CC BY
14
ОПТИМИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ ИЛ-1 в, COL2A1> MMP-8 У ПАЦИЕНТОВ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПЕРИОДОНТА
Руденкова Татьяна Владимировна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории Белорусской медицинской академии последипломного образования, Минск
Костюк Светлана Андреевна, доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории
Белорусской медицинской академии последипломного образования, Минск
Полуян Ольга Сергеевна, научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории
Белорусской медицинской академии последипломного образования, Минск
Юдина Наталья Александровна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой общей стоматологии Белорусской медицинской академии последипломного образования, Минск Яковлева-Малых Маргарита Олеговна, ассистент кафедры общей стоматологии Белорусской медицинской академии последипломного образования, Минск
Tatyana Rudenkova, PhD, Leading Researcher of the Research Laboratory of the Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk
Svetlana Kostiuk, MD, Professor, Chief Researcher of the Research Laboratory of the Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk
Olga Poluyan, Researcher of the Research Laboratory of the Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk
Natalia Yudina, MD, Professor, Head of the Department of General Dentistry of the Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk
Margarita lakovleva-Malykh, Assistant of the Department of General Dentistry, Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk
Optimization of molecular biological analysis to identify the nucleotide sequences of the genetic determinants of IL-ip, COL2A1, MMP-8 in patients with periodontal diseases
Цель. Разработка метода молекулярно-генетической идентификации вариантов генетических детерминант - генов, контролирующих синтез цитокинов, коллагена, металлопротеиназ в эпителиальных клетках полости рта, и проведение апробации на биологическом материале у пациентов с заболеваниями периодонта.
Материалы и методы. При разработке метода молекулярно-генетического анализа вариантов генетических детерминант в эпителиальных клетках полости рта исследования проводили с использованием биологического материала от пациентов с хроническим сложным периодонтитом (n=3) и хроническим простым периодонтитом (n=3), а также лиц с хроническим простым маргинальным гингивитом (контрольная группа, n=4).
Заключение. Для гена ИЛ-1 в была выявлена замена А21521С в двух образцах. Для гена COL2A1 в одном образце были обнаружены замены C36245A и C36271A. Для гена MMP-8 в одном образце наблюдали замену G19137T Ключевые слова: периодонтит, генетические маркеры, цитокины, коллаген, металлопротеиназы. Современная стоматология. — 2020. — №3. — С. 54—59.
Objective. Development of a method for molecular genetic identification of variants of genetic determinants - genes that control the synthesis of cytokines, collagen, metalloproteinases in epithelial cells of the oral cavity and to conduct testing on biological material in patients with periodontal diseases.
Materials and methods. When developing a method for molecular genetic analysis of variants of genetic determinants in epithelial cells of the oral cavity, studies were carried out using biological material from patients with chronic complex periodontitis (n=3) and chronic simple periodontitis (n=3), as well as individuals with chronic simple marginal gingivitis (control group, n=4).
Conclusion. For the 1Ыв gene, the A21521C substitution was detected in two samples. For the COL2A1 gene, substitutions C36245A and C36271A were found in one sample. For the MMP-8 gene, the G19137T substitution was observed in one sample. Keywords: periodontitis, genetic markers, cytokines, collagen, metalloproteinases. Sovremennaya stomatologiya. — 2020. — N3. — P. 54—59.
Одним из широко распространенных патологических воспалительных процессов полости рта является хронический периодонтит (пародонтит). Хронический периодонтит представляет собой воспалительное заболевание, приводящее к деструкции тканей периодонта и является основной
причиной потери зубов у взрослого населения. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, 4-22% взрослого населения страдают периодонтитом тяжелой степени тяжести, 23-47% -периодонтитом средней степени тяжести и только у 1-8% населения периодонт остается интактным. Распространенность
заболеваний периодонта среди взрослого населения по миру в целом оценивается на уровне 93-95% [1, 2].
Ведущая роль в развитии периодонтита принадлежит микробному фактору, однако выраженность воспалительной реакции в значительной мере определяется возможностями макроорганизма противостоять воз-
действию на него патогенной микрофлоры. В литературе представлен ряд публикаций, посвященных изучению факторов, которые не вызывают заболевание, но ассоциированы с тяжелым течением воспалительного процесса. К таким факторам относят и генетический статус человека [3].
Несмотря на проведенные многочисленные исследования, не установлено достоверных маркеров, которые позволяли бы проводить оценку предрасположенности конкретного пациента к развитию периодонтита или прогнозировать течение и исход заболевания. Разработка таких критериев позволит осуществлять раннюю диагностику и назначать адекватное обоснованное лечение пациентам с периодонтитом. Наиболее перспективным направлением в поиске маркеров предрасположенности и прогноза является идентификация генетических факторов, ассоциированных с риском развития, вариантом течения и исходом периодонтита [4].
Развитие и совершенствование моле-кулярно-генетических методов анализа дали возможность активно изучать геном человека, что позволило расширить поиск генов-кандидатов, полиморфизм которых мог быть связан с вероятностью возникновения, особенностями течения и исходом заболеваний [3]. Гены, кодирующие цитокины (интерлейкины (ИЛ), факторы роста, интерфероны, хемокины и др.), стали первыми генами-кандидатами, изменения в которых попытались связать с патогенезом воспалительных заболеваний, в том числе и воспалительных заболеваний периодонта. Так как продукты этих генов - цитокины - являются ключевым звеном иммунного ответа при любых воспалительных реакциях.
ИЛ-1 р - провоспалительный цито-кин, которому принадлежит ведущая роль в процессах острого и хронического воспаления как местного, так и системного характера. Секретирует-ся преимущественно макрофагами, а также Т-лимфоцитами, фибробластами и клетками эпителия. Под влиянием липополисахаридов клеточной стенки периодонтопатогенной микрофлоры происходит стимуляция продукции ИЛ-
1р макрофагами. Далее посредством аутокринных механизмов он сам активирует свою выработку. ИЛ-1 р индуцирует продукцию матриксных металлопротеи-наз, тормозит синтез их ингибиторов, повышает функциональную активность остеокластов. Также установлено, что ИЛ-1 р тормозит миграцию остеобластов. Напротив, угнетение ИЛ-1 р сопровождается значительным замедлением «движения» воспалительного инфильтрата в сторону кости и подавлением ее потери. А. Ваккег и соавт. (2009) сообщают, что данный цитокин вызывает апоптоз остеоцитов [8].
Повышенные уровни ИЛ-1 р в десневой жидкости и слюне пациентов с хроническим периодонтитом напрямую взаимосвязаны с тяжестью поражений, а также клиническими симптомами заболевания [9]. По мнению ряда авторов, наличие корреляции между концентрацией ИЛ-1 р и степенью тяжести воспалительных и деструктивных процессов в периодонте делает данный цитокин ценным диагностическим маркером патологии [10].
Еще одним направлением поиска генетических маркеров предрасположенности к заболеваниям периодонта стало изучение генов медиаторов воспаления, которые оказывают непосредственное влияние на течение воспалительного процесса. Гены матриксных металло-протеиназ - ММР-2, ММР-3, ММР-8 и ММР-9 - также могут быть изучены для выявления возможных генетических маркеров, ассоциированных с предрасположенностью к воспалительным заболеваниям периодонта, поскольку матриксные металлопротеиназы относятся к семейству внеклеточных протеиназ, основными функциями которых являются участие в обмене белков соединительной ткани, развитии и ремоделировании клеточного матрикса, репарации тканей, неоангиогенезе [11].
В последнее время было установлено, что повышенный уровень ММП-8, особенно в активной форме (аММП-8), в жидкостях полости рта связан с воспалением (заболеваниями периодонта и при периимплантитах), особенно в клинически активных фазах. Периодонтальная дегенерация костной ткани вызвана
интерстициальной коллагеназой ММП-8, а не бактериальными ферментами, ММП-8 высвобождается из нейтрофилов селективной дегрануляцией, запускаемой мощными периодонтопатогенными бактериями и их факторами вирулентности вместе с провоспалительными медиаторами хозяина [12, 13].
Фибробласты десны при стимуляции провоспалительными медиаторами, такими как интерлейкин (ИЛ-1 р и фактор некроза опухоли а) могут продуцировать колла-генолитические ММП, включая ММП-8. Уровень активной ММП-8 отражает, предсказывает и связан с прогрессирующей активностью заболеваний периодонта и периимплантитом. Также установлена связь между повышением уровня аММП-8 в жидкостях полости рта (слюна, десневая жидкость) с клиническими параметрами периодонта, то есть с глубиной зондирования кармана, кровоточивостью при зондировании и потерей зубодесневого прикрепления [14, 15].
Цель исследования - разработать метод молекулярно-генетической идентификации вариантов генетических детерминант - генов, контролирующих синтез цитокинов, коллагена, металлопротеиназ в эпителиальных клетках полости рта, и провести апробацию на биологическом материале у пациентов с заболеваниями периодонта.
Материалы и методы
Исследования проводились на базе кафедры общей стоматологии Белорусской медицинской академии последипломного образования (БелМАПО), Научно-исследовательской лаборатории (НИЛ) БелМАПО (группа ПЦР-диагностики, отдел метаболической диагностики).
Объектами исследования явились пациенты с заболеваниями периодонта (пародонта). Были выделены следующие нозологические формы: хронический простой и сложный периодонтит, хронический простой маргинальный гингивит. При разработке метода мо-лекулярно-генетического анализа вариантов генетических детерминант (гены, контролирующие синтез цито-кинов, коллагена, металлопротеиназ) в эпителиальных клетках полости рта
Таблица 1 Значения А260/А280, полученные при использовании различных наборов реагентов для выделения ДНК (Ме Ю25^75))
Название набора А260/280
«Проба-НК» 1,57 (1,51/1,66)
«Экстракция-100» 1,69 (1,65/1,71)
«ДНК-сорб-В» 1,34 (1,13/1,61)
Метод классической фенол-хлороформной экстракции 1,71 (1,69/1,73)
исследования проводили с использованием биологического материала от пациентов с хроническим сложным периодонтитом (n=3) и хроническим простым периодонтитом (n=3), а также лиц с хроническим простым маргинальным гингивитом (контрольная группа, n=4).
В качестве биологического материала у пациентов проводили взятие соскобов эпителиальных клетках полости рта. Для получения соскобного материала использовали стерильные бумажные штифты №40, полученный образец помещали в пробирку типа эппендорф объемом 1,5 мл, содержащую 200 мкл транспортной среды («ВекторБест», РФ). Пробирки замораживали и оставляли для хранения при температуре -18 °С.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась при помощи компьютерной программы STATISTICA 10. При этом вид распределения переменных определяли с использованием критерия Колмогорова - Смирнова. Так как распределение значений переменных было отличным от нормального, для их описания использовали медиану и квартили (Me (Q25/Q75)). Для сравнения количественных показателей в исследуемых группах применялся критерий Манна - Уитни. При уровне значимости р<0,05 различия считались статистически достоверными.
Результаты и обсуждение
Для оптимизации метода выделения ДНК из соскобов эпителиальных клеток полости рта были использованы наборы для выделения нуклеиновых кислот «Проба-НК» («ДНК-технология», РФ), «Экстракция-100» («ВекторБест», РФ), «ДНК-сорб-В» («АмплиСенс», РФ) и метод классической фенол-хлороформной экстракции.
Для определения концентрации и степени чистоты выделенной ДНК из образцов биологического материала с использованием различных наборов реагентов проводили спектрофотометрические исследования (NanoDrop 1000, Thermo scientific, США), при этом определяли отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (А260/А280).
Метод выделения с использованием фенол-хлороформной экстракции был
взят в качестве референсного. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Для чистого препарата ДНК с отсутствием примесей белка и других ингибиторов значение А260/А280 составляет 1,8. Достоверно более высокие значения А260/А280, близкие к значениям рефе-ренсного метода (метод фенол-хлороформной экстракции), были установлены при использовании набора реагентов «Экстракция-100» (критерий Манна -Уитни, p<0,05).
После анализа полученных данных был сделан вывод, что для проведения дальнейших исследований по молеку-лярно-генетической идентификации вариантов генетических детерминант (гены, контролирующие синтез цито-кинов, коллагена, металлопротеиназ) в эпителиальных клетках полости рта, оптимальным является использование набора реагентов «Экстракция-100» («ВекторБест», РФ).
На следующем этапе с использованием программного обеспечения Vector
NTI и базы данных нуклеотидных последовательностей NCBI BLAST были подобраны пары праймеров (прямой (forward) и обратный (reverse)) для изучения нуклеотидных последовательностей генетических детерминант ИЛ-1 р, COL2A1, MMP-8 (табл. 2).
Для всех генов были выбраны по три пары праймеров с целью найти оптимальные последовательности для достижения наилучшего результата при проведении молекулярно-генетического анализа.
Дизайн олигонуклеотидов, осуществленный поэтапно для каждого гена, контролирующего синтез ИЛ-1 р, COL2A1, MMP-8, и последовательно для каждого выбранного гомологичного участка (c использованием бесплатного программного онлайн приложения Primer3 v.0.4.0 и бесплатного онлайн алгоритма mfold/DNAfold) позволил оценить вероятность образования вторичных шпилечных структур ампликона, а также вероятность стерических препятствий для связывания олигонуклеотидных праймеров и флуо-
Таблица 2 Последовательности праймеров для изучения генетических детерминант ИЛ-1Р, COL2A1, MMP-8
Название гена Последовательность праймера Фрагмент гена
ИЛ-1 p-1-forward TGGTGTAGGTGGGGCATGTA 21041 - 22648
ИЛ-1 в-1-reverse AGAATTAGCAAGCTGCCAGGA
ИЛ-1 p-2-forward GTATGGTGTAGGTGGGGCAT 21038 - 22647
ИЛ-1 p-2-reverse GAATTAGCAAGCTGCCAGGAG
ИЛ-1 p-3-forward GGCAACCTCAGTGAAGCCTTA 20777 - 22648
ИЛ-1 в-3-reverse AGAATTAGCAAGCTGCCAGGAG
COL2A1-1-forward CTGTCCTTGTTCCCTCCTTCC 36019 - 37360
COL2A1-1-reverse TCCGTAACTTCAAGGCCAAGT
COL2A1-2-forward GCGTTTAGCTCTGATTCCTTAGC 35557 - 37361
COL2A1-2-reverse ATCCGTAACTTCAAGGCCAAGTG
COL2A1-3-forward CTGTCCTTGTTCCCTCCTTCCT 36019 - 37357
COL2A1-3-reverse CCGTAACTTCAAGGCCAAGTGAT
MMP-8-1-forward TCTGCTCATTGCTGGCCTTT 18954 - 20099
MMP-8-1-reverse CCAGGGAACATATGTGTGTGA
MMP-8-2-forward GCTCATTGCTGGCCTTTTGA 18957 - 20100
MMP-8-2-reverse GCCAGGGAACATATGTGTGTGAC
MMP-8-3-forward CATCCATCCCCACACCAAGA 18751 - 19813
MMP-8-3-reverse AGTCTTGGCACTACATCAGAATC
Таблица 3 Результаты обнаружения изучаемых участков генетических детерминант в биологическом материале обследованных пациентов (п=10)
Название гена Частота выявления, % (n)
ИЛ-1 ß-1 (1608 п.о.) 100,00 (10)
ИЛ-1 ß-2 (1610 п.о.) 70,00 (4)
ИЛ-^-3 (1872 п.о.) 90,00 (9)
COL2A1-1 (1342 п.о.) 100,00 (10)
COL2A1-2 (1805 п.о.) 40,00 (4)
COL2A1-3 (1341 п.о.) 70,00 (7)
MMP-8-1 (1146 п.о.) 40,00 (4)
MMP-8-2 (1144 п.о.) 90,00 (9)
MMP-8-3 (1063 п.о.) 80,00 (8)
ресцентно-меченых зондов и выбрать наиболее оптимальные варианты - 6 наборов: олигонуклеотидный праймер - флуоресцентно-меченый зонд - олигонуклеотидный праймер. С использованием онлайн приложения NCBI/Blast подтверждена высокая специфичность выбранных наборов олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов.
Для выбора гена, который будет использоваться в качестве внутреннего контроля, провели количественный анализ и расчет коэффициента вариации для house-keeping генов человека: NAGK, GAPDH, HGUS, р-актин. Housekeeping гены человека присутствуют во всех клетках. Для оценки концентрации house-keeping генов человека использовали плазмидный стандарт, а затем рассчитывали коэффициент вариации (CV), исходя из полученных значений концентраций house-keeping генов [3, 4]. Амплификацию всех проб проводили в дублях, для расчета коэффициента вариации использовали средние значения концентраций, полученные в ходе исследования.
Для генов GAPDH, HGUS и р-актин рассчитанные значения коэффициентов вариации находились на уровне 6,9%, 10,5% и 19,4% соответственно.
В результате анализа полученных данных в качестве внутреннего контроля был выбран ген человека NAGK, так как именно для него было установлено самое низкое значение коэффициента вариации - 3,7%.
В ходе оптимизации состава амплифи-кационной смеси были протестированы различные объемы внесения праймеров (от 1 до 2 мкл), ДНК (от 3 до 10 мкл) и воды.
По результатам исследований был выбран оптимальный состав амплифика-ционной смеси, в который были включены 15,0 мкл 2Х Quick-Load Taq Master Mix; 1,5 мкл смеси эквивалентных концентраций праймеров (прямого и обратного) и зонда для идентификации исследуемого гена, 5,6 мкл воды и 8 мкл ДНК.
При оптимизации программы амплификации варьировали длительность горячего старта (от 5 до 15 мин); длительность этапа денатурации (от 10 до 20 с); длительность (от 30 до 60 с) и температуру (от 58 °С до 63 °С) этапа отжига; количество циклов амплификации (от 35 до 50).
По результатам проведенных исследований был выбран оптимальный вариант программы амплификации: 1 цикл: 95 °С - 5 мин; 45 циклов: 95 °С - 20 с, 60 °С - 40 с.
Для анализа возможности использования подобранных праймеров, оптимизированного состава амплификационной смеси и программы амплификации при изучения нуклеотидных последовательностей генетических детерминант ИЛ-1 р, COL2A1, MMP-8 проводили постановку классической ПЦР с дальнейшей визуализацией результата методом электрофореза. Пробы ставили в дублях. Результаты, полученные в ходе выполнения данного этапа, представлены в таблице 3.
Результат выявления/отсутствия амплификации последовательности таргетного гена в каждом образце считался валидным (положительным или отрицательным) при условии, что для данного образца был установлен факт успешной амплификации для гена внутреннего контроля NAGK. В случае, если результат амплификации для гена NAGK был отрицательным, об-
разец подвергался повторному анализу, начиная с этапа выделения ДНК.
В ходе проведения исследований на биологическом материале пациентов (n=10) во всех пробах была выявлена амплификация референсного гена NAGK. При анализе данных об амплификации таргетных генов было установлено, что использование подобранных пар праймеров ИЛ-1 ß-1 (1608 п.о.) и COL2A1-1 (l342 п.о.) позволяет получать ампликоны таргетных участков генов ИЛ-1 ß и COL2A1 в 100% случаев. Поэтому именно эти последовательности были выбраны для проведения дальнейших молекулярно-генетических исследований.
Для гена MMP-8 последовательности праймеров MMP-8-2 (1144 п.о.) и MMP-8-3 (1063 п.о.) позволяли амплифицировать таргетные участки гена в 90% и 80% случаев соответственно, при этом пробы, в которых результат, полученный с использованием праймеров MMP-8-2, был отрицательным, стали положительны при использовании праймеров MMP-8-3. Поэтому для дальнейших исследований было решено использовать две пары праймеров: MMP-8-2 - как основную и MMP-8-3 - как дополнительную, при отрицательном результате, полученном с использованием основной пары праймеров.
В ходе выполнения этапа электро-форетического анализа дополнительно проводили оценку уровня амплификации неспецифических фрагментов ДНК. Во всех проанализированных образцах на электрофореграмме присутствовали четкие полоски на уровне детекции специфических фрагментов ДНК гена NAGK и изучаемых генов, в соответствии с маркером молекулярного веса.
После проведения электрофореза из геля вырезали фрагменты, содержащие фрагменты изучаемых генов. Затем ДНК извлекали из геля с использованием набора реагентов QIAquick Gel extraction kit (Qiagen, Германия) для проведения секвенирования с целью анализа нукле-отидной последовательности полученных фрагментов ДНК.
Сиквенс-анализ проводили с использованием набора реагентов BigDye
Таблица 4 Нуклеотидные замены в последовательностях ИЛ-1 ß, COL2A1, MMP-8
Номер образца Нуклеотидные замены
ИЛ-^ COL2A1 MMP-8
2 А21521С G19137T
4 C36245A C36271A
5 А21521С
Terminator Cycle Sequencing kit v3.1 (Applied Biosystems, США), отдельно с forward- и revers-праймером для каждого гена, чтобы проанализировать последовательность нуклеотидов в двух направлениях. Секвенированные фрагменты ДНК подвергались очистке с использованием набора реагентов DyeEx 2.0 Spin kit (Qiagen, Германия) и последующему сиквенс-анализу на генетическом анализаторе ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США).
Полученные данные о нуклеотидной последовательности образцов сравнивали с зарегистрированными последовательностями идентифицируемых генов в online поисковой системе BLAST (www.ncbi. nlm.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html) для идентификации принадлежности той или иной последовательности определенному гену [5]. Затем проводили поиск и идентификацию нуклеотидных замен.
В качестве референсных использовали зарегистрированные нуклеотидные последовательности: ИЛ-1 ß - Human interleukin 1-beta (IL1B) gene, complete cds, GenBank: M15840.1; COL2A1 - Homo sapiens collagen type II alpha 1 chain (COL2A1), RefSeqGene on chromosome 12, GenBank: NG_008072.1; MMP-8 - Homo sapiens matrix metallopeptidase 8 (MMP8), RefSeqGene on chromosome 11, GenBank: NG_012101.1.
В ходе изучения нуклеотидных последовательностей генов ИЛ-1 ß, COL2A1, MMP-8 у обследованных пациентов были выявлены замены одного и двух нуклеотидов в 3 образцах (табл. 4).
Для гена ИЛ-1 ß была выявлена замена А21521C в двух образцах. Для гена COL2A1 в одном образце обнаружены замены C36245A и C36271A. Для гена MMP-8 в одном образце наблюдали замену G19137T
По итогам исследования выявлено, что чувствительность ПЦР-анализа при уста-
новленных оптимальных параметрах реакции зависит от процедуры пробоподготовки исследуемого биологического материала, включающей экстракцию нуклеиновых кислот. Благодаря этому происходит не только концентрирование исследуемой матрицы ДНК в малом объеме, но и удаление ингибиторов ПЦР. При этом определенная специфика ингибиторов характерна для конкретных разновидностей биологического материала. Наибольшее снижение диагностической эффективности ПЦР происходит на этапах, связанных с эффективностью лизиса клинического материала и экстракцией ДНК/РНК, с деградацией ДНК/РНК-матрицы. Низкая эффективность ПЦР может определяться образованием сложных комплексов ДНК-белка, что обусловливает появление дополнительных полос на этапе электрофоретической детекции результатов, вызванное фраг-ментированием ДНК-мишени. Нами подтверждено, что использование набора реагентов «Экстракция-100» («ВекторБест», РФ) является оптимальным для проведения исследований по молекулярно-генетиче-ской идентификации вариантов генетических детерминант (гены, контролирующие синтез цитокинов, коллагена, металлопро-теиназ) в эпителиальных клетках полости рта человека.
Заключение
Для всех генов были выбраны по три пары праймеров с целью найти оптимальные последовательности для достижения наилучшего результата при проведении молекулярно-генетического анализа. Дизайн олигонуклеотидов, осуществленный поэтапно для каждого гена, контролирующего синтез ИЛ-1р, ^2А1, ММР-8, и последовательно для каждого выбранного гомологичного участка позволил оценить вероятность образования вторичных шпилечных структур ампликона, а также вероятность стерических препятствий для
связывания олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и выбрать наиболее оптимальные варианты - 6 наборов: олигонуклеотидный праймер - флуоресцентно-меченый зонд - олигонуклеотидный праймер. С использованием онлайн-при-ложения NCBI/Blast подтверждена высокая специфичности выбранных наборов олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов. Проведено моделирование совместимости внутреннего контроля и олигонуклеотидных праймеров и зондов для амплификации участков генов ИЛ-1 р, Ш.2А1, ММР-8 в условиях мультиплексной ПЦР (две реакции в одной пробирке). В ходе проведенных исследований оптимизированы состав амплификационной смеси и условия термоциклирования для амплификации участков генов ИЛ-1 р, ^2А1, ММР-8 в условиях мультиплексной ПЦР.
С использованием метода секвениро-вания изучены нуклеотидные последовательности генетических детерминант, контролирующих синтез цитокинов (ИЛ-1 р), коллагена (COL2A1), металлопротеиназ (ММР-8) в эпителиальных клетках полости рта пациентов. Для гена ИЛ-1 р выявлена замена А521С в двух образцах, для гена COL2A1 в одном образце - замены С245А и С271А, для гена ММР-8 в одном образце - замена G137T
Можно предположить, что выявленные в ходе исследований полиморфизмы встречаются в популяции и считаются вариантом биологической нормы, сами по себе они не являются непосредственной причиной развития заболевания, но способствуют усугублению тяжести его течения за счет особенностей протекания иммунных реакций конкретного макроорганизма в ответ на присутствие инфекционных агентов. То есть в человеческой популяции распространены генетические факторы, которые обусловливают биологический механизм, с помощью которого у некоторых индивидуумов под воздействием микробного фактора может проявляться более выраженный иммуновоспалительный ответ, что приводит к более тяжелому течению заболевания. Все это определяет необходимость проведения дальнейших научных исследований.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Леус П.А., Юдина Н.А. Заболевания периодонта. Диагностика. Профилактика. Лечение. Современные методы // Минск: Энергопресс. -2015. - С. 386. / Leus P.A., Yudina N.A. Zabolevaniyaperiodonta. Diagnostika. Profilaktika. Lecheniye. Sovremennyye metody [Periodontal diseases. Diagnostics. Prevention. Treatment. Modern methods]. Minsk: Energopress, 2015, pp.386. (in Russian)
2. Юдина, Н.А. Эпидемиологическое исследование стоматологических заболеваний в мире и Республике Беларусь / Н.А. Юдина, В.И. Долин, О.В. Юрис. - Германия, 2017. - 155 с. / Yudina N.A., Dolin V.I., Yuris O.V. Epidemiologicheskoye issledovaniye stomatologicheskikh zabolevaniy v mire i Respublike Belarus' [Epidemiological study of dental diseases in the world and the Republic of Belarus]. Germaniya: Lambert. Academic Publishing, 2017, 155 p. (in Russian)
3. Руденкова, Т.В. Генетические маркеры предрасположенности к воспалительным заболеваниям периодонта (парадонта) / Т.В. Руденкова, С.А. Костюк, Н.А. Юдина, М.О. Яковлева-Малых, О.С. Полуян, Т.В. Глинкина // Стоматологический журнал. - 2019. - №2. - С.85-90. / Rudenkova T.V, Kostyuk S.A., Yudina N.A., Yakovleva-Malykh M.O., Poluyan O.S., Glinkina T.V Geneticheskiye markery predra-spolozhennosti k vospalitel'nym zabolevaniyam periodonta (paradonta) [Genetic markers of predisposition to inflammatory diseases of the periodontal (periodontal)]. Stomatologicheskiyzhurnal, 2019, vol.2, pp.85-90. (in Russian)
4. Костюк, С.А. Предиктивная медицина и методы генетического тестирования / С.А. Костюк // Медицинские новости. - 2016. - №4. - С.11-14. Kostyuk S.A. Pre-diktivnaya meditsina i metody geneticheskogo testirovaniya [Predictive medicine and methods of genetic testin]. Meditsinskiye novosti, 2016, vol.4, pp.11-14. (in Russian)
5. Костюк, С.А. Валидация молекулярно-биологических методов лабораторной диагностики / С.А. Костюк // Медицинские новости. - 2012. - №4. - С.16-19. / Kostyuk S.A. Validatsiya molekulyarno-biologicheskikh metodov laboratornoy diagnostiki [Validation of molecular biological methods of laboratory diagnostics]. Meditsinskiye novosti, 2012, vol.4, pp.16-19. (in Russian)
6. Бадыгина, Н.А. Организация системы контроля качества исследований методом полимеразной цепной реакции / Н.А. Бадыгина [и др.] // Лабораторная диагностика. Восточная Европа. - 2012. - №1. - С.28-38. / Badygina N. A. [i dr.] Organizatsiya sistemy kontrolya kachestva issledovaniy metodom polimeraznoy tsepnoy reaktsii [Organization of the quality control system for research by the poly-
Адрес для корреспонденции Кафедра общей стоматологии
Белорусская медицинская академия последипломного образования г. Минск, Кедышко, 28 220114, Республика Беларусь, тел.: +375 17 268-84-82
Юдина Наталья Александровна, e-mail: [email protected] Руденкова Татьяна Владимировна, e-mail: [email protected]
merase chain reaction method]. Laboratonaya diagnostika. Vostochnaya Yevropa, 2012, vol.1, pp.28-38. (in Russian)
7. Руденкова, Т.В. Анализ нуклеотидных замен в генах, кодирующих белки цитоадгезии Mycoplasma genitalium / Т.В. Руденкова // Репродуктивное здоровье. Восточная Европа. - 2012. - №5. - С.185-188. / Rudenkova TV Analiz nukleotidnykh zamen v genakh, kodiruyushchikh belki tsitoadgezii Mycoplasma genitalium [Analysis of nucleotide substitutions in genes encoding Mycoplasma genitalium cytoadhesion proteins]. Reproduktivnoye zdoroVye. Vostochnaya Yev-ropa, 2012, vol.5, pp.185-188. (in Russian)
8. Graves D., Cochran D. The contribution of interleukin-1 and tumor necrosis factor to periodontal tissue destruction. J Periodontal, 2003, vol.74, no.3, pp.391-401.
9. Hengartner N., et al. IL1p inhibits human osteoblast migration. Mol Med, 2013, vol.19, pp.36-42.
10. Huang R., Yuan Y, Tu J., et al. Opposing TNF-a/IL-1p- and BMP-2-activated MAPK signaling pathways converge on Runx2 to regulate BMP-2-induced osteoblastic differentiation. Cell Death Dis, 2014, vol.5.
11. Toyman U., Tüter G., Kurtis B., et al. Evaluation of gingival crevicular fluid levels of tissue plasminogen activator, plasminogen activator inhibitor 2, matrix metal-loproteinase-3 and interleukin 1-p in patients with different periodontal diseases. J Periodontal Res, 2014, vol.2.
12. Hernández P., et al. Oral-fluid MMP analysis in the complementary diagnosis of periodontal diseases. Rev Clin Periodoncia Implantol Rehabil Oral, 2012, vol.5, no.3, pp.150-153.
13. Marcaccini A.M., Meschiari C.A., Zuardi L.R., et al. Gingival crevicular fluid levels of MMP-8, MMP-9, TIMP-2, and MPO decrease after periodontal therapy. J Clin Periodontal, 2010, vol.37, no.2, pp.180-190.
14. Leppilahti J.M., Hernández-Ríos P.A., Gamonal J.A., et al. Matrix metalloproteinases and myeloperoxidase in gingival crevicular fluid provide site-specific diagnostic value for chronic periodontitis. J Clin Periodontal, 2014, vol.41, no.4, pp.348-356.
15. Cavalla F, Osorio C., Paredes R., et al. Matrix metalloproteinases regulate extracellular levels of SDF1/CXCL12, IL-6 and VEGF in hydrogen peroxide-stimulated human periodontal ligament fibroblasts. Cytokine, 2015, vol.73, no.1, pp.114-121. Конфликт интересов
Согласно заявлению авторов, конфликт интересов отсутствует.
Поступила 28.02.2020 Принята в печать 21.08.2020
Address for correspondence
Department of General Dentistry
Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education
28, Kedyshko street, Minsk
220114, Republic of Belarus
phone: +375 17 268-84-82
Natalia Yudina, e-mail: [email protected]
Tatyana Rudenkova, e-mail: [email protected]
- СОБЫТИЕ ПИНСКОЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛИКЛИНИКЕ - 60 ЛЕТ! Искренние поздравления и сердечные пожелания в адрес сотрудников и руководства Пинской стоматологической поликлиники задали торжественный тон конференции, организованной под эгидой Министерства здравоохранения РБ и Белорусской стоматологической ассоциации. Словами благодарности и поздравлениями открыл конференцию А.М. Матвеев, главный внештатный специалист по стоматологии Минздрава РБ, его поддержали и другие выступающие, ведущие специалисты в области стоматологии нашей страны, представители Белорусского государственного медицинского университета и Белорусской медицинской академии последипломного образования, Белорусской стоматологической ассоциации. Праздничное настроение не смогла омрачить даже такая серьезная тематика Республиканской научно-практической конференции, как онконастроженность в современной стоматологии. С докладом «Ранняя диагностика опухолей головы и шеи» выступил А.Г. Жуковец, зав. кафедрой онкологии БелМАПО, вопросы профилактики онкологических заболеваний слизистой оболочки полости рта осветила Л.А. Казеко, зав. 1-й кафедрой терапевтической стоматологии БГМУ. Особенности ведения пациентов с предопухолевыми заболеваниями и злокачественными опухолями языка представил В.Н. Андрющенков, врач-онколог Брестского областного онкологического диспансера. Тему профилактики ЗЧД на стоматологическом приеме поднял И.В. Токаревич, зав. кафедрой ортодонтии БГМУ, о роли стоматолога в сохранении здорового микробиома и профилактике заболеваний рассказала в выступлении Н.А. Юдина, зав. кафедрой общей стоматологии БелМАПО, возможности повышения эффективности профилактики зубов представила Т.Н. Терехова, профессор кафедры стоматологии детского возраста БГМУ. С докладом «Современные подходы к механической обработке корневых каналов зубов» выступила Т.Н. Манак, зав. кафедрой 2-й терапевтической стоматологии БГМУ о новых тенденциях в профилактике кариеса временных зубов у детей рассказала Н.В. Шаковец, зав. кафедрой стоматологии детского возраста БГМУ, лекцию «Стоматологическое оборудование. Современные подходы и перспективы» представил С.Н. Пархимович, декан стоматологического факультета БГМУ. Коллектив редакции журнала «Современная стоматология» присоединяется к поздравлениям и желает сотрудникам Пинской стоматологической поликлиники здоровья, прекрасного настроения и процветания! Собств. информация
