CC BY
185
^УДК 576.3/.7.086.83:58 ^
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДИК КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
IN VITRO ВИДОВ ОРХИДНЫХ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ИХ СОМАКЛОНАЛЬНОЙ
ВАРИАБЕЛЬНОСТИ
Иванников Р.В., Иванникова Н.С., Заякин В.В., Нам И.Я.
Настоящее исследование посвящено оптимизации метода выделения ДНК из ювенильных растений 4-х видов Орхидных, длительно культивируемых in vitro. Апробованої различные модификации методов выделения ДНК в классических вариантах и их комбинации, получены положительные результаты при использовании модифицированной процедуры выделения ДНК. Контроль чистоты препаратов ДНК проводили спектрофотометрическим методом.
Ключевые слова: ДНК, орхидные, культивирование in vitro, сомаклональная вариабельность
Для проведения генетического анализа выделенной из растений ДНК методом ПЦР необходима подготовка образца, которая зависит от поставленных задач. В настоящее время используются разные методики, различия между которыми заключаются в способах экстракции ДНК и ее очистки путем переосаждения с помощью различных химических агентов. Препарат ДНК из биологического образца должен иметь достаточную чистоту, чтобы быть пригодным для проведения амплификации. Хотя иногда возможно проведение генетического анализа из клеток бактерий, так как в ходе ПЦР клетки могут разрушаться, а ДНК попадает в раствор. Поэтому небольшое количество примесей не влияет на ход процесса и эффективность реакции.
Известно, что в зависимости от типа тканей растений выход ДНК сильно колеблется (0,3 - 200 нг ДНК на мг ткани) [1, с.54]. Обычно наибольший выход получается при выделении ДНК из эмбриоидов или молодых листьев, а наименьший из старых и отмирающих органов. При таком способе выделения можно получить ДНК размером 40 - 70 kbp, что вполне достаточно для проведения рестрикции и ПИР.
На первом этапе для молекулярно-генетического анализа были выбраны, размноженные in vitro растения 4 видов тропических орхидей. материалом для выделения ДНК были ткани листовых пластинок ювенильных растений, выращенных в асептической культуре. Поскольку для проведения ПЦР достаточно фрагментов ДНК длиной около 20 kbp и получения высокомолекулярной ДНК не требуется, можно использовать сравнительно простые методы получения и очистки нуклеиновых кислот. В своей работе очистки и концентрирования ДНК мы использовали метод фенол-хлороформенной экстракции [2, с.165]. Мы использовали эту процедуру с некоторыми модификациями. Этап экстракции и очистки с помощью фенол-хлороформенной смеси применяли в сочетании с разными методиками экстракции ДНК и разрушения растительной ткани.
Выделение ДНК с помощью СТАВ проводили по методике Дрейпер Дж., 1991 [1, с.54] с некоторыми изменениями.
1. Навеску растительной ткани (100 - 200 мг) растирали в ступке с порошком Al203 в качестве абразива, для обеспечения равномерности растирания и лучшей экстракции ДНК из клеточных компартментов, постепенно добавляли в ходе растирания 500 мкл CTAB-буфера (Табл. 1).
2. Гомогенат переносили в пробирки Эппендорфа и помещали их в термостат на 1 час при 65°С. Эти условия являются оптимальными для образования комплекса ДНК-СТАВ, экстракции ДНК из ткани и инактивации ДНКаз.
3. После охлаждения до комнатной температуры, чтобы избежать вскипания хлороформа, в пробирки добавляли равный объем раствора объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1) и интенсивно перемешивали на Vortex до образования равномерной эмульсии. При экстракции примеси белка переходят в слой хлороформа и интерфазу. Если на этом этапе происходит уменьшение объема водной фазы, содержащей ДНК, его доводят до исходного с помощью CTAB-буфера.
4. Для разделения эмульсии на фазы пробирки центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин.
5. Осторожно отбирали самплером одинаковые аликвоты водной фазы (по 200мкл), переносили в чистые пробирки и добавляли по 300 мкл изопропилового спирта.
6. После тщательного перемешивания центрифугировали при 14000 об/мин в течении 5 минут.
7. После центрифугирования супернатант осторожно сливали, а осадок промывали 70% этанолом для удаления остатков изопропанола и СТАВ. Осадки подсушивали на воздухе до исчезновения запаха спирта.
S. Осажденную ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной воды. Полученный препарат использовали для анализа или хранили в морозильнике.
Таблица 1
____________________________Состав CTAB-буфера для выделения ДНК______________________________
Компонент
Конечная концентрация
На 40 мл
■
Г СТАВ* 2% (вес/объем) 0,8 г В'Г*
NaCl 1,4 M 3,272 г
Tris Cl, pH 8,0 0,1 M 4 мл, 1M раствора
EDTA 20 mM 1,6 мл, 0,5 М раствора
H2O до 40 мл
*СТАВ (цетилтриметиламмоний бромид) растворяется медленно, раствор нужно готовить
заранее или нагреть его в микроволновой печи.
Выделение ДНК с помощью SDS-буфера/
1. Навеску растительной ткани (100мг) растирали в ступке с жидким азотом до состояния тонкого порошка. Затем добавляли 300 мкл SDS-буфера и снова растирали [2, с.165]. Для получения гомогенной массы добавляли еще 500 мкл SDS-буфера и тщательно перемешивали.
2. Из каждого образца отбирали аликвоты по 500 мкл и добавляли к ним по 20 мкл раствора протеиназы (10 мг/мл). Образцы помещали в термостат при 65°С на один час.
3. После завершения инкубации и охлаждения в пробирки добавляли равный объем (500мкл) фенол-хлороформенной смеси (1:1) и перемешивали до получения равномерной эмульсии. На этой стадии происходит экстракция и осаждение белков и клеточных остатков.
4. Для разделения фаз пробирки центрифугировали при 14000 об/мин в течении 5 минут.
5. Одинаковые аликвоты супернатанта (по 300 мкл) осторожно, не захватывая интерфазу, переносили в чистые пробирки и добавляли по 300 мкл смеси хлороформ-изоамиловый спирт, тщательно перемешивали и центрифугировали при 14000 об/мин в течении 5 минут.
6. Отбирали водный слой (3000мкл) в чистые пробирки и добавляли 2 объема этилового спирта и 50 мкл 3М ацетата калия, перемешивали на Vortex и выдерживали в холодильнике при +40С в течении часа.
7. Центрифугировали при 14000 об/мин в течении 5 минут.
8. Над осадочную жидкость сливали, а осадок промывали 1 мл 70% этанола для удаления остатков ацетата калия.
9. Центрифугировали при 14000 об/мин в течении 5 минут.
10. Осадок растворяли в 100 мкл деионизированной воды. Полученный препарат использовали для анализа или хранили в морозильнике.
Таблица 2
Состав SDS-буфера для выделения ДНК_______________________________
№ Компоненты Количество на 100 мл
1 SDS 1% 1 г
2 NaCl (200 mM) 1,17 г
3 Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) 4 мл (0,5M Tris-HCl)
4 Na3 EDTA 25 mM 5 мл (0,5M)
В качестве альтернативного способа очистки и выделения ДНК из раствора использовали «Силику» (диоксид кремния фирмы Sigma, США). Адсорбция ДНК осуществляется из высокосолевых растворов, а элюция — буферами с низкой ионной силой.
Спектрофотометрический анализ выделенной ДНК. Классическим методом оценки количества и качества ДНК является спектрофотометрия в УФ области. Максимум поглощения ДНК соответствует примерно 260 нм. Между оптической плотностью раствора и концентрацией ДНК существует прямая связь. Расчет концентрации ДНК проводили согласно формуле:
С [мкг/мкл] = 0Б260 х 50 х Р/1000,
где 00260 - оптическая плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм;
Б - фактор разбавления;
1000 — коэффициент для переведения концентрации в мкг/мкл;
50 - концентрация ДНК [мкг/мл] при 0Б260 = 1.
В большинстве опытов для измерения концентрации ДНК образцы разбавляли в 200 — 400 раз и использовали для определения спектров и оптической плотности кварцевые микрокюветы с длиной оптического пути 1 см. Величины оптических плотностей растворов ДНК получали путем вычитания из экспериментальных величин значений оптических плотностей для базовой линии при соответствующих длинах волн. Пример спектра поглощения образца ДНК, полученного из орхидных, показан на рис. 1.
Для контроля чистоты ДНК вычисляли отношение оптических плотностей при длинах волн 260 и 2: (00260/00280). Для чистых препаратов ДНК оно должно составлять 1,8 — 2,0. если это соотношение меньше — препарат ДНК загрязнен примесями белка, если больше 2.0 — примесью РНК.
Рис. 1 Спектр препарата ДНК Cattleyopsis lindenii (Lindl.) Cgn., полученный на сканирующем
спектрофотометре в УФ-диапазоне.
Время поддержания в асептической культуре in vitro, отобранных для изучения видов орхидных сильно различалось. Это позволит оценить влияние времени культивирования на частоту генетических изменений в культуре. Но для стандартизации условий, выделение ДНК проводили из клонов пробирочных растений, выращиваемых in vitro одинаковое время (Табл. 3)
Табл. 3.
Характеристика использованных в опыте культур Орхидных
№ Название вида Дата введения в культуру Срок пребывания in vitro на момент эксперимента, лет/месяцев. Срок введення in vitro клонированной линии на момент эксперимента, лет/мес.
1 Cattleyopsis lindenii (Lindl.) Cgn. 19.07.19SS 22 года 2 мес. 5лет 3 мес.
2 Vanilla planifolia G. Jackson. 20.06.1997 13 лет 3 мес. 5лет 3 мес.
3 Dendrobium parishii Rchb. F. 11.0S.2004 6 лет 1 мес. 5лет 3 мес.
4 Cattleya granulose Lindl. 0S.06.2001 9 лет 3 мес. 5лет 3 мес.
Внешний вид клонируемых in vitro растений Cattleyopsis lindenii (Lindl.) Cgn. и Cattleya granulose Lindl., культуры которых поддерживаются более 22 и 9 лет, соответственно, показаны на рисунке 2.
Рис. 2. Растения Cattleyopsis lindenii (Lindl.) Cgn. (слева) и Cattleya granulose Lindl. (справа) в
культуре in vitro.
По нашему мнению, длительность периода культивирования in vitro вполне достаточна для оценки изменчивости представителей семейства орхидных на первых этапах онтогенеза в условиях асептической культуры в отношении фрагментов амплифицируемых при ПИР с выбранной группой праймеров.
Клоны культивировали в одинаковых условиях в световой комнате при интенсивности света
000 лк (лампы дневного светл ЛБ - 40 и ЛД 40) с фотопериодом 12 часов, при температуре 22 -влажности 70%. Использовали наиболее употребимые для орхидных агаризованные среды на основе прописей Кнудсона (КПГУ) и Мурашиге-Скуга (М8) с минимальным содержанием регуляторов роста и физиологически активных веществ. Составы использованных сред приведены в таблице 4.
В результате исследований было установлено, что способ размельчения и гомогенизации растительного материала имеет принципиальное значение при выделении ДНК. Использование в качестве абразивного материала А1203 в сочетании со СТАВ-буфером оказалось не достаточно эффективным.
Табл. 4
№ Базовая среда Дополнительные компоненты Этап
1 КПГУ агар (8г/л) + сахароза 2% Проращивание семян
2 MS агар (8г/л) + сахароза 2%+ АУ*(0,5г/л) Формирования протокормов и проростков
3 MSa агар (8г/л) + сахароза 2%+ АУ(0,5г/л)+аденин (4мг) Мультипликация проростков
4 MS агар (8г/л) + сахароза 2%+ АУ(1г/л) Доращивание ювенильных растений
*АУ — активированный уголь
Этим методом не удавалось стабильно выделять достаточное для анализа количество ДНК изо всех образцов. Кроме того, препараты оказались загрязнены примесями РНК, что делало их непригодными для дальнейшего анализа.
Также не удалось добиться хорошего выхода и очистки ДНК с помощью её адсорбции на диоксиде кремния.
Стабильные, хорошо воспроизводимые результаты получались только при использовании жидкого азота для измельчения образцов и экстракции ДНК SDS-буфером, при условии использования протеиназы.
The work is concerned with optimization of methods of DNA extraction from juvenile plants of 4 Orchid species longtime cultivated in vitro. Different methods modifications have been evaluated and successful results have been obtained while using the modificated DNA extraction procedure. The purity of DNA samples was verified by spectrophotometric method.
The key words: DNA, Orchids, in vitro cultivation, somaclonal variability.
Список литературы
1. Дрейпер Дж. Генная инженерия растений: Лабораторное руководство. [Пер. с англ.] / Дж. Дрейпер, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена. М., 1991. 408 с.
1. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. 351 с.
Об авторах:
Нам И.Я. — доктор биологических наук, профессор Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, директор Инновационного научно-образовательного центра биотехнологии и экологии, iyanam 1@yandex.ru, тел. 8(4832) 589216
Заякин В.В. - доктор биологических наук, профессор Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского
Иванников Роман Викторович — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Национального ботанического сада им. Н.Н. Гришко НАНУ, Украина, ivannikov roman@rambler.ru
Иванникова Наталья Станиславовна — научный сотрудник Национального ботанического сада им. Н.Н. Гришко НАНУ, Украина
