CC BY
25
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 1 - P. 152-157
УДК: 615.277.3 DOI: 12737/25252
ОПТИМИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ
ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА МЕТОДОМ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ
Н.А. ПЯТАЕВ*, А.В. ЗАБОРОВСКИЙ**, К.Г. ГУРЕВИЧ**, П.С. ПЕТРОВ*, А.В. КОКОРЕВ***, С .А. ФИРСТОВ*,
Е.П. БРОДОВСКАЯ*, Л.А. ТАРАРИНА**, Д.В. ЮНИНА**
'ФГБОУ ВО НИ МГУ им. Н.П. Огарёва, ул. Большевистская, 68, Саранск, 430005, Россия,
e-mail: [email protected] "ФГБОУ ВО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России, ул. Делегатская, 20, стр.1, Москва, 127473, Россия, e-mail: [email protected] ***ИАТЭ НИЯУМИФИ, Студгородок, д.1, г. Обнинск, Калужская область, 249040, Россия,
e-mail: [email protected]
Аннотация. Для оптимизации получения модифицированных противоопухолевых препаратов при их экспериментальной разработке необходим эффективный метод очистки синтезированных комплексов от не включившегося препарата. В работе предлагается использовать метод ультрафильтрации при помощи разработанной полезной модели для синтеза конъюгатов химиопрепаратов с полимерными носителями, а также для выделения ультрафильтрата, содержащего химиопрепарат, из плазмы крови и гомогенатов органов для определения концентрации препарата. При синтезе противоопухолевой композиции на основе доксорубицина и анионного полимера декегран-сульфата были апробированы 2 метода: диализ и ультрафильтрация. Показано, что метод ультрафильтрации имеет преимущества перед диализом: больше вероятность сохранения ультраструктуры наночастиц, т.к. не происходит их набухания; можно получать концентрированные коллоидные растворы хими-опрепарата. Кроме того, метод ультрафильтрации позволяет определять степень связывания хими-опрепарата с белками крови. Устройство было использовано при получении ультрафильтрата для проведения анализа концентрации лекарственных препаратов в крови, в частности - при исследовании фармакокинетики нового противоопухолевого препарата Ормустин. Использование ультрафильтрации обеспечило эффективное выделение аналита из матрицы (плазмы крови и гомогенатов органов). Кроме того, использование разработанного метода позволило существенно снизить стоимость пробоподготовки.
Ключевые слова: ультрафильтрация, диализ, направленный транспорт химиопрепаратов, химиотерапия
OPTIMIZATION OF PRODUCTION OF MODIFIED ANTICANCER DRUGS FOR TARGETING TRANSPORT BY USING THE ULTRAFILTRATION TECHNOLOGY
Ы.А. РУАТАБУ*, А.У. 7АБОКОУ8К1У**, K.G. GUREVICH**, P.S. PETROV*, А.У. KOKOREV***, Б.А. FIRSTOV*,
E.P. BRODOVS^YA*, Ь.А. TАRАRINА**, D.V. YUNIN^*
* Mordovia State N.P. Ogarev University, Bolshevist Street, 68, Saransk, 430005, Russia,
e-mail: [email protected] " Moscow State A.I. Evdokimov University of Medicine and Dentistry of the Ministry of Healthcare of Russia, StreetDelegatskaya, 20, page 1, Moscow, 127473, Russia, e-mail: [email protected] '"Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering of the National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute), Studgorodok, 1, Obninsk, Kaluga region, 249040, Russia,
e-mail: [email protected]
Abstract. An effective method of purification of the synthesized complexes and removing of the excess drug is needed to optimize the production of modified anticancer drugs. The authors propose the ultrafiltration technology with the experimental device that was developed for the synthesis of conjugates of chemo-therapeutic agents with polymeric carriers, as well for the separation of ultrafiltrate containing chemothe-rapeutic agents from plasma and organ homogenates for determining the concentration of the drug. Two
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 1 - P. 152-157
methods were tested during the synthesis of the antitumor composition based the doxorubicin and anionic polymer dextran sulfate: dialysis and ultrafiltration. It was shown that the ultrafiltration method has advantages over dialysis. An ultrafiltration provides a higher possibility of keeping the ultrastructure of nanopar-ticles, since they don't swell, and gives the opportunity to receive the concentrated colloidal solution of chemotherapeutic drug. In addition, the ultrafiltration allows to determining the degree of binding of che-motherapeutic drug with blood proteins. The device was used to obtain the ultrafiltrate to analyze the concentration of drugs in blood by HPLC, in particular - in the pharmacokinetic study of new anticancer drug the Ormustin. The use of ultrafiltration ensured effective isolation of the analyte from the matrix (plasma and organ homogenates) and substantial cost reduction for sample preparation.
Key words: ultrafiltration, dialysis, targeted drug delivery, chemotherapy.
Направленный транспорт лекарственных веществ - способ модификации известных лекарственных веществ для того, чтобы улучшить их поступление в ткани-мишени [4]. Наиболее активно разрабатывается направленный транспорт противоопухолевых препаратов, что позволяет снизить их токсичность и частоту побочных эффектов. Обычно в качестве носителей используются мицеллы (липосомы), на-ночастицы, биополимеры [1,5,8,9]. Число подобных носителей весьма ограничено, поэтому для большинства из них вопросы биобезопасности хорошо изучены [3]. Также изучены «старые» препараты, поэтому чаще всего проводится ограниченное изучение токсичности и эффективности модифицированного лекарственного средства («старый» препарат плюс носитель) [2,6].
При экспериментальной разработке модифицированных противоопухолевых препаратов встает задача оптимизации их получения. Одной из наиболее сложных задач является очистка синтезированных комплексов от невклю-чившегося препарата. Как правило, для этих целей используются гель-фильтрация, диализ, ультрацентрифугирование и ультрафильтрация. При этом ультрафильтрация является щадящим методом очистки и позволяет сохранить как химический состав, так и физические свойства полученных наночастиц. Однако применяется она достаточно редко. Это связан с тем, что производительность традиционно применяемых устройств для ультрафильтрации низкая, так как фильтрационное давление генерируется путем создания вакуума в ячейке для сбора ультрафильтрата, в связи с чем оно по определению не может быть выше 1 атмосферы. Кроме того, традиционные методы требуют достаточно больших объемов исходных веществ - минимум 20 мл, что приводит к удорожанию получаемых в эксперименте веществ.
Цель исследования - разработка и проверка эффективности усовершенствованного устройства для ультрафильтрации жидкости, которое могло бы повысить эффективность выделения разрабатываемых модифицированных противоопухолевых препаратов для экспериментальных целей.
Материалы и методы исследования. Нами ранее разработана полезная модель «Устройство для ультрафильтрации жидкостей» [7], позволяющая обеспечивать эффективное разделение коллоидных и истинных растворов методом ультрафильтрации через полупроницаемую мембрану с заданным размером пор. Устройство состоит из корпуса, ультрафильтрационной ячейки, поддерживающей сетки, ультрафильтрационной мембраны, перемешивающего элемента, собирательной воронки, уплотнительной втулки с патрубком, держателя емкости для сбора фильтрата. В фильтрационную камеру устройства вносится раствор для фильтрации и перемешивающий элемент, соприкасающийся с поверхностью мембраны.К фильтрационной камере с помощью гибкого шланга подключен источник сжатого газа, а само устройство в процессе проведения фильтрации подвергается шейкированию в горизонтальной плоскости.
Схема устройства приведена на рис. 1. Устройство состоит из корпуса 1, ультрафильтрационной ячейки 2, поддерживающей сетки 3, ультрафильтрационной мембраны 4, собирательной воронки 5, уплотнительной втулки с патрубком 6, уплотнительных прокладок 7, держателя емкости для сбора фильтрата 8, емкости для сбора фильтрата 9 и перемешивающего элемента 10.
10иККЛЬ ОБ ОТШ МЕБТСЛЬ ТЕСЫК0ШЫЕ8 - 2017 - V. 24, № 1 - Р. 152-157
Рис. 1. Схема устройства
Корпус устройства и прижимная гайка изготовлены из алюминия. Ультрафильтрационная ячейка, собирательная воронка, уплотни-тельная втулка с патрубком изготовлены из фторопласта марки Ф-4. В торцевых поверхностях стенок ультрафильтрационной ячейки выполнены углубления для установки уплотни-тельных прокладок. Поддерживающая сетка и ультрафильтрационная мембрана являются одноразовыми элементами. Сетка выполнена из капрона, имеющего сетчатую структуру с размером ячеек не более 1 мм. Фильтрационная мембрана может быть выполнена из ку-профана или другого материала с заданным размером пор. Перемешивающий элемент представляет собой шарик из стекла. В качестве емкости для сбора фильтрата использована пробирка типа «эппендорф».
Для фильтрации раствора осуществляются следующие действия. В корпус последовательно вставляются: собирательная воронка, поддерживающая сетка, фильтрационная мембрана, фильтрационная ячейка с уплотнительны-ми прокладками, уплотнительная втулка с патрубком. После этого уплотнительная втулка фиксируется прижимной гайкой. На корпусе закрепляется держатель емкости для сбора фильтрата с емкостью. Устройство закрепляется в вертикальном положении, после чего в фильтрационную камеру через патрубок уп-лотнительной втулки вводится разделяемый
раствор или смесь и вносится перемешивающий элемент. К патрубку уплотнительной втулки с помощью гибкого шланга герметично присоединяется источник сжатого газа (аргон) с давлением до 4 атмосфер. Устройство закрепляется вертикально на платформе вортекса и подвергается шейкированию в горизонтальной плоскости с частотой 100-200 Гц и амплитудой 2-5 мм. в течение времени, необходимого для проведения ультрафильтрации. По окончании процедуры фильтрации последовательно отключается источник колебаний, источник сжатого газа, отсоединяется держатель емкости с фильтратом, и из него извлекается емкость с фильтратом.
Результаты и их обсуждение. Разработанное устройство для ультрафильтрации было использовано при синтезе противоопухолевой композиции на основе доксорубицина и анионного полимера декстран-сульфата на этапе удаления несвязанного доксорубицина при его включении в наночастицы (заявка на изобретение Яи № 2016119268 «Противоопухолевый химиопрепарат»). Суть изобретения заключается в получении наночастиц диаметром 250300 нм, состоящих их полимера (декстран-сульфата) и противоопухолевого химиопрепа-рата доксорубицин. Полученные частицы отличаются большей противоопухолевой активностью по сравнению с «чистым» химиопрепа-ратом. На этапе очистки полученных частиц от невключившегося препарата были апробированы 2 метода: диализ и ультрафильтрация с использованием разработанного устройства. В таблице 1 приведены результаты сравнения эффективности очистки коллоидных наноча-стиц декстран-сульфат+доксорубицин от невк-лючившегося доксорубицина при синтезе.
На рис. 2-3 приведены: 1) изменение общего содержания препарата в коллоиде (в % от исходного) и 2) изменение его концентрации. Видно, что по эффективности очистки (т.е. по удалению несвязанного препарата) оба метода одинаковы. При диализе получается менее концентрированный коллоидный раствор (т.к. водный раствор доксорубицина замещается диализующей жидкостью), а при ультрафильтрации получается более концентрированный раствор (т.к. уменьшается объем смеси). При этом увеличение концентрации препарата в коллоиде непропорционально уменьшению его объема.
10иККЛЬ ОБ ОТШ МЕБТСЛЬ ТЕСЫК0ШЫЕ8 - 2017 - V. 24, № 1 - Р. 152-157
Таблица 1
Сравнительная эффективность разделения декстран-доксорубицина от невключенного препарата
Ультрафильтрация Диализ
До начала процедуры очистки По окончании процедуры очистки До начала процедуры очистки По окончании процедуры очистки
Размер частиц, нм 314±14 342±17 318±16 412±20
Концентрация доксо-рубицина в коллоиде, мг/мл 2,6±0,4 3,1 ±0,3 2,4±0,3 1,2±0,4
Объем смеси, %* 100 72 100 112
•— Диа^йз —•— У^&граф ИЛЫаЦИЯ Время?ч
Рис. 2. Изменение общего содержания препарата в коллоиде (в % от исходного) в процессе проведения диализа и ультрафильтрации
Рис. 3. Изменение концентрации препарата в коллоиде (в % от исходного) в процессе проведения диализа и ультрафильтрации
Метод ультрафильтрации показал следующие преимущества перед диализом: 1) значимая вероятность сохранения ультраструктуры наночастиц, т.к. не происходит их набухания. Это набухание может происходить из-за того, что при диализе частицы всегда находятся в избытке воды, а при фильтрации почти вся свободная вода удаляется; 2) можно получать
концентрированные коллоидные растворы хи-миопрепарата.
Кроме того, наш метод ультрафильтрации был апробирован для выделения безбелковой фракции из плазмы и гомогенатов органов для определения концентрации препарата в них при исследовании фармакокинетики. В предварительных экспериментах разработанная полезная модель показала высокую эффективность в разделении малых объемов высококонцентрированных белковых растворов, в частности плазмы человеческой крови. Выход ультрафильтрата достигал 60% от исходного объема плазмы. Устройство было использовано при получении ультрафильтрата для проведения анализа концентрации лекарственных препаратов в крови, в частности - при исследовании фармакокинетики нового противоопухолевого препарата Ормустин (табл. 2) [10]. Данный препарат достаточно является достаточно сложным для выделения, так как он хорошо растворим в воде, и плохо - в органических растворителях (включая ацетонитрил). Кроме того, он очень нестабилен при комнатной температуре. В связи с этим жидкостная экстракция практически неэффективна, а при твердофазной экстракции отмечаются достаточно большие потери аналита. Использование же ультрафильтрации обеспечило эффективное выделение аналита из матрицы (плазмы крови и гомогенатов органов). Кроме того, использование разработанного метода позволило существенно снизить стоимость пробоподготовки. В табл. 2 приведены некоторые результаты применения метода ультрафильтрации при разработке метода детекции нового противоопухолевого препарата Ормустин.
Таблица 2
Сравнительная эффективность экстракции ормустина разными методами
Степень экстракции, % Стоимость Пробоподготовки (1 проба), руб.
Жидкостная экстракция 15,5±2,8 64
Твердофазная экстракция 61,3±3,7 192
Ультрафильтрация 87,0±3,3 68
Заключение. Полученные результаты демонстрируют, что применение метода ультрафильтрации для пробоподготовки при фарма-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 1 - P. 152-157
кокинетических исследованиях целесообразно в том случае, если препарат отличится низкой стабильностью и имеет низкую растворимость в органических растворителях. Метод ультрафильтрации позволяет эффективно осуществлять: очистку конъюгатов химиопрепаратов с
Литература
полимерами от свободного препарата и выделение ультрафильтрата, содержащего анолит, из плазмы крови и гомогенатов органов при фармакокинетических исследованиях.
References
Berezov TT, Yaglova NV, Dmitrieva TB, Zhirkov YuA, Chekhonin VP. Napravlennyy transport lekarstven-nykh sredstv s pomoshch'yu liposom [Directional transport of drugs with liposomes]. Vestnik Ros-siyskoy akademii meditsinskikh nauk. 2004;5:42-7. Russian.
Gorbik PP, Petranovskaya AL, Turelik MP, Abra-mov NV, Turanskaya SP, Pilipchuk EV, Chekhun VF, Luk'yanova NYu, Shpak AP, Korduban AM. Problema napravlennogo transporta lekarstvennykh prepara-tov: sostoyanie i perspektivy [The problem of drug directional transport: the state and pros-pects].Khimiya, fizika ta tekhnologiya poverkhni. 2011;2(4):461-9. Russian.
Zyrnyaeva NN, Minaeva OV, Brodovskaya EP, Stolya-rov GS, Firstov SA, Zaborovskiy AV, Shemsutdinova EE.Sravnitel'naya effektivnost' nekotorykh metodov targetnoy khimioterapii pri eksperimental'noy kartsi-nome RS-1 u krys [Comparative efficacy of some methods of targeted chemotherapy in experimental carcinoma RS-1 in rats]. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2015;6-0:76. Russian. Ivonin AG, Pimenov EV, Oborin VA, Devrishov DA, Kopylov SN. Napravlennyy transport lekarstvennykh preparatov: sovremennoe sostoyanie voprosa i pers-pektivy [Directional transport of medicines: the current state of the issue and prospects]. Izvestiya Komi nauchnogo tsentra UrO RAN. 2012;9:46-55. Russian. Pyataev NA, Gurevich KG, Zaborovskiy AV, Koko-rev AV, Minaeva OV, Zyrnyaeva NA, Kladiev AA, Bychkovskiy PP, Revtovich MYu. Effektivnost' kombi-natsii svobodnoy i polimer-svyazannoy form prospidina s doksorubitsinom u krys s astsidnoy gepatomoy Zaydela [Efficacy of combination of free and polymer-bound forms of prospidin with doxorubicin in rats with ascidic hepatoma of Zaidel]. Khim-farm. Zhur-nal. 2014;48(11):96-100. Russian. Pyataev NA, Gurevich KG, Skopin PI, Minaeva OV. Targetnaya farmakoterapiya v onkologii [Targeted pharmacotherapy in oncology]. Meditsina kriti-cheskikh sostoyaniy. 2010;5:3. Russian. Pyataev NA, Minaeva OV, Petrov PS, Kokorev AV, Gurevich KG, Zaborovskiy AV; inventors. Ustroystvo dlya ul'trafil'tratsii zhidkostey [Device for ultrafiltration of liquids]. Russian Federatiob patent RU 154660; 2014. Russian.
Sanzhakov MA, Ignatov DV, Kostryukova LV, Druzhi-lovskaya OS, Medvedeva NV, Prozorovskiy VN, Ipato-va OM. Izuchenie svoystv lekarstvennykh kompozit-siy doksorubitsina v sostave kolloidnykh nanochastits
1. Березов Т.Т., Яглова Н.В., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А., Чехонин В.П. Направленный транспорт лекарственных средств с помощью липосом // Вестник Российской академии медицинских наук. 2004. № 5. С. 42-47.
2. Горбик П.П., Петрановская А.Л., Турелик М.П., Абрамов Н.В., Туранская С.П., Пилипчук Е.В., Че-хун В.Ф., Лукьянова Н.Ю., Шпак А.П., Кордубан
A.М. Проблема направленного транспорта лекарственных препаратов: состояние и перспективы // Хiмiя, фiзика та технолопя поверхнi. 2011. Т. 2, № 4. С. 461-469.
3. Зырняева Н.Н., Минаева О.В., Бродовская Е.П., Столяров Г.С., Фирстов С.А., Заборовский А.В., Шемсутдинова Е.Э. Сравнительная эффективность некоторых методов таргетной химиотерапии при экспериментальной карциноме РС-1 у крыс // Современные проблемы науки и образования. 2015. № 6-0. С. 76.
4. Ивонин А.Г., Пименов Е.В., Оборин В.А., Дев-ришов Д.А., Копылов С.Н.Направленный транспорт лекарственных препаратов: современное состояние вопроса и перспективы // Известия Коми научного центра УрО РАН. 2012. № 9. С. 46-55.
5. Пятаев Н.А., Гуревич К.Г., Заборовский А.В., Кокорев А.В., Минаева О.В., Зырняева Н.А., Клади-ев А.А., Бычковский П.П., Ревтович М.Ю. Эффективность комбинации свободной и полимер-связанной форм проспидина с доксорубицином у крыс с асцидной гепатомой Зайдела // Хим-фарм. Журнал. 2014. Т. 48, № 11. С. 96-100.
6. Пятаев Н.А., Гуревич К.Г., Скопин П.И., Минаева О.В. Таргетная фармакотерапия в онкологии // Медицина критических состояний. 2010. № 5. С.3.
7. Пятаев Н.А., Минаева О.В., Петров П.С., Кокорев А.В., Гуревич К.Г., Заборовский А.В. Устройство для ультрафильтрации жидкостей // Патент на полезную модель RUS 154660 26.11.2014.
8. Санжаков М.А., Игнатов Д.В., Кострюкова Л.В., Дружиловская О.С., Медведева Н.В., Прозоровский
B.Н., Ипатова О.М. Изучение свойств лекарственных композиций доксорубицина в составе колло-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 1 - P. 152-157
идных наночастиц с адресным фрагментом в экспериментах in vivo // Биомедицинская химия. 2016. Т. 62, вып. 2. С. 150-153.
9. Яббаров Н.Г., Посыпанова Г.А., Воронцов Е.А., Попова О.Н., Северин Е.С. Направленный транспорт доксорубицина . Сиситема доставки на основе РАМАМ дендримеров // Биохимия. 2013. Т. 78, № 8. С. 1128-1140.
10. Pyataev N.A., Petrov P.S., Burtasov А.А., Minae-va O.V., Kulikov O.A., Gurevich K.G., Zaborovskii A.V., Krasnov V.P., Kokorev A.V., Stolya-rov G.S., Zyrnyaeva N.N.. Method Development for Ouantitative Determination of Ormustine in Biological Fluids by High Performance Liquid Chromatography with Mass-Spectrometric Detection // Pharma-teutical Chemistry J. 2016. Vol. 49. P. 838.
s adresnym fragmentom v eksperimentakh in vivo [Study of the properties of doxorubicin drug compositions in colloidal nanoparticles with an address fragment in vivo]. Biomeditsinskaya khimiya. 2016;62(2):150-3. Russian.
Yabbarov NG, Posypanova GA, Vorontsov EA, Popo-va ON, Severin ES. Napravlennyy transport doksoru-bitsina. Sisitema dostavki na osnove RAMAM den-drimerov [Directional transport of doxorubicin. The delivery system based on RAMAM dendrimers]. Biok-himiya. 2013;78(8):1128-40. Russian. Pyataev NA, Petrov PS, Burtasov AA, Minaeva OV, Kulikov OA, Gurevich KG, Zaborovskii AV, Krasnov VP, Kokorev AV, Stolyarov GS, Zyrnyaeva NN. Method Development for Quantitative Determination of Ormustine in Biological Fluids by High Performance Liquid Chromatography with Mass-Spectrometric Detection. Pharmateutical Chemistry J. 2016;49:838.
