомы (U2OS-ARF): А - Вестерн блоттинг анализ уровня митохондриальных белков BAK NT, NIX, цитохром c а также маркера аутофагии p62 до и после инкубации клеток остеосаркомы с доксициклином; Б - Количественный анализ белка митохондрий BAK NT и маркера аутофагии p62 в U2OS-ARF клетках до и после индукции метаболического стресса буфером HBSS
Если ARF действительно активирует митофагию, то экспрессия ARF должна сопровождаться уменьшением уровня митохондриальных белков в клетке. Вестерн блоттинг анализ подтвердил, что активация ARF-опосредованной аутофагии в клетках остеосаркомы человека приводит к деградации белков митохондрий, таких как NIX, BAK NT и цитохром с (рис. 3-А). Полученные результаты свидетельствуют о селективном характере ARF-индуцированной аутофагии.
Активация аутофагии в И208-АИР клетках подвергшихся голоданию, достигнутому инкубацией клеток с ИБ88 буфером, носила неселективный характер. При этом активация аутофагии не сопровождалась изменением уровня митохондриального белка БАК КТ (рис. 3-Б).
Заключение
Полученные данные доказывают роль опухолевого супрессора АИР в активации селективной деградации митохондрий. Увеличение экспрессии АИР сопровождается деполяризацией мембран митохондрий с последующей активацией аутофагии, при которой поврежденные митохондрии целенаправленно доставляются в аутофагосомы и элиминируются в процессе митофагии. В этом процессе, по-видимому, важную роль играет митохондриальная локализация опухолевого супрессора АИР.
Литература
1. Пимкина Ю.С. Роль опухолевого супрессора ARF в канцерогенезе и молекулярных механизмах активации аутофагии: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Санкт-Петербург, 2009. - 23 с.
2. Abida W.M., Gu W. p53-Dependent and p53-independent activation of autophagy by ARF // Cancer Res. -2008. - V.68. - P. 352-357.
3. Brady S.N. ARF impedes NPM/B23 shuttling in an Mdm2-sensitive tumor suppressor pathway // Mol. Cell. Biol. - 2004. - V.24. - P. 9327-9338.
4. Datta A. Myc-ARF (alternate reading frame) interaction inhibits the functions of Myc // J. Biol. Chem. -2004. - V.279. - P. 36698-36707.
5. De Duve C.R. Wattiaux Functions of lysosomes // Ann. Rev. Physiol. - 1966. - V.28. - P. 435-492.
6. Elmore S.P. The mitochondrial permeability transition initiates autophagy in rat hepatocytes // FASEB J. -2001. - V. 15. - P. 2286-2287.
7. Yu Y. Nucleophosmin is essential for ribosomal protein L5 nuclear export // Mol. Cell. Biol. - 2006. - V.26. -P. 3798-3809.
8. Kitada T. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism // Nature. - 1998. -V.392. - P. 605-608.
9. Pimkina J. ARF induces autophagy by virtue of interaction with Bcl-xl // J. Biol. Chem. - 2009. - V.284. - P. 2803-2810.
10. Quelle D.E. Alternative reading frames of the INK4a tumor suppressor gene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycle arrest // Cell. - 1995. - V.83. - P. 993-1000.
11. Tuttle D.L., Lewin A.S., Dunn W.A. Selective autophagy of peroxisomes in methylotrophic yeasts // Eur. J. Cell. Biol. - 1993. - V.60. - P. 283-290.
12. Valente E.M. Hereditary early-onset Parkinson's disease caused by mutations in PINK1 // Science. - 2004. -V.304. - P. 1158-1160.
13. Weber J.D. p53-Independent functions of the p19 (ARF) tumor suppressor // Genes. Dev. - 2000. - V.14. - P. 2358-2365.
14. Zheng Y.T. The adaptor protein p62/SQSTM1 targets invading bacteria to the autophagy pathwa // J. Immunol. - 2009. - V.183. - P. 5909-5916.
Информация об авторах
Будина Анна Павловна - соискатель кафедры медицинской биологии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России, стажер-исследователь онкологического центра Фокс Чэйз (Fox Chase), Филадельфия, США. E-mail: annbudina@gmail.com
Соловьев Александр Семенович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой медицинской биологии ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России. E-mail: aleksandr_solovev_1946@mail.ru
