CC BY
20
УДК 616.932:615.371/372
О.В.Громова1, С.А.Нижегородцев1, И.А.Дятлов2, В.В.Кутырев1
ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА ПРОИЗВОДСТВА ХОЛЕРНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ С ПОМОЩЬЮ ТЕХНОЛОГИИ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»,Саратов;
2Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск
Разработана и внедрена в производство холерной химической вакцины технология получения О-антигена штамма Vibrio choleraе М41 с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах. Ультрафильтрация позволяет получать нативные высокоактивные препараты О-антигена, соответствующие требованиям действующей нормативной документации, экономить в 10-15 раз сульфат аммония, используемый для осаждения антигена, уменьшать вдвое длительность технологического цикла и снизить трудозатраты. Технология концентрирования протективных антигенов апробирована на штаммах V. cholerae О139 серогруппы МО45 и КМ137, получены 3 серии экспериментальной вакцины против холеры, вызванной возбудителем О139 серогруппы.
Ключевые слова: холерная химическая вакцина, производственные штаммы, О-антиген, ультрафильтрация.
O.V.Gromova1, S.A.Nizhegorodtsev1, I.A.Dyatlov2, V.V.Kutyrev2
Optimization of the Process of Cholera Chemical Pelleted Vaccine Production Using Ultrafiltration Technology
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov; 2State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk
Technology of O-antigen obtaining from Vibrio cholerae M41production strain, using the hollow fiber ultrafiltration modules, is developed and introduced into cholera vaccine manufacturing. Application of ultrafiltration makes it possible to obtain native high-activity O-antigen preparations which comply with the current regulatory requirements. Besides, it provides for economy (10-15-fold) of ammonium sulphate, used for antigen precipitation, reduces the duration of technological cycle (2 times), and the labor inputs. The technology of protective antigen concentrating is tested on V. cholerae strains MO45 and KM137 of O139 serogroup. Three series of experimental V. cholerae O139 vaccine are obtained.
Key words: cholera chemical vaccine, production strains, O-antigen, ultrafiltration.
Одной из приоритетных задач медицины является резкое снижение заболеваемости, вызываемое возбудителями опасных и особо опасных инфекций. Важную роль в решении данной проблемы играют вакцины. В Российском научно-исследовательском институте «Микроб» разработана и производится бивалентная химическая таблетированная холерная вакцина, содержащая основные протективные антигены холерного вибриона: холероген-анатоксин и соматические О-антигены (О-АГ) серогрупп Огава и Инаба. Также создана экспериментальная модульная вакцина из штаммов О1 и О139 серогрупп [3, 6].
Для оптимизации производства проанализирована каждая стадия процесса получения препарата для поиска путей увеличения выхода вакцины без изменения ее качества. Наибольшие материальные и временные затраты обнаружены на стадиях выделения специфических компонентов вакцины.
Целью работы явилось усовершенствование производства оральной холерной химической вакцины путем внедрения новых технологий, для улучшения стандартности препарата, уменьшения затрат труда и повышения выхода целевого продукта. Конкретная задача исследования состояла во внедрении в произ-
водство вакцины новой технологии получения О-АГ с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы-продуценты V скоієгає О1 серогруппы М41 Огава и 569В Инаба, а также штаммы О139 серогруппы МО45 (Япония) и КМ-137 [9]. Выращивание штаммов проводили в производственных условиях [5]. Химический состав характеризовали, как описано ранее [6]. Гель-фильтрацию проводили на колонке (35^2 см) с ТSK гелем Н^60 с фосфатным буфером М/150, рН 7,2. Безвредность и иммуногенность по ED50 определяли на белых мышах, заражение иммунизированных мышей проводили вну- трибрюшинно таммами V. скоієгає 879-М Инаба, V. скоієгає 3122-Р Огава и V. скоієтв Р-16064 О139 [1, 5]. Активность холеро-гена определяли на взрослых кроликах с помощью внутрикожной реакции, Специфическую активность очищенных антигенов определяли в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) и РНГА [6]. В серологических тестах использовали коммерческие холерные
сыворотки: О1 и О139-агглютинирующая и антихо-лерогенная (РосНИПЧИ «Микроб»).
Результаты и обсуждение
Технологическая схема выделения иммуногенов коммерческой вакцины предполагает использование растворимых антигенов из культуральной жидкости штаммов-продуцентов [5]. Исходным материалом для получения О-АГ является центрифугат бульонной культуры штамма М41, выращенного в течение (10±2) ч на казеиновом бульоне методом глубинного культивирования, детоксицированный в холодильной комнате в течении 30 сут при температуре (8±2) °С. Согласно регламенту производства холерной вакцины для выделения у О-АГ из обеззараженной и детоксицированной культуральной жидкости требуется большое количество сульфата аммония. Для повышения эффективности и снижения затрат этого процесса предложен новый способ предварительной ультрафильтрации центрифугата с целью его концентрирования в 10-15 раз и удаления неспецифических примесей с молекулярной массой менее 20 кДа [2, 4]. Нами была сконструирована и смонтирована установка с использованием шести ультрафильтрацион-ных волоконных колонок марки УВА-ПС-20-1040 суммарной производительностью по дистиллированной воде 4380 л/ч, соединенных последовательно с включенным в конструкцию вспомогательным оборудованием [7]. На данной установке проведено концентрирование 3 серий формализированного цен-трифугата штамма М41 Огава в количестве 450 л в трех производственных циклах. Скорость отвода фильтрата была высокой - 2,4 л/мин с последующим постепенным снижением до 0,82 л/мин. Среднее время концентрирования в 3 сериях равнялось (7±1) ч. Концентраты О-АГ центрифугировали на сверхцентрифуге СГ0-100 при 13000§ для осаждения нерастворимых компонентов, из надосадочной жидкости осаждали О-АГ при 50 % насыщения сульфатом аммония с последующем отделением осадка и диализом. Далее материал лиофилизировали и использовали как компонент химической таблетированной вакцины (серии 09-011).
Результаты, полученные в процессе сравнительного изучения данных О-АГ, позволили сделать вывод о том, что внедрение нового технологического этапа не ухудшило их качества как компонентов вакцины, а в некоторых случаях имелось преимущество перед традиционной технологией (средние титры РНГА производственных серий 1:112, у экспериментальной серии 011 1:224). Изучение химического состава полученных О-АГ показало наличие 22-24 % углеводов, 12-15 % липидов, 3-5 % нуклеиновых кислот, что является сходным с коммерческими О-АГ. Некоторые отличия обнаружены в количестве белка: у экспериментальных О-АГ оно составляло 20-22 %, а у полученных традиционным способом - 25-27 %. Возможно, это связано с удалением в процессе уль-
трафильтрации неспецифических белковых компонентов. Содержание альдогептозы во всех препаратах было близким и составляло 0,5-0,6 %. Как известно, альдогептоза является маркером липополисахарида холерного вибриона и может характеризовать содержание О-АГ в препаратах [6]. Таким образом, О-АГ, полученные с помощью технологии ультрафильтрации, по своим физико-химическим свойствам и серологической активности соответствовали препаратам, выделенным по регламенту производства. Результаты гель-хроматографического анализа О-АГ на колонке с TSK-гелем HW-60 (рисунок) продемонстрировали их подобие: в элюатах препаратов обнаруживался специфический О-АГ и некоторое количество антигена VI, относящегося к неспецифическим термостабильным антигенам, что связано со стерилизацией обоих препаратов текучим паром.
Три сформированные экспериментально-производственные серии вакцины - 09, 010, 011 были проконтролированы по всем тестам, заложенным в ФСП-42-0020-0020-00. В результате проведенных контролей установлено, что все 3 серии соответствовали паспортным данным и требованиям нормативной документации. Средние данные по трем сериям препарата: антигенная активность по анти-токсиносвязыванию (ЕС) составила 100000 ЕС на таблетку (лимит 100000±20000 ЕС), содержание О-АГ в РНГА в обратных значениях титра реакции равно 2500 (лимит не менее 2000). Иммуногенная актив-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
№ фракций
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
№ фракций
Хроматография на Т8К-геле НШ-60 О-антигена холерного вибриона:
А - по регламенту, Б - с ультрафильтрацией. По оси абсцисс - номер фракций; по оси ординат - кривая элюции белка при А280 нм; 1^, VI-ag - содержание антигенов (титр в пробе РИД)
ность по ED50 на белых мышах составила в среднем 1/30000 часть таблетки (лимит не более 1/20000 части таблетки). Все серии были нереактогенными при испытаниях на добровольцах (по пять волонтеров на серию), нетоксичны в дозе 1/160 части таблетки при подкожном введении белым мышам и специфически безопасны при испытаниях на кроликах (в 1 мг белка препарата содержалось в среднем 4000 условных кожных доз) при лимите не более 6000.
Для отработки технологии ультрафильтрации на материале штаммов V. ско!егав О139 серогруппы было проведено производственное выращивание двух штаммов-продуцентов О139 серогруппы -МО-45 и КМ 137. Выращивание штаммов, получение формалинизированного центрифугата и его детоксикация проводились так же, как и штаммов О1 серогруппы.
Ультрафильтрацию формализированного цен-трифугата (125 л каждого штамма) проводили на производственном стенде в течение 2 ч с целью концентрирования содержащегося в нем О-АГ. Скорость фильтрации составила в среднем 1 л/мин. В процессе ультрафильтрации каждые 15 мин производили отбор проб фильтрата, который контролировался по мутности (что позволяло определять целостность волокон колонки) и содержанию О-АГ. Оставшийся на колонке препарат был смыт обратным током жидкости. Практически весь О-АГ, растворенный в культуральной жидкости, концентрировался в процессе ультрафильтрации и сохранялся в концентрате. Концентраты центрифугировали, О-АГ фракционировали сульфатом аммония и далее получали полуфабрикат вакцины, как описано для штамма М41.
Изучение химического состава полученных О-АГ О139 показало наличие 24-26 % углеводов, 20-22 % белка,12-15 % липидов, 3-5 % нуклеиновых кислот что соответствует данным анализа фракций, полученных традиционным способом. Серологическая активность фракций также соответствовала фракциям О-АГ, полученным традиционно (титр РИД 1:8). Далее было скомпоновано и проконтролировано три серии таблеток О139 вакцины (015-017). Как компонент, содержащий в экспериментальной вакцине анатоксин холерогена и О-антиген Инаба, использовали материал штамма V. choleraе 569В. Средние данные по трем сериям препарата: антигенная активность по антитоксиносвязыванию (ЕС) составила 100000 ЕС на таблетку, содержание О-АГ в РИД в обратных значениях титра реакции равно 3200. Все серии были нетоксичны в дозе 1/160 части таблетки для белых мышей и специфически безопасны при испытаниях на кроликах.
Особенно интересным является тот факт, что им-муногенная активность экспериментальной вакцины против О139 серогруппы с применением ультрафильтрации (серии 015-017) по ED50 на белых мышах была значительно выше показателей серии 012, полученной традиционно (ED50 составила в среднем 1/50000 часть таблетки (015-017) и 1/35000 (012) при
заражении штаммом О1 серогруппы; 1/45000 часть таблетки (серии 015-017) и 1/28000 (012) при заражении штаммом О139 серогруппы).
Таким образом, метод производства холерной таблетированной вакцины с использованием препаратов О-АГ, полученных ультрафильтрацией был успешно апробирован на штаммах-продуцентах О1 и О139 серогруппы коммерческой и экспериментальной вакцин. Один цикл концентрирования по новой технологии позволил уменьшить количество используемого сульфата аммония в 10-15 раз, убрать этап осаждения балластной фракции, ее центрифугирования и диализа, уменьшить на 25 ч время технологического цикла.
Ультрафильтрат культуральной жидкости вакцинного штамма М41, накапливающийся в процессе получения О-АГ в качестве отхода производства, может служить источником ферментов холерного вибриона и применяться для производства питательных сред [8].
На основе разработанной технологии получения О-АГ холерного вибриона штамма М41 Огава методом ультрафильтрации было составлено Изменение № 3 к РП № 479-99 вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, которое утверждено ГИСК им. Л.А.Тарасевича и внесено в регламент производства.
В результате настоящего исследования нами экспериментально обосновано использования метода ультрафильтрации на полых волокнах для получения антигенов холерного вибриона и проведено внедрение масштабируемой технологии изготовления таблетиро-ванной холерной вакцины (в том числе и против О139 сероварианта) с использованием данного метода.
СПИСОК ЛИТЕРAТУРЫ
1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз; 1962. 180 с.
2. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А., Елисеев Ю.Ю., Киреев М.Н., Космаенко О.М. Способ получения О-анти-гена холерного очищенного. Патент РФ N° 2143280. Опубл. 27.12.99. Бюл. М 36.
3. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А., Елисеев Ю.Ю., Киреев М.Н., Наумов А.В. и др. Оральная химическая вакцина против холеры. Патент РФ М 2119128. Опубл. 20.11.2000.
4. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А., Киреев М.Н., Федорова В.А., Аленкина Т.В. и др. Новый способ получения О-антигена холерного очищенного с целью создания холерных диагностических антисывороток. Биотехнология. 2002; 2:42-7.
1. Джапаридзе М.Н., Наумов А.В., Никитина Г.П., Мелещенко М.В., Доброва В.Г., Заворотных В.И. и др. Оральная химическая вакцина из гипертоксигенных штаммов КМ-76 Инаба и КМ-68 Огава возбудителя холеры. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1991; 4:31-3.
6. Джапаридзе М.Н., Наумов А.В., Громова О.В., Адамов А.К., Елисеев Ю.Ю., Космаенко О.М. и др. Использование нового штамма Vibrio cholerae О139 в качестве продуцента энтеральной химической вакцины. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996; 2:52-5.
7. Дятлов И.А., Нижегородцев С.А., Громова О.В., Васин Ю.Г., Бутов А.С., Клокова О.Д. и др. Разработка ультрафильтра-ционной технологии получения О-антигена холерного вибриона для производства вакцины. Пробл. особо опасных инф. 2001; 2(82):133-9.
8. КузьмиченкоИ.А., Громова О.В., КиреевМ.Н., Плотников О.П., Грачева И.В., Виноградова Н.А. и др. Способ получения питательной основы и питательная среда для культивирования микроорганизмов рода Yersinia и Vibrio. Патент РФ М 2360962. Опубл. 10.07.09. Бюл. М 19.
9. Чеховская Г.В., Щелканова Е.Ю., Смирнова Н.И. Бескапсульные мутанты Vibrio cholerae О139 серогруппы: получение, идентификация и использование для приготовления диагностической О139 антисыворотки. Журн. микробиол., эпидеми-ол. и иммунобиол. 2000; 1:34-7.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Ashmarin I.P., Vorob’evAA. [Statistical Methods in Microbiological Investigations]. L.: Medgiz; 1962. 180 p.
2. Gromova O.V., Dzhaparidze M.N., Dyatlov IA., Eliseev Yu.Yu., Kireev M.N., Kosmaenko O.M. [Method of obtainment of cholera O-antigen purified]. RF Patent 2143280. 27 Dec 1999.
3. Gromova O.V, Dzhaparidze M.N., Dyatlov IA., Eliseev Yu.Yu., Kireev M.N., Naumov A.V. [Oral chemical cholera vaccine]. RF Patent 2159128. 20 Nov 2000.
4. Gromova O.V., Dzhaparidze M.N., Dyatlov I.A., Kireev M.N., Fedorova VA., Alenkina T.V et al. [New method of obtainment of the purified cholera O-antigen for the preparation of cholera diagnostic anti-serums]. Biotechnology. 2002; 2:42-7.
5. Dzhaparidze M.N., Naumov A.V, Nikitina G.P., Meleshchenko M.V, Dobrova KG., Zavorotnykh V.I. et al. [Oral chemical vaccine obtained from the hyper-toxigenic cholera agent strains KM-76 Inaba and KM-68 Ogawa]. Zh. Microbiol. Epidemiol. Immunobiol. 1991; 4:31-3.
6. Dzhaparidze M.N., Naumov A.V, Gromova O.V, Adamov A.K., Eliseev Yu.Yu., Kosmaenko O.M. et al. [Usage of the new Vibrio cholerae O139 strain as a producer of enteric chemical vaccine]. Zh. Microbiol. Epidemiol. Immunobiol. 1996; 2:52-5.
7. DyatlovI.A., Nizhegorodtsev S.A., Gromova O.V, Vasin Yu.G., Butov A.S., Klokova O.D. et al. [Development of the ultrafiltration technology of ob-
tainment of the cholerae vibrio O-antigen for the vaccine production]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2001; 2 (82):133-9.
8. Kuz’michenko I.A., Gromova O.V, Kireev M.N., Plotnikov O.P., Gracheva I.V., Vinogradova NA., et al. [Method of obtainment of the nutrient substrate and nutrient medium for cultivation of Vibrio and Yesinia microorganisms]. RF Patent 2360962. 10 Jul 2009.
9. Chekhovskaia G.V., Shchelkanova E.Yu., Smirnova N.I. [Noncapsular mutants of Vibrio cholerae serogroup O139: their isolation, identification and use for the preparation of an O139 diagnostic antiserum]. Zh. Microbiol. Epidemiol. Immunobiol. 2000; 1:34—7.
Authors:
Gromova O.V., Nizhegorodtsev SA., Kutyrev V.V. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. Universitetskaya St., 46, Saratov, 410005, Russia. E-mail: [email protected]
Dyatlov IA. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russia. E-mail: [email protected]
Об авторах:
Громова О.В., Нижегородцев СА., Кутырев В.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: [email protected]
Дятлов И.А. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. 142279, Оболенск, Московская обл. E-mail: [email protected]
Поступила 05.10.10.
