CC BY
70
УДК 615.015.12: 615.252.349.7: 57.088.1
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РЕГЛИКИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ
ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ IN VITRO
А. А. Спасов1'2, А. И. Ращенко13, А. А. Бригадирова12
1Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра фармакологии, 2Волгоградский медицинский научный центр, лаб. экспериментальной фармакологии, 3НИИ фармакологии, лаб. антиоксидантных средств
В ходе исследования воспроизведена экспериментальная модель изучения регликирующей активности химических соединений in vitro. Для подтверждения релевантности методики был протестирован известный разрыватель сшивок гликированных белков алагебриум в диапазоне концентраций 7—1,25 мМ и рассчитан его показатель полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50).
Ключевые слова: гликирование, конечные продукты гликирования (КПГ), сахарный диабет, алагебриум, аминогуанидин, модель in vitro.
OPTIMIZATION OF METHOD IN VITRO FOR RE-GLYCATION ACTIVITY OF COMPOUNDS INVESTIGATION
A. A. Spasov12, A. I. Rashchenko1'3, A. A. Brigadirova12
1 Volgograd State Medical University, department of pharmacology, 2Volgograd Medical Research Centre, laboratory of experimental pharmacology, 3Research Centre of Pharmacology, laboratory of antioxidant agents
We reproduced an experimental model of studying in vitro re-glycation activity of compounds. The reliability of this method was confirmed be means of the tests employing alagebrium, a well-known advanced glycation end products (AGEs) breaker, in concentrations from 7 to 1,25 mM. The half-maximal inhibitory concentration (IC50) of this substance was calculated.
Key words: glycation, advanced glycation end products (AGEs), diabetes mellitus, alagebrium, aminoguanidine, model in vitro.
Хроническая гипергликемия является одним из наиболее характерных признаков всех типов сахарного диабета (СД) и приводит к усилению неферментативного гликозилирования белков организма и, как результат, образованию различных конечных продуктов гликирования (КПГ), в которых последовательно формируются необратимые сшивки. Гликирование служит основной причиной спонтанного нарушения структуры белков в организме, а на фоне СД гликирование усиливается за счет повышения уровня глюкозы и других сахаров в плазме крови [3]. КПГ стимулируют различные провоспалительные и сигнальные метаболические пути, а их избыточное накопление в организме рассматривается как главный фактор в патогенезе поздних осложнений СД, преимущественно диабетической ретинопатии и нефропатии, а также некоторых других заболеваний [1].
Так, в настоящее время выделяют несколько подходов к контролю продукции и разрушению КПГ. К первому относится предупреждение процесса гликирования белков и формирования в них поперечных сшивок, что приводит к замедлению прогрессирования диабетических осложнений. Так, к соединениям со свойством подавлять образование КПГ относится аминогуанидин, для которого, тем не менее, клинические испытания были прекращены главным образом из-за его способ-
ности ингибировать NO-синтазу и прооксидантной активности [2].
Другой подход основан на разрушении поперечных сшивок гликированных белков. В качестве соединений с таким механизмом действия предлагались бромид N-фенацилтиазолия и алагебриум, которые успешно прошли этап доклинических исследований, но по различным причинам их клинические испытания были прекращены [4, 6].
Таким образом, в настоящее время активно уделяется внимание поиску и разработке новых химических соединений, способных ингибировать образование КПГ или разрушать поперечные сшивки гликированных белков с целью создания лекарственных препаратов для профилактики развития поздних осложнений СД.
Существует различные как in vitro, так и in vivo методики для оценки способности соединений разрывать сшивки гликированных белков [4, 5]. Для начального этапа скрининга новых соединений одной из доступных моделей является исследование регликирова-ния гликированного бычьего сывороточного альбумина (БСА) in vitro. Для регистрации продуктов в реакционной смеси используют метод определения специфической флуоресценции гликированного БСА при Xex = 370 нм и Xem = 440 нм [5].
I^mpfö ©©СаГГГМЩ
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Так, в настоящем исследовании представляется целесообразным настроить экспериментальную модель и оптимизировать условия выполнения метода [5] для изучения регликирующей активности химических соединений in vitro.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Способность соединений регликировать гликиро-ванный БСА in vitro изучали по модифицированному методу [5]. Реакцию гликирования моделировали в реакционной смеси, содержащей 400 мМ глюкозы («Агат-Мед», Россия) и 0,8 мг/мл БСА («BioWest», France), растворенных в 50 мМ фосфатном буферном растворе (рН 7,4). Для предупреждения бактериального роста в буферный раствор вносили азид натрия («Sigma», США) в конечной концентрации 0,02%-й. Смесь инкубировали при 60 °С в течение 40 часов. После окончания инкубации в пробирки типа эппендорф добавляли по 200 мкл смеси (БСА + глюкоза) с прибавлением 20 мкл 100%-й трихлоруксусной кислоты (ТХУ) («Fisher Scientific», США). После центрифугирования при 15000 об./мин в течение 4 мин при 37 °С в осажденный гликированный БСА добавляли до 300 мкл 50 мМ фосфатного буферного раствора (рН 7,4) и 30 мкл изучаемого вещества — реакционный объем 330 мкл — и инкубировали при 60 °С в течение 40 часов. Кроме того, было приготовлено аналогичное количество проб с не-гликированным неосажденным раствором БСА в количестве 300 мкл на каждую пробу, в которое также добавляли исследуемое вещество, и подвергали инкубации. Все вещества растворяли в диметилсуль-фоксиде (ДМСО) («Fisher Scientific», США). В исследуемые образцы добавляли изучаемые вещества в необходимых конечных концентрациях, в контрольные образцы добавляли соответствующий объем растворителя. После окончания инкубации в пробирки добавляли 33 мкл 100 % ТХУ, затем центрифугировали при 15000 об./мин в течение 4 мин при 37 °С. Осажденные гликированный БСА и негликированный БСА растворяли в 1 мл фосфатного солевого буфера (рН 10,0) и определяли специфическую флуоресценцию пробных образцов на микропланшетном ридере («InfiniteM200», «Tecan», Австрия) при Xex = 370 нм и Xem = 440 нм. Способность исследуемых соединений регликировать гликированный альбумин рассчитывали по формуле (1):
Ac (%) = ((Fc-Fb) - (Fs-Fsb) / (Fc-Fb))*10 (1)
где Fc — флуоресценция инкубированного БСА, глюкозы и ДМСО (контроль); Fb — флуоресценция инкубированного БСА (негликированного); Fs—флуоресценция инкубированных БСА, глюкозы и исследуемого вещества; Fsb — флуоресценция инкубированного БСА (негликированного) и исследуемого вещества.
Для оценки адекватности воспроизведения метода был протестирован алагебриум (Kailu Xingli
Pharmaceutical Co., Ltd., China), раствор которого добавляли в экспериментальные образцы в концентрациях 7 мМ, 4,5 мМ, 3,5 мМ, 2,5 мМ и 1,25 мМ. Также на данной модели протестировали аминогуа-нидин («Sigma», США), известный ингибитор образования КПГ, в эквимолярных концентрациях от 7 до 1,25 мМ.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с применением непараметрического критерия Манна-Уитни, анализа зависимости «доза-эффект» методом линейной регрессии и расчета полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) в программе GraphPad Prism 6.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Формирование гликированного БСА в реакционной смеси подтверждается наличием характерного пика флуоресценции контрольных образцов при Xex = 370 нм и Xem = 440 нм.
В ходе проведенных исследований была подтверждена способность алагебриума, имеющая до-зозависимый характер, регликировать БСА, полученный в результате описанной реакции. Показано, что активность алагебриума на данной модели в концентрациях 7 мМ, 4,5 мМ, 3,5 мМ, 2,5 мМ, 1,25 мМ составляет 52,4 %, 43,2 %, 30,9 %, 19,5 % и 17,9 %, соответственно (табл.).
На основании полученных данных также был рассчитан параметр IC50 алагебриума, который составил 6,35 мМ (рис.), что соответствует ранее опубликованным данным об активности данного соединения [4]. При этом оптимальной для сравнения эффектов изучаемых веществ между собой в скрининговых исследованиях оказалась концентрация 5 мМ.
и.
о
% 4001
я
| 20%
>о
Я
х 0-1-1-1-1-1
® 0 2 4 6 8
Алагебриум, мМ
Рис. Регликирующая активность алагебриума in vitro.
Значение IC50
В то же время при тестировании известного ингибитора гликирования белков аминогуанидина на данной модели в эквимолярных концентрациях с ала-гебриумом у него не было обнаружено характерных для алагебриума регликирующих свойств (табл.).
Регликирующая активность алагебриума и аминогуанидина in vitro в широком диапазоне концентраций 7—1,25 мМ
Вещество Регликирующая активность, А % (M ± m) IC50
7 мМ 4,5 мМ 3,5 мМ 2,5 мМ 1,25 мМ
Алагебриум 52,35 ± 2,62* 43,23 ± 2,89* 30,88 ± 2,62* 19,46 ± 0,33* 17,87 ± 0,47* 6,35 мМ
Аминогуанидин 2,81 ± 0,28 2,76 ± 0,20 2,03 ± 0,78 1,89 ± 0,55 1,55 ± 0,25 -
*Статистически значимо по отношению к контролю, тест Манна-Уитни (p < 0,05).
Разработанная методика была валидирована по показателям воспроизводимости и точности.
Воспроизводимость метода. Контроль воспроизводимости методики проводили путем многократного тестирования препарата сравнения алагебриума. В разные дни проводили по 3—5 измерений одной и той же субмаксимальной концентрации препарата (5 мМ). Полученные результаты были близкими (коэффициент вариации ± 1,05 %).
Точность метода. Внутрилабораторный разброс данных вреднее ± 3SD) для субмаксимальной концентрации алагебриума, протестированной в разные дни, составил 46,02 % ± 3*0,48 % = 44,58 — 47,46. В результате 95,33 % измеренных величин находятся в пределах среднего ± 3SD.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, в результате проведенного исследования была настроена методика для изучения реглики-рующей активности соединений in vitro и доказана ее релевантность. Определена оптимальная доза для тестирования соединений с предполагаемой регликиру-ющей активностью, которая составила 5 мМ. На данной модели было подтверждено отсутствие реглики-рующих свойств у ингибитора образования КПГ аминогуанидина.
Данная воспроизведенная модель является адекватной и в дальнейшем может служить для оценки рег-ликирующей активности соединений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Балаболкин М. И. /'/Сахарный диабет. — 2002. — Т. 5 (4). — С. 8—16.
2. Ленская К. В., Спасов А. А., Чепляева Н. И. // Вестник ВолгГМУ. — 2011. — Т. 40 (4). — С. 10—18.
3. Ahmed N., Thornalley P. J. // Русский медицинский журнал. — 2009. — Т. 17 (9). — С. 642—650.
4. Kim J., Kim C.-S., Moon M. K., Kim J. S. // Eur. J. Pharmacol. — 2015. — Feb. — Vol. 748. — P. 108—114.
5. Ratnasooriya W. D., Abeysekera W. K. S. M., Muthunayake T. B. S., Ratnasooriya C. D. T. // Trop. J. Pharm. Res. — 2014. — Vol. 13 (4). — P. 567—571.
6. Richardson M. A., Furlani R. E., Podell B. K., et al. // Tetrahedron Letters. — 2015. — Vol. 56 (23). — P. 3406—3409.
Контактная информация
Бригадирова Анастасия Андреевна — ассистент каф. фармакологии ВолгГМУ, м. н. с. лаб. экспериментальной фармакологии ГБУ ВМНЦ, e-mail: [email protected]
