CC BY
50
DOI: 10.24411/0044-3913-2018-10413 УДК 633.12:577.112.083
Оптимизация условий экстракции белков из плодов гречихи
Introduction of Genes of Varieties from Other Regions into Genome of Fagopyrum esculentum
G. E. Martynenko
All-Russian Research Institute of Legumes and Groat Crops, ul. Molodezhnaya, 10, k. 1, pos. Streletskii, Orlovskii r-n, Orlovskaya obl., 302502, Russian Federation
Abstract. The aim of the study was to develop a high-yield determinant buckwheat donor with a block of genes from short-stemmed varieties from other regions. The research was carried out in 1996-2008 in the experimental fields of a breeding crop rotation of the All-Russian Research Institute of Legumes and Groat Crops, Orel region, located in the eastern European area of buckwheat cultivation. The initial population was created by the method of complex stepwise crossings of photoneutral determinant limited-branch varieties with short-day Japanese varieties, and also with materials from Bashkir Research Agricultural Institute and Kamenets-Podolsky Agricultural Institute of the Urals and Western Ukraine regions. For hybridization with Japanese varieties, a determinant form D(3-4)/10 with a long inflorescence and 10 vegetative nodes in the branching zone of the main shoot was used. A mixture of Japanese varieties in equal amounts was used as a paternal component and sown sequentially with this form. In F2-F1 of the initial hybrid population, plants were selected according to the signs of limited branching, length and the number of grains in inflorescences, large-fruits. The developed variety Yarud in the three-year competitive variety test exceeded the standard Dikul on average by 0.44 t/ha, or 18.2%, with an average yield of grain of 2.86 t/ha. The vegetation period is 74 days, it is equal to the standard. According to the yield of biomass, Yarud exceeded the standard by 0.88 t/ha. The share of the limited-branched plants in the Yarud population under conditions of continuous sowing is 56.8%. A long (5.2 cm) raceme with increased graininess is characteristic for the variety. The average weight of 1000 seeds is 35.3 g, which is 7.2 g higher than that of Dikul, the total yield of groat in Yarud is close to the standard (+0.6%), and at the output of the unground buckwheat it exceeds Dikul (+4.8%). The grain size is above the standard by 33.2%, the grain evenness is 33.0%. The positive effect of "lbs" mutation of the limited branching in the introduction of material from other regions is discussed. jg Keywords: buckwheat; mutation; breeding; yield; genome; introduction; heterosis; ° limited branching.
^ Author Details: G. E. Martynenko, leading 2 research fellow.
O For citation: Martynenko G. E. Introduc-■E tion of Genes of Varieties from Other Regions ® into Genome of Fagopyrum esculentum. Zem-5 ledelije. 2018. No. 4. Pp. 39-42(in Russ.). DOI:
! 10.24411/0044-3913-2018-10412. ® ■
W ■
С. В. БОБКОВ, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией (e-mail: svbobkov@gmail.com) В. И. ЗОТИКОВ, доктор сельскохозяйственных наук, член-корресподент РАН, зам. директора О. В. УВАРОВА, научный сотрудник Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур, ул. Молодёжная, 10, к. 1, пос. Стрелецкий, Орловский р-н, Орловская обл., 302502, Российская Федерация
Цель исследований состояла в оптимизации параметров экстракции белков из плодов гречихи для разработки технологии получения белковых изолятов. Изучали влияние факторов «время экстракции», «рН дисперсии» и «сорт» на выход белка, эффективность экстракции, содержание в изоляте и остаточном материале сырого протеина и золы, содержание крахмала в остаточном материале. Экстракцию белка проводили раствором гидроксида натрия со значениями рН 8 и 9 в течение 1 и 4 ч. Использовали сорта гречихи Дикуль и Девятка с содержанием белка в семенах 11,5 и 12,8 % соответственно. Для увеличения выхода изолята с высоким содержанием сырого протеина следует использовать сорта гречихи с большим содержанием белка в семенах. У сорта Девятка выход изолята был существенно выше, чем у сорта Дикуль (6,9 и 6,1 г соответственно), также как и содержание сырого протеина в изоляте (80,1 и 75,0 % соответственно). Для получения изолятов с высоким содержанием белка экстракция при рН 8 в течение 1 ч предпочтительней, чем при рН 9 и 4 ч, хотя это и не нашло статистического подтверждения. Увеличение рН с 8 до 9 существенно повышает эффективность экстракции - 6,3 и 6,7 г сответственно, уменьшает содержание сырого протеина в остаточном материале - 6,6 и 6,0 % соответственно. Не выявлено существенного влияния изученных факторов на содержание крахмала в остаточном материале. Больше всего минеральных веществ (золы) в белковом изоляте и остаточном материале наблюдали у сорта Девятка (2,20 % против 1,70 % у сорта Дикуль) при времени экстракции 1 ч (2,30 % против 1,60 % при 4 ч).
Ключевые слова: гречиха, Fagopyrum esculentum Моепс^ крупа, мука, изолированный белок, сырой протеин, селекция гречихи.
Для цитирования: Бобков С. В., Зо-
тиков В. И., Уварова О. В. Оптимизация условий экстракции белков из плодов гречихи // Земледелие. 2018. № 4. С. 42-44. DOI: 10.24411/0044-3913-2018-10413.
Гречиха - важная сельскохозяйственная культура. В 2016 г в мире ее выращивали на площади 2,4 млн га, урожайность составила 2,4 млн т зерна[1]. В России гречихутрадиционно возделывают для производства крупы-ядрицы [2]. Гречневая крупа обладает ценными питательными свойствами и служит продуктом повседневного потребления. Глубокая переработка зерна гречихи имеет хорошие перспективы вследствие его высокой биологической ценности. Так, содержание белка в плодах гречихи достигает 18,9 % [3]. Белки гречихи характеризуются сбалансированным составом аминокислот, занимая промежуточное положение между злаковыми и бобовыми культурами, отличаются высоким содержанием лизина, аргинина и треонина [4, 5]. Они содержат 50-65 % альбуминов и глобулинов и только 6 % проламинов, что позволяет использовать продукты из семян культуры в диетическом питании при глюте-новой энтеропатии [6, 7]. Плоды гречихи также богаты цинком, медью и марганцем [2], энзимрезистент-ным крахмалом, ненасыщенными жирными кислотами, флавоноидами, фагопиритолами, фитостеролами и другими биологически активными веществами [8, 9, 10].
Разработку методов экстракции белков из плодов можно сочетать с селекцией сортов гречихи с высоким содержанием белка в семенах. Известно, что массовая доля зародыша в обрушенном семени составляет 23,3-27,8 % [11], содержание белка в эндосперме - 5,7-6,1 %, а в зародыше - 48,3-52,5 %. Учитывая большой вклад зародыша (72,5-75,9 %) в накопление белков в семенах, признак «содержание зародыша в семени» можно использовать в качестве маркера в селекции гречихи на высокое содержание белка [11].
В ранее проведенных опытах изолированные белки содержали 71,981,4 % сырого протеина в пересчете на абсолютно сухое вещество [11].
Для определения параметров дальнейших исследований требуется
определение влияния сортовых различий, рН дисперсии и затрат времени на выход белка и эффективность экстракции, которая выражается в отношении количества полученного белка к его содержанию в плодах.
Цель исследований состояла в оптимизации параметров экстракции белков из плодов гречихи для повышения выхода изолята с высоким содержанием сырого протеина.
В экспериментах использовали муку сортов Дикуль и Девятка. Изоли-
прерывно перемешивая суспензию на шейкере. Затем ее центрифугировали, в полученный супернатант добавляли соляную кислоту, а рН суспензии доводили до значения изоэлектрической точки белков гречихи. Раствор с осаждающимися белками центрифугировали. Для более полного выделения белков проводили второй цикл экстракции и осаждения. Полученные изолированные белки высушивали при температуре не более 50 °С.
1. Влияние сортовых особенностей на выход изолированного белка и эффективность экстракции
Сорт Содержание белка в 100 г абсолютно-сухой муки,г Масса абсолютно сухого изолята, г Эффективность экстракции,%
Дикуль 11,5 6,1* 53,1
Девятка 12,8 6,9 54,1
* существенные различия (p=0,03; й2=0,91) между сортами
рованные белки выделяли методами щелочной экстракции [11] и кислой преципитации. Последний ранее применяли для получения белковых изолятов гороха [12]. Содержание сырого протеина в муке и изолятах определяли по методу Кьельдаля с использованием дигестора с программируемым нагревом DK-6 фирмы VELP SCIENTIFICA (Италия) для сжигания проб растительного материала и UDK-152 этой же фирмы для дальнейшей перегонки и титрования. Содержания крахмала в муке гречихи определяли поляриметрическим методом по Эверсу, золы - путем сжигания в муфельной печи [13].
Экстракцию белка проводили раствором гидроксида натрия ^аОН) со значениями рН 8 и 9, которые ранее использовали в опытах с горохом
Исследовали влияние факторов «сорт», «рН дисперсии» и «время экстракции» на выход белка и эффективность экстракции, содержание сырого протеина и золы в изоляте и остаточном материале, содержание крахмала в остаточном материале. Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью программы STATISTICA. Проводили параметрический корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции Пирсона. В табл. 1 и 2 приведены только данные с существенным влиянием факторов, однако при анализе использовали все перечисленные факторы. При указании рН и влияния времени экстракции в табл. 2-7 учитывали варьирование по градациям фактора «сорт».
2. Влияние величины рН на выход изолированного белка и эффективность
экстракции
рН Содержание белка в 100 г Вес абсолютно Эффективность
рН абсолютно-сухой муки, г сухого изолята, г экстракции,%
8 12,1 6,3 51,8*
9 12,1 6,7 55,4
Существенные различия (p=0,03; й2=0,72) по фактору pH дисперсии
[12]. Продолжительность экстракции составляла 1 и 4 ч, поскольку предварительные исследования показали высокую эффективность экстракции белков гречихи в течение указанных периодов времени в зависимости от сочетаний с другими факторами. Экстракцию проводили при 25 °С, не-
У сорта гречихи Дикуль содержание сырого протеина в муке составило 11,5 %, у сорта Девятка -12,8 %. Факторный анализ выявил существенные различия (р=0,03; R2=0,91) между ними по выходу изолированного белка (табл. 1). Средний выход абсолютно сухого белка из 100
г муки у сорта Дикуль составил 6,1 г, у сорта Девятка - 6,9 г. Мы предполагаем, что содержание белка в муке служит определяющим фактором для выхода изолированного белка. Корреляционный анализ подтвердил это предположение, выявив тесную зависимость между содержанием сырого протеина в муке и выходом изолированного белка (г=0,8, при р<0,05).
Известно, что в плодах гречихи содержится 50-65 % альбуминов и глобулинов, 18,7 % глутелинов и 6 % проламинов [7]. Глутелины хорошо растворяются в разбавленных щелочах, поэтому вполне вероятно, что основная их масса перешла в раствор, а часть глобулинов осталась в связанном состоянии. В дальнейших исследованиях по экстракции белков следует обратить внимание на увеличение выхода в раствор глобулиновой и альбуминовой фракции белков, что подразумевает использование других экстрагирующих агентов.
Сортовые особенности и время не оказывали существенного влияния на эффективность экстракции. Однако в опыте наблюдали существенные различия по фактору рН дисперсии. При его повышении с 8 до 9 средняя эффективность экстракции значимо увеличивалась (табл. 2) с 51,8 % до 55,4 % (р=0,03; R2=0,72).
На содержание сырого протеина в изоляте существенное влияние оказывал фактор «сорт». Наибольшее содержание сырого протеина было характерно для изолятов сорта Девятка (табл. 3).
Содержание сырого протеина в остаточном материале позволяет оценить эффективность экстракции для разработки технологии получения изолятов белков. В опыте на величину этого показателя существенное влияние оказывал фактор «рН дисперсии». Его увеличение с 8 до 9 приводило к снижению количества сырого протеина в остаточном материале на 0,6 %.
Концентрация минеральных веществ (золы) в муке сорта Дикуль составляла 1,77 %, в муке сорта Девятка - 1,99 %. На содержание золы в изоляте существенное влияние оказывал и факторы «врем я экстракции» и «сорт» (табл. 4). Наи-
3. Влияние факторов на содержание сырого протеина в изоляте и остаточном материале
Фактор Градация Изолят Остаток
содержание сырого протеина,% р Я2 содержание белка, % р Я2
Время, ч 1 78,8 0,062473 0,94052 6,4 0,347884 0,72648
4 76,2 6,2
рН 8 78,4 0,155415 6,6 0,043952*
9 76,7 6,0
Сорт Дикуль 75,0 0,010630* 6,4 0,360678
Девятка 80,1 6,2
(О Ф
Ш, ь
Ф
д
ф
ь
Ф
-Ь О 00
* существенные различия
4. Влияние экспериментальных факторов на содержание минеральных веществ (зола) в изоляте
и остаточном материале
Фактор Градация Изолят Остаток
содержание золы, % p R2 Содержание золы, % p R2
Время, ч 1 2,30 0,014524* 0,94687 1,37 0,026197* 0,99985
4 1,60 1,28
pH 8 2,00 0,287953 1,30 0,056321
9 1,90 1,34
Сорт Дикуль 1,70 0,036856* 1,30 0,022805*
Девятка 2,20 1,34
* существенные различия
большее количество минеральных веществ (золы) в изоляте выделили при меньшем времени экстракции (1 ч) у сорта Девятка. Анализ экспериментальных данных позволил выделить существенное влияние двух исследованных факторов на содержание золы в остаточном материале - времени экстракции и сортовых различий.
en/#data/QC/visualize (дата обращения: 17.05.2018).
2. Варлахова Л. Н., Бобков С. В., Михайлова И. М. Технологические качества зерна гречихи различных сортов // Доклады РАСХН. 2012. № 6. С. 37-40.
3. Krkoskova B., Mrazova Z. Prophylactic components of buckwheat // Food Research International. 2005. Vol. 38. Pp. 561-568.
4. Studies on the amino acid and mineral content of buckwheat protein fractions /
5. Влияние экспериментальных факторов на содержание крахмала в остаточном материале
Фактор 1 Градация 1 Содержание крахмала, % I p 1 R2
Время, ч 1 85,1 0,917462 0,73497
4 85,3
pH 8 84,0 0,456315
9 86,2
Сорт Дикуль 85,9 0,592218
Девятка 84,4
Содержание крахмала в муке сортов Дикуль и Девятка было равно 76,38 и 77,27 % соответственно. После экстракции белка величина этого показателя в остаточном материале возросла до 85,9 и 84,4 % соответственно (табл. 5). Однако существенного влияния исследуемых факторов на содержание крахмала в остаточном материале выявлено не было.
Таким образом, для увеличения выхода изолята с высоким содержанием сырого протеина следует использовать сорта гречихи с большим содержанием белка в семенах. Для получения изолятов с высоким содержанием белка предпочтительна экстракция при pH 8 в течение 1 часа, хотя это и не нашло статистического подтверждения.
Увеличение pH с 8 до 9 существенно повышало эффективность экстракции и уменьшало содержание сырого протеина в остаточном материале. Не выявлено существенного влияния изученных факторов на концентрацию крахмала в остаточном материале. Наибольшее содержание 5? минеральных веществ (золы) в белО ковом изоляте и остаточном мате-
N
ст риале наблюдается у сорта Девятка
^ при меньшем времени экстракции
о (1 час). s
Литература.
о ^
S 1. Crops // FAOSTAT [Электронный Ф ресурс]. URL: http://www.fao.org/faostat/
Y Wei, X. Hu, G. Zhang, etc. // Nahrung/ Food. 2003. Vol. 2. Pp. 114-116.
5. Биохимическая характеристика белков семян современных сортов гречихи / С. В. Бобков, В. И. Зотиков, И. М. Михайлова и др. // Земледелие. 2015. № 5. С. 42-43.
6. Skerritt J. H. Molecular comparison of alcohol-soluble wheat and buckwheat proteins // Cereal Chemistry. 1986. Vol. 63. Pp. 365-369.
7. Extention of the spectra of plant products for the diet in coeliac disease / J. Petr, I. Michalik, H. Tlaskalova etc. // Czech J. Food Sci. 2003. Vol. 21. Pp. 59-70.
8. Is buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) still a valuable crop today? /
A. L. Jacquemart, V. Cawoy, J. M. Kinet, etc. // Eur. J. Plant Sci. Biotechnol. 2012. Vol. 6 (2) (Special Issue). Pp. 1-10.
9. Bioactive compounds in functional buckwheat food / Z. L. Zhang, M. L. Zhou,
Y Tang, etc. // Food Res. Int. 2012. Vol. 49. Pp. 389-395.
10. Bobkov S. Biochemical and technological properties of buckwheat grains // Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat / editors M. Zhou, I. Kreft, S.-H. Woo, etc. Oxford: Academic Press, 2016. Ch. 34. Pp. 423-440.
11. Перспективы получения изолированных белков гречихи / С. В. Бобков,
B. И. Зотиков, Т. С. Наумкина и др. // Земледелие. 2017. № 3. С. 27-30.
12. Бобков С. В., Уварова О. В. Перспектива использования гороха для производства изолятов запасных белков // Земледелие. 2012. № 8. С. 47-48.
13. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков, В. В. Арасимович, Н. П. Ярош и др. Л.: Агропромиздат. Ленингр. отделение, 1987. 430 с.
Optimization of Protein Extraction
from Buckwheat Seeds
S. V. Bobkov, V. I. Zotikov, O. V. Uvarova
All-Russian Research Institute of Legumes and Groat Crops, ul. Molodezhnaya, 10, k. 1, pos. Streletskii, Orlovskii r-n, Orlovskaya obl., 302502, Russian Federation
Abstract. The goal of the study was to optimize parameters of protein extraction from buckwheat fruits in order to develop a technology for obtaining protein isolates. The influence of extraction time, pH of dispersion and variety on protein output, extraction efficiency, content of crude protein, ash, starch in the isolate and residual material was studied. Protein extraction was carried out by the solution of sodium hydroxide with pH values of 8 and 9 during 1 and 4 hours. The authors used Dikul and Devyatka buckwheat varieties with the protein content in seeds of 11.5 and 12.8%, respectively. To increase the yield of an isolate with a high content of crude protein, it is necessary to use buckwheat varieties with high protein content in seeds. The output of the isolate was significantly higher in Devyatka variety in comparison with Dikul variety: 6.9 and 6.1 g, respectively, as well as the content of crude protein in the isolate: 80.1 and 75.0%. To obtain isolates with high content of protein, the extraction at pH 8 during 1 hour is more preferable than pH 9 during 4 hours, although this data was not proved statistically. An increase in the pH value from 8 to 9 significantly raises the efficiency of extraction: 6.3 and 6.7 g, respectively, and reduces the content of crude protein in the residual material: 6.6 and 6.0%. All studied factors do not reliably influence starch content in the residual material. The highest content of mineral substances (ash) in the protein isolates and residual material was in Devyatka variety (2.20% vs. 1.70% in Dikul variety) at time of extraction of 1 hour (2.30% vs. 1.60% at4 hours).
Keywords: buckwheat, Fagopyrum esculentum Moench, groat, flour, isolated protein, fat, crude protein, buckwheat breeding.
Author Details: S. V. Bobkov, Cand. Sc. (Agr.), head of laboratory (e-mail: svbob-kov@gmail.com); V. I. Zotikov, D. Sc. (Agr.), corresponding member of the RAS, deputy director; O. V. Uvarova, research fellow.
For citation: Bobkov S. V., Zotikov V. I., Uvarova O. V. Optimization of Protein Extraction from Buckwheat Seeds. Zemledelije. 2018. No. 4. Pp. 42-44 (in Russ.). DOI: 10.24411/0044-3913-2018-10413.
