CC BY
60
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІ
УДК 577(087.1+112.4)
ОПТИМІЗАЦІЯ УМОВ СИНТЕЗУ КОН’ЮГАТІВ ПРОТЕЇНУ А З КОЛОЇДНИМ ЗОЛОТОМ ТА РОЗРОБЛЕННЯ ПІДХОДІВ ДЛЯ ЇХ ХАРАКТЕРИСТИКИ
А. Ю. Лабинцев О. С. Олійник
A. А. Кабернюк О. Ю. Чуніхін
B. Ф. Горчев
Т. О. Курченко В. І. Чернишов Д. В. Колибо
Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ
E-mail: lab.andrey@gmail.com
Оптимізовано метод отримання кон’югатів наночастинок золота з рекомбінантним фрагментом протеїну А Staphylococcus aureus для використання в імунохроматографічних тест-системах. Проаналізовано вплив основних компонентів реакційної суміші на розмір частинок золота та його кон’югатів з фрагментом протеїну А, їхню гомогенність, стабільність та ефективність розпізнавання імуноглобулінів. Запропоновано методи для швидкого визначення розмірів синтезованих наночастинок золота з використанням оптичних характеристик. На основі одержаних результатів висунуто рекомендації щодо отримання кон’югатів наночастинок золота з фрагментом стафілококового протеїну А, які можна застосовувати у швидких іммунохроматографічних тест-системах.
Ключові слова: наночастинки золота, протеїн А, Staphylococcus aureus, імуноглобулінзв’язувальна
активність, імунохроматографічні тест-системи, електронна мікроскопія, лазерна кореляційна спектроскопія, спектрофотометрія, RGB-спектр.
Нанобіотехнологія — новітня галузь на-нотехнології, що займається питаннями розроблення та використання наноматеріалів у біологічних дослідженнях та медицині. Одними з таких матеріалів є колоїди металів, які використовують для синтезу біо-кон’югатів наночастинок, отримання біо-сенсорних елементів для діагностики, доставлення біологічно активних речовин у клітину тощо [1].
Уперше кон’югати наночастинок золота почали застосовувати в електронній мікроскопії як маркери специфічних клітинних компартментів та клітинної локалізації певних біомолекул [2]. Здатність наночастинок міцно зв’язуватись із макромолекулами без втрати біологічних властивостей останніх [3], можливість створювати частинки різного розміру з метою візуалізації декількох компонентів клітини на одному препараті,
легкість детектування не лише в електронному та світловому мікроскопі, а й за відсутності допоміжних приладів, простота та невисока вартість виготовлення [4] свідчать про перспективність використання таких колоїдів у широкому спектрі біологічних досліджень. Перевагою наночастинок золота є також невибагливість до умов зберігання, оскільки вони не піддаються фотодегра-дації та достатньо стійкі не лише у колоїді, але й під час зберігання в сухому вигляді, нетоксичні, що робить їх зручними компонентами біосенсорних систем [5].
Одним із напрямів використання колоїдного золота є імунохімічні тести, які включають якісні та кількісні методи визначення вмісту певного антигену або антитіла у біологічній речовині, клітині або тканині. У такому разі як біоселективну молекулу для кон’югації з наночастинками золота зручно
використовувати стафілококовий протеїн А, який має імуноглобулінзв’язувальні властивості.
Протеїн А (SpA) — це секреторний білок масою 42 кДа, що продукується бактерією Staphylococcus aureus. У його структурі виділяють N-кінцевий сигнальний пептид S, п’ять гомологічних регіонів E, D, A, B, C, що складаються з 5б-б1 амінокислотних залишків [б] і утворюють схожі просторові структури у вигляді антипаралельно розташованих трьох а-спіралей [7], та С-кінцеву послідовність X, яка відповідає за зв’язування з клітинною стінкою бактерії [б]. Гомологічні регіони E, D, A, B, C SpA мають Ig-зв’язу-вальну здатність та взаємодіють з Fcy-фрагментами та Fab-фрагментами важких ланцюгів V^-родини як розчинних антитіл, так і експонованих на поверхні В-лімфо-цитів [8].
Для SpA є характерним вибіркове зв’язування з імуноглобулінами різних видів. Так, він добре взаємодіє з 1, 2 та 4 підкласами IgG людини, 1 та 2 підкласами IgG мурчака, 2а та 2b підкласами IgG миші й імуногло-булінами всіх класів макаки резус, свині та кроля. Менш інтенсивно SpA взаємодіє з 1 та З підкласами IgG миші й імуноглобуліна-ми всіх класів корови, собаки, коня, хом’ячка, вівці. Зв’язування IgM і IgA людини та IgM миші для SpA варіює [9, 10]. Визначення Fab-фрагментів за допомогою SpA не є ефективним [9].
Здатність SpA високоспецифічно взаємодіяти з антитілами на сьогодні широко використовують у біологічних дослідженнях. Так, на основі SpA та його рекомбінантних похідних виготовляють афінні сорбенти для швидкого і високоякісного очищення специфічних субкласів антитіл різних видів [10], створюють інструменти для аналізу вмісту антитіл та антигенів на поверхні клітин, ідентифікують антитілопродукуючі клітини [11], визначають імуноглобуліни в ІФА-аналізі й імуносенсорних системах.
Використана нами в роботі імунохрома-тографічна система ґрунтувалася на принципі латеральної протокової хроматографії, що працювала за таким принципом: на смужку хроматографічної нітроцелюлозної мембрани наносили антитіла, які проявляли розчином кон’югата наночастинок золота із SpA. Чутливість цього методу залежить від фізико-хімічних властивостей кон’югата наночасти-нок золота зі SpA і, зокрема, самого колоїдного золота, що входить до складу кон’югату.
Метою даної роботи було дослідити, як концентрація різних компонентів реакцій-
ної суміші впливає на характеристики синтезованих колоїдів наночастинок золота та їх кон’югатів зі SpA, а також підібрати методи для швидкого визначення основних характеристик колоїду. Створений кон’югат колоїдного золота зі SpA можна застосовувати для високочутливої візуалізації іму-ноглобулінів в імунохроматографії.
Матеріали і методи
Приготування зразків колоїдного золота
Для синтезу наночастинок колоїдного золота використовували натрійцитратний метод, заснований на відновленні цитратом натрію золотохлористоводневої кислоти [12]. Як допоміжні реагенти використовували розчини танінової кислоти та карбонату калію. У таблиці наведено склад різних варіантів реакційних сумішей, використаних для синтезу колоїдного золота. У кожному з випадків у різних пробірках попередньо нагрівали до б0 0С суміші (HAuCl4 +
Н2О) та (Na3C6H5O7 + К2СО3 + C76H52046),
змішували їх та інкубували при 60 0С. Інкубацію проводили протягом часу, необхідного для появи забарвлення; відповідно, для проб №1-б було достатньо 20 хв, пробу №7 інкубували впродовж 40 хв. Після цього пробірки інкубували при 0 0С та повністю охолоджували.
Кон’югація наночастинок колоїдного золота з рекомбінантним протеїном А
Процедура отримання рекомбінантного SpA була попередньо описана [13] і не відрізнялася від наведеної в даній роботі. Для кон’югації до синтезованих розчинів колоїдного золота додавали SpA у ЗФР (0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,144% Na2HPO4, 0,024% KH2PO4, pH 7,4): 25 мкл 0,1%-го розчину SpA на 1 мл розчину колоїдного золота. Інкубували протягом 40 хв при 0 0С. Після цього в кожну з проб додавали 10 мг сироваткового альбуміну бика та витримували ще впродовж 20 хв. Щоб вилучити незв’яза-ний SpA, частинки золота осаджували центрифугуванням протягом 40 хв за 13 000 g. Після осадження надосадову рідину видаляли, а осад розчиняли в 1 мл 0,2%-го цитрату натрію, що містив 10 мг/мл сироваткового альбуміну бика.
Дослідження характеристик отриманих колоїдів та кон’югатів на їх основі з використанням електронної мікроскопії
Отримані колоїдні розчини та кон’югати на їх основі досліджували методами електронної мікроскопії з використанням приладу
Таблиця 1. Склад реакційних сумішей для синтезу різних варіантів колоїдного золота
Реагент №проби 1%-й водний розчин HAuCl4, мкл 1%-й Na3C6^O7, мкл 1%-й К2СО3, мкл °,0З%-й C76H52O46 (танінова кислота), мкл Н2О, мкл
1 50 100 5 7,5 840
2 50 200 5 7,5 740
3 50 400 5 7,5 540
4 50 200 5 0 740
5 50 200 5 75 670
б 50 200 0 7,5 740
7 50 200 50 7,5 700
Hitachi H-600 (Hitachi High-Technologies Europe GmbH, Японія). Для вимірювання діаметра синтезованих частинок, згідно з даними електронної мікроскопії, застосовували програмне забезпечення ImageJ v 1.41o (NIH, USA). Кількість проаналізованих частинок колоїдного золота становила не менше 15 на пробу.
Дослідження характеристик отриманих колоїдів та кон’югатів на їх основі з використанням лазерної кореляційної спектроскопії
Для вивчення функції розподілу частинок за розміром використовували лазерний кореляційний спектрометр ZetaSizer-3 (Malvern Instrument, Великобританія). Метод ґрунтується на процесі розсіяння світла на будь-якому мікрооб’єкті, у даному випадку — наночастинках золота. У разі потрапляння на детектор вихідного та розсіяного світла виникає динамічна картина інтерференції, що притаманна для суми коливань з дуже близькими частотами, увесь інформаційний сигнал сконцентрувався в ділянці низьких частот, де його аналіз виконували за допомогою звичайних багатоканальних аналізаторів спектра. Розміри колоїдів золота вимірювали в оптичній скляній кюветі діаметром 10 мм у термостатованій лунці лазерного кореляційного спектрометра. Розсіяне випромінювання від гелійнеонового лазера ЛГ-111 потужністю 25 мВт та довжиною хвилі 633 нм вимірювали протягом 300-400 с та реєстрували на аналізаторі спектра multi computing correlator type 7032 се. Отриману автокореляційну функцію обробляли за допомогою комп’ютерної програми PCS-Size mode v1.52.
Спектрофотометричні дослідження та визначення RGB-координат отриманих колоїдів та кон’югатів на їх основі
Спектри поглинання колоїдів та їх кон’югатів отримували на спектрофотометрі СФ-
2000 (ОКБ «Спектр», Росія) у діапазоні хвиль 400-900 нм і визначали положення максимумів поглинання зразків, додатково вимірювали екстинкцію за 500 нм та 600 нм. Для одержання цифрових відбитків колоїдів та кон’югатів на їх основі досліджувані зразки вносили по 100 мкл у 96-лункову прозору планшету. З використанням сканера Epson Perfection 4990 Photo (Seiko Epson Corp., Японія) отримували цифрове зображення забарвлення кожної проби, з якого визначали RGB-координати зразка (за допомогою програмного забезпечення ImageJ v1.41o, NIH, USA).
Проведення імунохроматографічного аналізу
Для проведення імунохроматографічно-го аналізу було використано нітроцелюлозні мембрани Hi-Flow та набір для комплектації тест-систем Hi-Flow™ Plus Assembly Kit Plus (Millipore, США). До складу стрипу (тестової смужки), окрім нітроцелюлозної мембрани з іммобілізованими імуноглобулінами, входила також смужка для кон’югата колоїдного золота з протеїном А та адсорбуюча смужка, що вбирає надлишок вологи під час руху проби та кон’югата в товщі мембрани. Застосовували нітроцелюлозну мембрану розміром 5x30 мм. На смужку наносили 5 мкл розчину кон’югата колоїдного золота та висушували. Сироватки (в розведенні 1:100 та 1:1000 у ЗФР) наносили тонкою смугою, 30 хв витримували мембрану при 37 0С, після цього 30 хв у 5%-му розчині знежиреного молока в ЗФР, промивали та висушували. До нітроцелюлозної мембрани прикріплювали з одного боку смужку для кон’югата, з другого — адсорбуючу смужку таким чином, щоб вони на кілька міліметрів покривали нітроцелюлозну мембрану, після цього смужку для кон’югата покривали фільтрувальним папером. Для проведення аналізу стрип занурювали в ЗФР, за 10 хв фіксували появу червоної смуги, що з’являється внаслідок взаємодії між іммобілізованими на мембрані антитілами та кон’югованими
з наночастинками золота рекомбінантними фрагментами протеїну А, які рухаються в товщі мембрани.
Результати та обговорення
Проведення імунохроматографічних досліджень із застосуванням кон’югата протеїну А з колоїдними частинками металів потребує використання таких типів колоїдів, яким притаманні певні фізико-хімічні властивості. По-перше, колоїди повинні мати відповідний колір, який можна легко детек-тувати візуально (не лише в електронному та світловому мікроскопі, а й за відсутності допоміжних приладів) навіть за низьких концентрацій. По-друге, такі частинки мають якнайменше взаємодіяти з нітроцелюлозною поверхнею стрипа (не створювати фонового забарвлення). По-третє, вони повинні бути стабільними: мати низьку здатність до агрегації і зберігати свої оптичні та сорбцій-ні властивості впродовж тривалого часу.
Змінюючи концентрації основних реагентів для приготування колоїдного золота, можна впливати на вихідні оптичні та адсорбційні властивості колоїду. Так, нами були синтезовані колоїди золота за сімома методиками синтезу (див. «Матеріали і методи») і кон’юговані з рекомбінантним 8рА. Отримані наночастинки та їх кон’юга-ти зі 8рА було проаналізовано методами електронної мікроскопії, лазерної кореляційної спектроскопії, спектрофотометрії, а також проведено функціональні тести з метою виявлення найбільш оптимальної схеми синтезу колоїдів золота для імунохроматог-рафії.
Аналіз проб синтезованого колоїдного золота методом електронної мікроскопії
Важливим фактором під час роботи з колоїдним золотом та його кон’югатами зі 8рА є стандартизація умов одержання цих компонентів імунохроматографічної системи. Аналіз зразків колоїду методами електронної мікроскопії дав змогу визначити відмінності між пробами наночастинок золота, синтезованого за різними схемами, а також його кон’югатами зі 8рА. Розмір частинок колоїдного золота суттєво залежав від концентрації компонентів реакційної суміші, що була використана для його синтезу (рис. 1). Так, проба № 4, що не містила танінової кислоти, мала найбільші за розміром колоїди (37±10 нм). Додавання 7,5 мкл
0,03 %-ї танінової кислоти у пробі № 2 супроводжувалось зменшенням розміру части-
• * т * • .*■ н
* • • ЛГ ■* N •; ' , , ■ . •
1<-> 1(+) • І) * ^ *«♦)" ' !£=
' ^ Н.*' * ф и
% * 2<-) .!*= . * . 2(+) 51= - ■ Г^. Г*- \ . * б(-) £Лшш ’ ✓ 6<+) ’
" ’ к. ? V *• • « - Л
'•¿V * ■ ‘ і-3(.) *££-. і ' * . 'і ■» 3{+) * ч У ** % 7(-) * • -і- • 7(+) . -
^ ч .• - 1« 1
. •• г * « % • Чи ІІІЬ:
Рис. 1. Електронні мікрофотографії проб №№ 1—7 колоїдного золота [1(-)—7(-) відповідно] та кон’югатів проб №№ 1—7 колоїдного золота з протеїном А [1(+)—7(+) відповідно].
На гістограмі 8 подано результати розрахунків середніх значень розміру частинок колоїдного золота в кожній пробі за даними електронної мікроскопії згідно з програмою ImageJ
нок золота (14±2 нм); 10-кратний надлишок кислоти у пробі № 5 призвів до утворення найменших за розміром колоїдів (11±1 нм). Вплив на розмір частинок золота також мав цитрат натрію: збільшення його концентрації від 0,1 % (проба №1) до 0,2 % (проба №2) та 0,4 % (проба № 3) під час приготування колоїду призводило до зменшення розміру часток від 23±4 до 14±2 та 13±1 нм відповідно. Найменше вливав на розмір частинок карбонат калію, який, проте, за високої концентрації збільшував гетерогенність колоїду (22±1 нм, 23±3 нм у пробах № 6 та № 7 відповідно).
Як видно з електронних мікрофотогра-фій, поданих на рис. 1, частинки колоїдного золота без протеїну А (проби позначено міткою «-») залежно від складу середовища синтезу мали різну здатність до утворення агрегатів [1(-)-7(-)]; кон’югація частинок зі врА (проби позначено міткою «+») значно зменшувала розмір та кількість агрегатів [1(+)-7(+)]. У комплексі з протеїном також спостерігали зменшення гетерогенності частинок (рис 1.8). Отже, кон’югація золота зі врА виступає як стабілізатор розміру колоїду та запобігає його агрегації.
Аналіз проб синтезованого колоїдного золота методом лазерної кореляційної спектроскопії
Як альтернативний метод визначення розмірів частинок колоїдного золота застосовували лазерну кореляційну спектроскопію. Цей метод дозволяє визначати розмір на основі інтерференційної картини світлорозсіювання. Використання лазерної кореляційної спектроскопії виявилося не оптимальним для даного дослідження, оскільки умови проведення вимірювань збігаються з умовами виникнення явища плазмонного резонансу у частинках золота [1]. Це явище може впливати на результати, отримані за допомогою даного приладу. Однак, визначаючи розмір частинок за положенням максимумів інтенсивності світлорозсіювання, можна було помітити певну відповідність (коефіцієнт достовірності апроксимації R2 = = 0,81) між цими вимірами і розмірами частинок, розрахованих за даними електронної мікроскопії (рис. 2).
u Золото
^ Кон’югат золота з протеїном А
Рис 2. Порівняння розмірів частинок колоїдного золота за даними електронної мікроскопії та лазерної кореляційної спектроскопії
Аналіз проб синтезованого колоїдного золота методом спектрофотометрії
Дослідження спектральних характеристик колоїдів золота та їх кон’югатів зі 8рА показали наявність характерного піка поглинання для колоїдів без 8рА з максимумом у діапазоні 519-530 нм залежно від початкового складу реакційної суміші. Для колоїдів зі 8рА максимум поглинання зміщувався в бік довгих хвиль на 4-12 нм і для більшості проб становив 533-534 нм (рис. 3, А). Порівняння даних спектрофотометрії та електронної мікроскопії показало, що положення максимуму поглинання залежить (коефіцієнт достовірності R2 = 0,98) від роз-
5
X
га
2 515 -
530
528
£ 526 X « Ь24 £
^ 522
Б
Діаметр колоїдної частинки, нм
Рис. 3. Графічне порівняння положення максимумів поглинання проб колоїдного золота та кон’югатів цих проб з протеїном А (^). Співвідношення між розмірами частинок колоїдного золота та положеннями максимумів поглинання цих проб (Б)
мірів частинок золота (рис. 3, Б). Відповідно, розраховуючи максимум поглинання проби колоїдного золота, можна досить точно встановити середній розмір частинки колоїду. Таким чином, спектрофотометричний метод дозволяє швидко визначити розмір частинок золота, а отже і його придатність для синтезу кон’югата зі SpA.
Альтернативним методом розрахунку розміру колоїдів золота може бути визначення параметра а, що розраховується як співвідношення поглинання проби колоїду за довжини хвилі 500 нм до поглинання за довжини хвилі 600 нм. На рис. 4, А подано залежність між параметром а і розміром частинки золота.
Визначення розміру колоїдів у пробах синтезованих наночастинок золота методом визначення RGB-координат
Як альтернативний метод визначення розмірів частинок колоїдного золота використовують простіший за спектрофотометричний метод дослідження. За допомогою сканера отримують цифрові відбитки проб
Рис. 4. Співвідношення між розмірами частинок колоїдного золота за даними електронної мікроскопії та коефіцієнтом а для кожної проби
колоїду (рис. 5, А) та розраховують їхню кольорову характеристику у координатах RGB (Red Green Blue) будь-яким графічним редактором, наприклад ImageJ. Оскільки поглинання за довжин хвиль 500 нм та 600 нм можна охарактеризувати як внесок червоного та синього кольору у характеристиці колоїду, то замість поглинання при 500 нм та 600 нм доцільно використовувати координату R (Red) та B (Blue) в його цифровому відбитку відповідно. Отже, співвідношення R/В буде близьким за значенням до параметра а (рис. 5, Б).
Функціональний тест колоїдів золота, кон’югованих з протеїном А. Методика синтезу колоїду впливає на цілу низку параметрів, які є важливими для роботи хроматографічного тесту: це оптичні характеристики самих наночастинок, їхні розмір та стабільність у розчині, ефективність кон’югації з протеїном. І, звичайно, отримані кон’юга-ти можуть з різною ефективністю проявляти антитіла в імунохроматографічному тесті.
За результатами імунохроматографічно-го тесту усі кон’югати мали здатність розпізнавати антитіла (рис. 6, А). Однак у разі використання низької концентрації імуно-глобулінів проби №1, №2, №4 та №7 за таких умов також давали чітку смугу, натомість кон’югати №3, №5 та №6 проявляли смугу ледь помітно (рис. 6, Б). Проби №1 та №4, незважаючи на достатньо яскраве проявлення смуги, характеризувалися двома суттєвими недоліками — утворенням осаду в розчині та тенденцією до формування фону в ході аналізу. В модельних умовах, коли антитіла були безпосередньо нанесені на нітроцелюлозу, варіанти №1 та №4 видаються досить ефективними, але їх використання в реальних умовах, коли на нітроцелюлозі міститься антиген, а сироватка з антитілами
+
4 5 6 7
тттт
Б
Рис. 5. Цифровий відбиток проб №№ 1—7 колоїдного золота [1(-)—7(-) відповідно] та кон’югатів проб №№ 1—7 колоїдного золота з білком А [1(+)—7(+) відповідно], з якого визначалися координати Б,ОВ спектра (^). Порівняння коефіцієнта а, що розрахований за даними спектрофотометрії, та співвідношень координат Б,/В Б,ОВ спектра для кожного зразка (Б)
наноситься на подушечку з кон’югатом, є недоцільним. Адже зв’язування із сироватковими антитілами різної специфічності лише підсилить тенденцію до утворення значних за розміром конгломератів у товщі мембрани, створюючи фон, що є неприйнятним у роботі тест-системи.
Таким чином, нами було використано методики створення кон’югатів колоїдів золота з протеїном А, що мали найкращі характеристики в імунохроматографічних тестах. Для цього було створено та проаналізовано методами електронної мікроскопії, лазерної кореляційної спектроскопії та спектрофотометрії зразки колоїдів, що різнилися за вмістом основних, необхідних для синтезу, сполук. Встановлено, що колоїди золота, кон’юговані з протеїном А, стають більш стабільними в розчині. Показано, що збільшення концентрації танінової кислоти та цитрату натрію в середовищі синтезу колоїду зменшують розмір наночастинок, а зростання концентрації карбонату калію — гомогенність колоїду. Розраховано розмір частинок колоїдів за електронними
ЯМІ
1 9 А
і
Б
1
Рис. 6. Виявлення імуноглобулінів з використанням кон’югатів протеїну А та наночастинок колоїдного золота,
отриманого за різними схемами синтезу
(цифрами позначено відповідно номер проби):
А — стандартна концентрація імуноглобулінів (розведення 1:100),
Б — зменшена концентрація імуноглобулінів (розведення 1:1000)
мікрофотографіями та запропоновано підходи до розрахунку розміру частинок золота за оптичними показниками проби. За результатами функціонального тесту показано відмінності в ефективності розпізнавання антитіл колоїдним золотом (створеним за різними методиками), кон’югованим з протеїном А. Колоїди, синтезовані за методиками 2 та 7, виявилися найбільш чутливими у
даному тесті. Наведені швидкі спектрофотометричні методи характеристики розмірів частинок можна застосовувати для стандартизації отриманих колоїдів золота. Підібрані умови синтезу наночастинок золота надалі можуть бути використані для виготовлення реагентів для високочутливих імунохроматографічних тестів.
ЛІТЕРАТУРА
1. Papazoglou E. S., Parthasarathy A BioNanotechnology. — Morgan & Claypool Publishers, 2007. — 150 p.
2. Faulk W. P., Taylor G. M. An immunocolloid method for the electron microscope // Immunochemistry. — 1971. — V. 8, N11. — Р.1081-1083.
3. Horisberger M. Colloidal gold: a cytochemical marker for light and fluorescent microscopy and for transmission and scanning electron microscopy // Scan. Electr. Microsc. — 1981. — Pt. 2, Р. 9 — 31.
4. Horisberger M. Colloidal gold as a tool in molecular biology // Trends Biochem. Sci. — 1983. — V. 8, N11. — Р. 395-397.
5. Sharma P., Brown S., Walter G. et al. Nanoparticles for bioimaging // Adv. Coll. Interf. Sci. — 2006. — V. 123 — 126. — P. 471-485.
6. Moks T., Abrahmsen L., Nilsson B. et al. Staphylococcal protein A consists of five IgG-bin-ding domains // Eur. J. Biochem. — 1986. — V. 156, N3. — P. 637 — 643.
7. Graille M., Stura E. A., Corper A. L. et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: Structural
basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 2000. — V. 97, N10. — P. 5399-5404.
8. Silverman G.J., Goodyear C. S. Confounding B-cell defences: lessons from a staphylococcal superantigen // Nat. Rev. Immunol. — 2006. — V. 6, N6. — P. 465-475.
9. Antibody Purification. Handbook // Amer-sham Pharmacia Biotech. — 2000. — P. 27-45.
10. Hober S., Nord K., Linhult M. Protein A chromatography for antibody purification // J. Chromatogr. B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. — 2007. — V. 848, N1. — Р. 40-47.
11. Goding J.W. Use of staphylococcal protein A as an immunological reagent // J. Immunol. Meth. — 1978. — V. 20. — Р. 241-253.
12. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspension // Nat. Phys. Sci. — 1973. — V. 241. — P. 20-22.
13. Олійник О. С., Колибо Д. В., Кабернюк А. А. та ін. Клонування та експресія функціонально активного фрагмента D-E-A-A* протеїну А Staphyllococcus aureus // Біотехно-логія. — 2009. — Т. 2, №1. — С. 59-68.
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ СИНТЕЗА КОНЪЮГАТОВ ПРОТЕИНА А С КОЛЛОИДНЫМ ЗОЛОТОМ И РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ ДЛЯ ИХ ХАРАКТЕРИСТИКИ
А Ю. Лабинцев
Е. С. Олейник
А. А. Кабернюк
A. Ю. Чунихин В. Ф. Горчев
Т. А. Курченко
B. И. Чернышов Д. В. Колибо
Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
E-mail: lab.andrey@gmail.com
Оптимизирован метод получения конъюгатов наночастиц золота с рекомбинантным фрагментом протеина А Staphylococcus aureus для использования в иммунохроматографи-ческих тест-системах. Проанализировано влияние основных компонентов реакционной смеси на размер частиц золота и его конъюгатов с фрагментом протеина А, их гомогенность, стабильность и эффективность распознавания иммуноглобулинов. Предложены методы для быстрого определения размеров синтезированных наночастиц золота с использованием оптических характеристик. Выдвинуты рекомендации для получения конъюгатов наночастиц золота с фрагментом стафилококкового протеина А, которые можно применять в быстрых иммунохроматографических тест-системах.
Ключевые слова: наночастицы золота, протеин А, Staphylococcus aureus, иммуноглобулин-связывающая активность, иммунохрома-тографические тест-системы, электронная микроскопия, лазерная корреляционная спектроскопия, спектрофотомерия, RGB-спектр.
OPTIMIZING PROTEIN A-COLLOIDAL GOLD CONJUGATES SYNTHESIS CONDITIONS AND DEVELOPING APPROACHES FOR THEIR CHARACTERIZATION
A. Yu. Labyntsev O. S. Oliinyk A. A. Kaberniuk O. J. Chunihin V. F. Gorchev T. O. Kyrchenko V. I. Chernushov D. V. Kolibo
Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: lab.andrey@gmail.com
Approach for deriving conjugates of gold nanoparticles with Staphylococcus aureus protein A recombinant fragment for immunochro-matograpical test-systems was optimized. Influence of main components in reaction solution on particle size of gold and its conjugates with protein A fragment, their homogeneity, stability and immunoglobulin-recognition ability was investigated. Methods for rapid size determination of gold nanoparticles based on their optical characteristics were proposed. Recommendations for deriving staphylococcal protein A fragment-gold nanoparticle conjugates that could be successfully used in fast immunochromatograpical test-systems were given.
Key words: gold nanoparticles, protein A, Staphylococcus aureus, immunoglobulin-recog-nition ability, immunochromatograpical testsystems, electron microscopy, laser correlation spectroscopy, spectrophotometry, RGB spectrum.
