CC BY
0seizure (MES) model in the preclinical evaluation of potential new antiepileptic drugs. Methods Find Exp Clin Pharmacol 2009. 31 (2). P. 101-106.
13. Koella W.P. Animal Experimental Methods in the Study of Antiepileptic Drugs. In: Antiepileptic drugs. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 1985, pp. 283-340
14. Bloom P., Madeja M., Mushhoff U., Specmann E.-J. Effects of pentylenetetrazol are GABA receptors expressed in oocytes of Xenopus laurus: extra-
and intracellular sites of action // Neurosci. Let., 1996. V. 205. pp. 115-118
15. Clayton T., Chen J., Ernst M. et al. An updated, unified pharmacophore model of the benzodiaz-epine binding site is y-aminobutyric acid receptors: correlation with comparative models. // Current Medicinal Chemistry, 2007. V.14. Pp. 2755-2775.
ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА E. COLI, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗУ (PAL)
Бабич О.О.,
доктор технических наук Дышлюк Л.С., кандидат биологических наук Сухих С.А.
доцент
Кемеровский государственный университет
OPTIMIZATION OF THE CULTIVATION PARAMETERS OF THE RECOMBINANT STRAIN OF E. COLI PRODUCE L-PHENYLALANINE AMMONIUM-LIAZE (PAL)
Babich O.O.,
Doctor of Technical Sciences Dyshlyuk L.S., Candidate of Biological Sciences Sukhikh S.A.
assistant professor Kemerovo State University
Аннотация
С целью получения оптимального количества L-фенилаланин-аммоний-лиазу (PAL), используемый в качестве основного компонента для противоопухолевого препарата, произведена оптимизация параметров необходимых для культивирования рекомбинантного штамма E. coli
Abstract
In order to obtain the optimal amount of L-phenylalanine ammonia-lyase (PAL), which is used as the main component for the antitumor drug, the parameters necessary for the cultivation of the recombinant E. coli strain were optimized
Ключевые слова: L-фенилаланин-аммоний-лиаза, противоопухолевый препарат, параметры культивирования
Keywords: L-phenylalanine-ammonium-lyase, anticancer drug, cultivation parameters
В России на учете по онкозаболеваниям состоит около 3 млн человек. Каждый год специалисты в области медицины выявляют свыше 500 тыс. злокачественных новообразований [2. C. 3].
Проблема борьбы с раковыми заболеваниями на сегодняшний день имеет общенациональное и общегосударственное значение. К сожаление фармацевтический рынок России практические не имеет представителей отечественного производства, которые занимаются разработкой и выпуском противораковых препаратов [4. C. 6225].
Большая часть противоопухолевых препаратов представляют собой L-аспарагиназы, которая выделяется из различных бактериальных источников.
Наиболее перспективным является препарат L-фенилаланин-аммоний-лиаза (PAL), который предназначен для борьбы с опухолевыми новообразованиями. Эффективное действие такого препарата связано со
снижением уровня L-фенилаланина в лейкемических опухолевых клетках [3 C. 67].
Все вышеизложенное определило цель настоящего исследования, а именно оптимизация параметров культивирования рекомбинантного штамма E. coli, продуцирующего L-фенилаланин-аммоний-лиазу (PAL).
В автоинжукционной среде, содержащая в своём составе канамицин с концентрацией 100 мкг/мл, осуществляли ферментирование в на протяжении 18 и 32 ч, температурный режим процесса ферментирования составлял 37 °С и 25 °С. Средняя оптическая плотность клеток штамм E. coli BL21PAL была постоянной и находилась в пределах 7 оп.ед.
С помощью метода денситометрического анализа полученной электрофореграммы индуцирован-
ных лизатов клеток штамма E. coli BL21PAL, определили содержание находящегося в этих клетках белка L-фенилаланин-аммоний-лиазы (PAL). Результаты исследования представлены на рисунках 1 и 2.
Для проведения процесса индукции был выбран метод Штудиера, как один самых простых в исполнении и являющийся недорогой альтернативой классической индукции, в которой применяется изопропил-ß-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Во время
применения автоиндукции нет необходимости отслеживать значение оптической плотности клеточной культуры, а также не требуется дополнительный ввод индуцирующего агента.
Время, от начала момента инокуляции колонии в автоиндукционную среду до получения биомассы бактерий с оптической плотность равной 715 оп.ед. с образованным целевым белком, составило 15-20 ч.
Рисунок 1 - Денситограмма лизата клеток E. coli штамма BL21PAL после индукции экспрессии 0,2 % лактозой по методу Штудиера при температуре 25°С в течение 32 часов
0,2 % лактозой по методу Штудиера при температуре 37 °С в течение 18 часов
В результате проводимого исследования было установлено, что применение автоиндукционной среды для получения рекомбинантного белка L-фе-нилаланин-аммоний-лиазу (PAL) из клеток E. coli, позволило достигнуть максимального уровня его экспрессии в штамме BL21PAL до 35 %, что на 3 % больше, при использовании классического метода. В отличии от классической индукции с применением изопропил-ß-D -1 -тиогалактопиранозид (ИПТГ), в процессе автоиндукции с использованием 0,2 % лактозы отмечалось увеличение на 7-8 % максимального уровня экспрессии рекомбинант-ного бека.
Исходя из вышесказанного можно сделать вывод, что для синтеза рекомбинантного белка L-фенилаланин-аммоний-лиазы (PAL) целесообразнее использовать метод автоиндукции, который приводит к получению схожих результатов полученные более дорогостоящим и сложным методом классической индукции с применением 1 мМ изопропил-P-D-1-тиогалактопиранозид. Стоит также отметить, что используя автоиндукцию выход рекомбинант-ного белка увеличивается в 6-7 раз.
Список литературы
1. Виноградова, А.В. Культивирование микроорганизмов / А.В. Виноградова, Г.А. Козлова. -Пермь: Изд-во Пермс. политех. у-та, 2012. - 97 с.
2. Кропотов, М.А. Общие принципы лечения больных первичным раком головы и шеи / М.А. Кропотов // Практическая онкология. - 2003. - №4(1). -С. 1-8.
3. Просеков, А.Ю. Проектирование L-фенил-аланин-аммиак-лиазы штамма-продуцента на основе клеток Escherichia Coli / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич // Theoretical & Applied Science. - 2013. - № 6 (2). - С. 65-69.
4. Zendman, A.J. CTpll, a novel member of the family of human cancer/testis antigens / A.J. Zendman, I.M. Cornel issen, U.H. Weidle, D.J. Ridter, G.N. van Muijen // II Cancer Res. 1999. - Vol. 59. - P. 62236229.
ANALYSIS OF SECONDARY METABOLITES OF THE SUBMERGED GANODERMA SP. G06
MYCELIUM
Feklistova I.,
Head of the Laboratory of Molecular Genetics and Biotechnology, Biology faculty, Belarusian State University, Minsk, Belarus, candidate of biological science;
Maslak D.,
Head of the sector of Molecular Genetics and Biotechnology of Microorganisms, Biology faculty, Belarusian State University, Minsk, Belarus
Sadovskaya L.,
Senior researcher, Laboratory of Molecular Genetics and Biotechnology, Biology faculty,
Belarusian State University, Minsk, Belarus
Skakun T.,
Senior researcher, Laboratory of Molecular Genetics and Biotechnology, Biology faculty, Belarusian State University, Minsk, Belarus
Le Huy Ham
Chairman of Science Council, Institute of Agricultural Genetics, Hanoi, Vietnam, Professor
Abstract
The chemical composition of the Ganoderma sp. G06 mycelium was studied. Methanol extracts of biologically active substances from mycelium were obtained. Secondary metabolites composition was revealed on Agilent 6850 gas chromatograph equipped with Agilent 5975B mass detector. Qualitative analysis was based on comparing the mass spectra of components with the corresponding data of NIST0.5a library. Sterols, fatty acids and their derivatives, alcohols and their derivatives were detected in the methanol extract of Ganoderma sp. G06.
Keywords: Ganoderma sp. G06, mycelium, deep cultivation, ergosterol, cardis.
To introduce one new active substance of a medicinal product into medical practice, it is necessary to investigate more than 5,000 potentially useful substances. It was found that the development of successful medicinal product is required on $ 802 million [1] and 10-15 years of hard work. Taking into account the very low success rates and the incredible costs of drugs development, it is important for each research center to supply the maximum possible number of expectant compounds for medicinal products.
An inexhaustible source of medicinal compounds (antitumoral and antimicrobial agents) are a lot of living organisms, including plants, bacteria, actinomy-cetes and fungi. Fungi of the genus Ganoderma are the producers of a whole complex of biologically active compounds used in pharmacology. In particular, the ethanolic extract of Ganoderma lucidum proved to be an effective hepatoprotector for treating mice with liver damaged by alcohol: the triterpenoids of these fungi suppressed lipid peroxidation, immune inflammation and suppressed apoptosis of liver cells [4]. In addition, Ganoderma lucidum metabolites have shown high efficiency in struggle with obesity [2].
The aim of this work is to study the chemical composition of the mycelium of Ganoderma sp. G06 fungi obtained by deep cultivation. The Ganoderma sp. G06 strain (country of origin - Thailand) was provided for study by the Agricultural Genetics Institute (Hanoi, Vietnam) and deposited under number G06 in the collection of microorganisms of the Biology Faculty of Bela-rusian State University.
Using Agilent 6850 gas chromatograph equipped with Agilent 5975B mass detector, analysis of chemical composition of the methanol extract from the dry mycelium of the deep culture of Ganoderma sp. G06 was carried out. To identify the components of the mixture, the mass spectra data obtained during the studies were compared with the information of the mass spectrometer library NISTO.5.0a. The percentage of the biologically active components of the mycelium of Ganoderma sp. G06, converted to methanol extract, was calculated by the area of the peaks. During this work 99.08 % of extract compounds were identified, the data obtained are presented in the table.
