Научная статья на тему 'Оптимизация условий хроматографической очистки вакцины клещевого энцефалита на макропористом стекле'

Оптимизация условий хроматографической очистки вакцины клещевого энцефалита на макропористом стекле Текст научной статьи по специальности «Иммунобиотехнологические методы анализа»

1006
89
Поделиться
Ключевые слова
макропористое стекло / гельфильтрация / ВИРУС КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Аннотация научной статьи по биотехнологии, автор научной работы — Епанчинцев А. А., Стронин О. В., Шарова О. И., Пришедько Д. В., Ямкин А. В., Учуватова Е. В.

Исследован процесс очистки вируса клещевого энцефалита с помощью гельфильтрации на макропористом стекле GLY-600-CPG. В зависимости от условий, выход вирусных антигенов составлял 60-100%.

Похожие темы научных работ по биотехнологии , автор научной работы — Епанчинцев А.А., Стронин О.В., Шарова О.И., Пришедько Д.В., Ямкин А.В., Учуватова Е.В.,

Size exclusion chromatography purification of tick-borne encephalitis virus on controlled pore glass GLY-600-CPG was investigated. Depending on the conditions, yield of virus antigens was 60-100%.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Текст научной работы на тему «Оптимизация условий хроматографической очистки вакцины клещевого энцефалита на макропористом стекле»

УДК 57.083.24

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ ВАКЦИНЫ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА НА МАКРОПОРИСТОМ СТЕКЛЕ

А.А. Епанчинцев, О.В. Стронин, О.И. Шарова, Д.В. Пришедько, А.В. Ямкин, Е.В. Учуватова

Филиал ФГУП "НПО "Микроген" Минздравсоцразвития России в г. Томск, "НПО "Вирион"

E-mail: epaa1@mail.ru

OPTIMIZATION OF CONDITIONS OF CHROMATOGRAPHIC PURIFICATION OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VACCINE ON CONTROLLED PORE GLASS

A.A. Epanchintsev, O.V. Stronin, O.I. Sharova, D.V. Prishedko, A.V. Yamkin, E.V. Uchuvatova

"Virion" - Tomsk Branch of the Federal State Unitary Company "Microgen" Scientific Industrial Company for Immunobiological Medicines" of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation

Исследован процесс очистки вируса клещевого энцефалита с помощью гельфильтрации на макропористом стекле GLY-600-CPG. В зависимости от условий, выход вирусных антигенов составлял 60-100%.

Ключевые слова: макропористое стекло, гельфильтрация, вирус клещевого энцефалита.

Size exclusion chromatography purification of tick-borne encephalitis virus on controlled pore glass GLY-600-CPG was investigated. Depending on the conditions, yield of virus antigens was 60-100%.

Key words: controlled pore glass media, size exclusion chromatography, tick-borne encephalitis virus.

Введение

Одним из наиболее значимых методов контроля над заболеваемостью клещевым энцефалитом является вакцинация. В настоящее время в РФ зарегистрировано шесть вакцин клещевого энцефалита (Ю) от четырех производителей, все они имеют сходные показатели качества и технологии производства, как правило, включающие следующие этапы: 1) репродукция вируса клещевого энцефалита (ВЩ) на первично трипсинизированной культуре клеток куриного эмбриона; 2) инактивация вируса формалином; З) концентрирование и очистка вируса; 4) сорбция антигена (АГ) ВЮ на адъюванте - геле гидроокиси алюминия. Успешное выполнение процедур очистки вакцины является одним из базовых элементов, определяющих качество препарата.

Совершенствование технологий производства противовирусных вакцин в последние десятилетия включало важную тенденцию: смещение от методов очистки путем ультрацентрифугирования к более рентабельными и технически простыми хроматографическим процедурам. При этом одной из наиболее эффективных стадий финишной очистки является гельфильтрация [1].

Цель работы: поиск оптимальных условий очистки полуфабриката вакцины Ю на сорбенте GLY-600-CPG.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Материал и методы

При выполнении исследования выемки из производственных партий полуфабриката вакцины очищали методом гельфильтрации на хроматографе AKTA Explorer 100Air (GE Healthcare) с использованием колонны XK 16/ 70 (GE Healthcare). Для упаковки колонны использовали макропористое стекло GLY-600-CPG (диаметр пор 57 нм)

производства Prime Synthesys (США), высота слоя сорбента составляла 40 см. В качестве элюента применяли

0,05 М фосфатный буфер, содержащий 0,15 M NaCl, рН 7,6. Хроматографию проводили при скорости потока 3-13 мл/мин, при этом на колонну наносили 6, 8 или 10 мл образца, что составляло 7,5, 10,0 или 12,5% объема колонны. Регенерацию хроматографической колонны выполняли путем обработки 1 M раствором натрия хлорида. Стерилизацию колонны проводили 4%-м раствором формалина.

В экспериментах по очистке концентрата вакцины КЭ оценивались два наиболее важных для масштабного производства показателя: концентрация АГ ВКЭ в первом (целевом) пике и чистота целевой фракции. Концентрацию АГ ВКЭ определяли с помощью коммерческой ИФА тест-системы для выявления АГ ВКЭ (ФГУП “НПО Микроген”), анализ результатов ИФА выполняли с использованием программы Paraline (Петухов В.Г., ГНИИСК МБП им. Л.А. Тарасевича). Чистоту фракций определяли по результатам высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонне ProteinPac 300 SW (Waters). Контроль качества экспериментальных серий вакцины проводили согласно требованиям фармакопейной статьи предприятия [3].

Результаты и обсуждение

В настоящее время на финальном этапе очистки концентрата вакцины КЭ используется гельфильтрация на крупнопористых модифицированных силикагелях. Согласно НД, сорбент для гельфильтрации должен иметь размер пор 50-100 нм и модификацию поверхности, повышающую ее гидрофильные свойства. Сорбенты с такими характеристиками позволяют отделить высоко-

молекулярную фракцию, содержащую цельный вирус КЭ (первый пик) от фракции основных загрязнителей вакцины - компонентов питательной среды, белков куриного эмбриона, формальдегида и пр. (второй пик).

При выполнении гельфильтрации концентрата вакцины на сорбенте GLY 600 CPG получали характерный для очистки вирусов профиль элюции с двумя пиками (рис. 1), при этом зависимость выхода АГ ВКЭ в целевом пике от условий разделения была ожидаема - минимальный выход наблюдался при максимальных скоростях и нагрузках на колонну.

При нагрузке образца в объеме, равном 10% объема колонны (8 мл), в зависимости от скорости потока в целевой фракции содержалось 84-94% от количества АГ ВКЭ, наносимого на колонну. Нежелательной была область, ограниченная скоростью потока выше 5 мл/мин и нагрузкой на колонну выше 8 мл. Остальные сочетания этих параметров давали выход не менее 80% (рис. 2А).

Вторым параметром, который рассматривался при выборе условий, является чистота продукта.

Следует отметить, что применяемая для оценки чистоты ВЭЖХ позволяет лишь оценить соотношение высоко- и низкомолекулярных фракций. При этом предполагается, что высокомолекулярная фракция представляет собой цельные вирионы ВКЭ. Однако в процессе производства вакцины возможны ситуации, когда крупные фрагменты клеток не полностью удаляются на предыдущих стадиях очистки. В этом случае они попадают в целевой пик при хроматографии, и ВЭЖХ дает некорректные данные о чистоте продукта.

В целом чистота целевого пика колебалась на уровне 95-100%, что более чем удовлетворяет потребностям производ-

ства (рис. 2Б).

Исходя из результатов проведенных экспериментов и нормативных требований, предъявляемым к очищенному концентрату вакцины КЭ, нами была определены оптимальные условия хроматографического разделения:

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1) наносимый объем - 10% объема колонны (8 мл);

2) скорость потока 5 мл/мин - до выхода 1-го пика, 12 мл/мин - после выхода 1-го пика.

При указанных условиях разделения были получены

Рис. 1. Очистка полуфабриката вакцины КЭ на сорбенте GLY 600 CPG

Таблица 1

Результаты контроля качества экспериментальных серий вакцины КЭ

Наименование показателя Требования НД Номер серии

С141 эксп. С152 эксп. С161 эксп.

Содержание вируса КЭ

в концентрате Титр в ИФА не ниже 1/256 1/1024 1/512 1/1024

Содержание вируса КЭ

в очищенном концентрате Титр в ИФА не ниже 1/128 1/1024 1/256 1/512

Дисперсность Проходит через иглу 0840, не расслаивается в течение

1 мин Соотв. Соотв. Соотв.

Наименование показателя Требования НД С141 эксп. С152 эксп. С161 эксп.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

рН 7,4-7,8 7,5 7,5 7,5

Общий белок до добавления

ЧСА Не более 65 мкг/доза 11,5 20,8 17,3

Общий белок после

добавления ЧСА 225+75 мкг/0,5 мл нет данных 281 296

Белки куриного эмбриона Не более 0,50 мкг/доза 0,45 0,44 0,44

Содержание геля гидроксида

алюминия 0,30-0,50 мг/доза 0,34 0,38 0,40

Остаточное содержание

формальдегида Должен отсутствовать Соотв. Соотв. Соотв.

Специфическая активность МИД50 не более 0,0125 мл <0,0010 <0,0013 <0,0012

Содержание сахарозы 20-30 мг/доза 24,3 23,9 24,6

Остаточное содержание

канамицина сульфата Должен отсутствовать Отсутствует Отсутствует Отсутствует

Остаточный протамин

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

сульфат Не более 10 мкг/доза <10 <10 <10

Стерильность Д. быть стерильной Стерильна Стерильна Стерильна

Пирогенность Д. быть апирогенной Апирогенна. Апирогенна Апирогенна

Токсичность Д. быть нетоксичной Нетоксична Нетоксична Нетоксична

Рис. 2. А) Зависимость выхода антигена ВКЭ в целевом (1-м) пике от скорости потока и объема наносимого образца. Б) Зависимость чистоты продукта (по результатам ВЭЖХ) от скорости потока и объема наносимого образца (интерполяция сплайнами)

Таблица 2

Очистка вирусов гельфильтрацией

Тип вируса Размер вириона, наличие оболочки Хроматографический сорбент Интервал фракционирования белков Выход вируса Автор

Вирус краснухи Бычий папилломавирус Вирус японского энцефалита Вирус гриппа Вирус клещевого энцефалита 50-70 нм (+) 50-60 нм (-) 40-50 нм (+) 80-120 нм (+) 50 нм (+) БерІпаго$е 2В БерИасгу! Б-1000 Берілаїтее СL-6B БерІшо$е 4РР Тоуореаг! HW-75 Fractogel ЕМЮ ВіоБес GLY-600-CPG 70-40 000 кДа >>1 000 кДа 10 - 4 000 кДа 100-30 000 кДа 100-10 000 кДа 5-1 000 кДа Нет данных 70% 55-80% до 90% 40% 47% 55% до 100% ТгисІеІ М., et а!., 1981 НрїіЬ К., et а!., 1982 Уаи М^., et а!., 1997 Б^апсаг А., et а!., 2006 Данное исследование

три экспериментальные серий вакцины. Аналитические данные полученных серий представлены в таблице 1.

Контроль качества показал соответствие экспериментальных серий вакцины КЭ требованиям НД, что свидетельствует о высоких эксплуатационных возможностях GLY 600 CPG как в обеспечении чистоты продукта (надежное удаление низкомолекулярных контаминантов (формальдегид, канамицин), снижение до регламентированного уровня концентрации белков куриного эмбриона), так и в отношении выхода АГ ВКЭ, достигающего в оптимальных условиях 100%. Соответствие экспериментальных серий нормам НД по пирогенности, стерильности демонстрирует надежность выбранных процедур са-нитизации и регенерации сорбента.

Первые сообщения об очистке вирусов с помощью гельфильтрации на макропористом стекле датируются семидесятыми годами прошлого столетия [4, 5]. Также было показано, что модификация поверхности макропористого стекла с помощью привитых функциональных групп, повышающих гидрофильные свойства сорбента, значительно увеличивала эффективность очистки [2].

Исследования, выполненные в более поздний период [6-9], описывали возможность применения сорбентов на основе полимерной матрицы органического происхождения (табл. 2). Однако, судя по имеющимся данным, при гельфильтрации вирусов на полужестких сорбентах наблюдаются значительные потери, достигающие 60%, что, в частности, может быть обусловлено применением сорбентов с диаметром пор, значительно превосходящим линейные размеры вирионов.

Заключение

Проведенное нами исследование позволило оптимизировать условия очистки вакцины КЭ на сорбенте GLY-600-CPG. Такие свойства изученного сорбента, как оптимальный для очистки вирусов размер пор, гидрофильная модификация поверхности, жесткость структуры гранул геля, обеспечивающая возможность работать на высоких скоростях потока позволяют рекомендовать GLY-600-CPG для выполнения препаративной хроматографии других типов вирусов, сходных по строению с ВКЭ.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Литература

1. Ильченко Т.Э., Билалова Г.П., Ставицкая Н.Х. и др. Вакцина “ЭнцеВир” - современный препарат для профилактики клещевого энцефалита // Сибирский медицинский журнал (Томск). - 2009. - № 2, Вып. 2. - С. 50-55.

2. Красильников И.В. Очистка и концентрирование вируса клещевого энцефалита методом хроматографии на макропористых стеклах : дис. ... канд. биол. наук. - М., 1980. -177 с.

3. ФСП 42 - 1790 - 07. Вакцина клещевого энцефалита культуральная очищенная концентрированная инактивированная сорбированная, суспензия для внутримышечного введения // Фармакопейная статья предприятия. - Введ. 26.11.07. - 23 с.

4. Geschwender H.H., Haller W., Hofschneider P.H. 1969. Large-scale preparations of virus by steric chromatography on columns of controlled pore glass // Biochimica et Biophysica Acta. -1980. - P. 460-469.

5. Heyward J.T., Klimas R.A., Stapp M.D. et al. The rapid concentration and purification of influenza virus from allontoic fluid // Arch. Virol. - 1977. - Vol. 55. - P. 107-119.

6. Hjorth R., Moreno-Lopez L. Purification of bovine papilloma virus by gel filtration on Sephacryl S-1000SF // J. Virol. Methods. - 1982. - Vol. 5(3-4). - P. 151-158.

7. Patent 6207439B1 USA. Purification of Japanese encephalitis virus / Liau M-Y., Jou R., Chiou A-J. ; заявитель Center for Diesease Control. - 08/823989 ; заявл. 25.03.97 ; опубл. 27.03.01. - 14 с.

8. Patent 1878791A1 EC. Method for influenza virus purification / Strancar A., Banjac M., Kramberger P. ; заявитель Bia Separations D.O.O., Greenhills Biotechnology GmbH. -06116979.3 ; заявл. 11.07.06 ; опубл. 16.01.08, Bulletin 2008/03. - 22 с.

9. Trudel M., Marchessault F., Payment P. Purification of infectious rubella virus by gel filtration on sepharose 2B compared to gradient centrifugation in sucrose and metrizamide // J. Virol. Methods. - 1981. - Feb 2(3). - P. 141-148.

Поступила 08.04.2011