Оптимизация этапов пробоподготовки для метагеномного секвенирования образцов, отобранных в Государственной Третьяковской галереи с произведений темперной живописи XVI-го века Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

BIOLOGICAL SCIENCES

Жгун А.А.

ФИЦ Биотехнологии РАН, институт Биоинженерии, г. Москва

Потапов М.П.

Московский Политехнический Университет, г. Москва

Авданина Д.А.

ФИЦ Биотехнологии РАН, институт Биоинженерии, г. Москва

DOI: 10.24411/2520-6990-2019-10570 ОПТИМИЗАЦИЯ ЭТАПОВ ПРОБОПОДГОТОВКИ ДЛЯ МЕТАГЕНОМНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ ОБРАЗЦОВ, ОТОБРАННЫХ В ГОСУДАРСТВЕННОЙ ТРЕТЬЯКОВСКОЙ ГАЛЕРЕИ С ПРОИЗВЕДЕНИЙ ТЕМПЕРНОЙ ЖИВОПИСИ XVI-ГО ВЕКА

Zhgun A.A.

Research Center of Biotechnology RAS, Moscow, Russia

Potapov M.P

Moscow Polytechnic University, Moscow, Russia

Avdanina D.A.

Research Center of Biotechnology RAS, Moscow, Russia

OPTIMIZATION OF PREPARATION STAGES FOR METAGENOMIC SEQUENCING OF SAMPLES TAKEN FROM XVI-TH CENTURY TEMPERA PAINTING IN STATE TRETYAKOV GALLERY

Аннотация

В данной статье провели оптимизацию подготовки образцов для метагеномного секвенирования из проб, отобранных ранее с экспонатов и внутренних коммуникаций залов Живописи Древней Руси основного исторического здания Государственной Третьяковской галереи (Лаврушинский пер., 10, Москва). В качестве экспонатов служили произведения темперной живописи XVI-го века. Также для метагеномного секвенирования подготовили препараты соответствующих культур микроорганизмов, созданных ранее в результате высева аликвот отобранных проб на микробиологические среды. Провели оптимизацию условий выделения метагеномной ДНК, ПЦР амплификации (температуры отжига, количества циклов, количества ДНК-матрицы) и очистки ПЦР фрагментов. Подобранные условия позволили наработать фрагменты метагеномной ДНК, содержащие последовательности рДНК прокариот или эукариот (с навесками для последующего баркодирования с использованием Nextera XT Index kit ("Illumina, Inc", США), для всех выбранных с целью исследования проб, в том числе, для образцов с предельно малым изначальным количеством биологического материала.

Abstract

In this article we optimized the approach of sample preparation for metagenomic sequencing from probes, previously obtained from the exhibits and internal communications in Paintings of Ancient Rus Halls № 56, 57 and 61 in the main historical building of State Tretyakov Gallery (Lavrushinsky per. 10, Moscow, Russia). All exhibits represent works of tempera painting dated around 16th century. Also, for metagenomic sequencing samples from corresponding cultured isolates (obtained after inoculation of aliquots from initial probes on microbiological media) were prepared. We optimized the conditions for the isolation of metagenomic DNA, PCR amplification (annealing temperature, number of cycles, amount of DNA template) and purification of PCR fragments. The selected conditions allowed amplifying metagenomic DNA fragments from prokaryotic or eukaryotic rDNA (with incorporated linkers for subsequent barcoding using the Nextera XT Index kit, Illumina, Inc, USA) for all selected for the study samples, including probes with extremely small initial amount of biological material.

Ключевые слова: темперная живопись, биоповреждение, NGS, икона «Церковь Воинствующая» Keywords: tempera painting, biodeterioration, NGS, icon "The Church Militant"

Введение

Метагеномный анализ - мощный современный инструмент, позволяющий эффективно и быстро определить видовое разнообразие исследуемого образца [1]. При этом не требуется получения культур микроорганизмов; метод высокочувствителен, позволяет идентифицировать следовые количества биологических объектов. Важнейшее преимущество метагеномного подхода связано с возможностью идентификации не только культивируемых

микроорганизмов, но и некультивируемых. Критической стадией, от которой зависит сама возможность проведения метагеномного секвенирования, является пробоподготовка. Она включает ряд этапов, от забора образцов до выделения метагеном-ной ДНК (мДНК). На следующем этапе технологии N08 позволяют проводить как полногеномное се-квенирование, так и секвенирование отдельных филогенетически-значимых районов ДНК. Важнейшими характеристическими районами в этой связи

являются участки рДНК как прокариот, так и эука-риот. Сочетание консервативных зон для отжига праймеров с гипервариабельными районами, позволяющими проводить генотипирование, повышенная доза генов рДНК в геномах организмов, а также, стремительный рост данных в GenBank о последовательностях фрагментов рДНК для различных видов позволяет использовать эти последовательности в ситуациях, когда количество исходной мДНК критически мало [2].

Для генотипирования бактерий используют разнообразие группы праймеров, амплифицирую-щие последовательности, кодирующие вариабельные районы 16 S РНК. Одной из широко используемых пар праймеров является 34№ (У3) и 806R ^4), продукт амплификации которой «поднимает» гипервариабельные районы прокариотической 16S РНК, соответствующие петлям V3 и V4 [3,4]. Для проведения генотипирования эукариот используют различные зоны рДНК. Одной из наиболее часто используемых пар праймеров для определения видовой принадлежности грибов является ITS1/ ITS4 [5,6]. Это связано с тем, что амплифицируемый фрагмент, наряду с консервативным центральным районом, соответствующим 5^ рРНК, содержит оба внутренних нетранскрибируемых спейсера (ITS1 и ITS2), которые характеризуются значительной вариабельностью. При этом зона отжига праймеров ITS1 и ITS4 приходится на консервативные последовательности рДНК, кодирующие 18S и 28S рРНК соответственно [7]. В результате у получаемых для таксономии ПЦР транскриптов из грибов последовательность ДНК варьирует не только по составу, но и по длине, от 564 до 789 п.о. [6,8].

Метагеномное исследование образцов, полученных с объектов культурного наследия (к которым, в частности, относятся изучаемые произведения темперной живописи XVI-го века), часто затруднено в связи с крайне малым количеством исходного материала. В тех случаях, когда забор материала разрешен только путем легкого поверхностного соприкосновения произведения искусства с сухим забирающим агентом (например, стерильным ватным тампоном), количество материала будет крайне ограничено [2]. Одним их подходов для изучения полученных таким образом образцов служит их предварительное культивирование на микробиологических средах. Однако известно, что при этом значительно теряется видовое разнообразие, связанное с потерей некультивируемых микроорганизмов [9]. Кроме того, в смешанной культуре изменяется процентный видовой состав имеющихся видов по сравнению с исходной пробой [9]. Это обусловлено различной эффективностью роста микроорганизмов на различных микробиологических средах. В связи с этим возникает задача извлечения мДНК даже из недостаточных (для стандартных протоколов выделения) количеств. Задача осложняется тем, что важнейшими агентами биодеструкции темперной живописи являются мицели-альные грибы, имеющие хитин-содержащую клеточную стенку, крайне устойчивую к разрушению. Поэтому на первом этапе необходимо эффективно

разрушить биологический материал, затем из него очистить мДНК. Все современные методы очистки нуклеиновых кислот (НК) можно разделить на две группы: 1) поэтапное удаление примесей из водного раствора НК или 2) методы, основанные на сорбции НК на твердофазном носителе, с последующей промывкой от примесей и воной элюцией НК [1]. Наконец, мДНК, полученную из следового (невидимого глазом) количества исходного материала, необходимо амплифицировать для проведения ме-тагеномного секвенирования. Последний этап может быть затруднен в связи с недостаточным стартовым количеством матрицы или ее недостаточной чистотой, связанной с минимизацией этапов очистки для уменьшения потерь мДНК.

Ранее мы отобрали 106 микробиологических проб в залах Живописи Древней Руси (56, 57 и 61) основного исторического здания Государственной Третьяковской галереи (ГТГ, Лаврушинский пер., 10, Москва) [10]. Все пробы были отобраны с разрешения главного хранителя музейных ценностей ГТГ. Отбор проб сделали, в том числе, с произведений темперной живописи 16-го века: иконы «Церковь Воинствующая» (ЦВ), бюста Георгия Победоносца (ГП) и иконы «Св. Великомученика Димитрия Солунского» (ДС). Аликвоты исходных образцов использовали также для инокуляции на микробиологические среды с целью получения культур изолятов [10,11]. На следующем этапе продемонстрировали способность к эффективному росту полученных культивируемых изолятов на отдельных лакокрасочных материалах, используемых в темперной живописи [10]. Структурные изменения этих материалов в модельных условиях заражения и микробиологический рост проанализировали также при помощи ИК-Фурье спектроскопии [10]. Доминантные грибные представители охарактеризовали предварительно с помощью световой микроскопии, затем провели генотипирование после секвенирования по Сенгеру [11].

Важной задачей для дальнейшего исследования микробиологического сообщества, способного поражать произведения темперной живописи, является характеристика его метагеномного состава. С этой целью в данной работе подготовлены препараты ПЦР-фрагментов, полученные в результате амплификации мДНК, выделенной как из исходных образцов, так и из их культивируемых аналогов.

Материалы и методы

Отбор проб и культивирование микроорганизмов. Пробы отбирали, как описано ранее [10]. Затем 1/10 часть пробы использовали для дальнейшего культивирования на твердых питательных средах (ТПС), остальную часть пробы использовали для выделения мДНК. Высев проводили на среды: Чапека-Докса, CD (Czapek Dox, сахароза 30 г/л, NaNO3 2 г/л, K2HPO4 1 г/л, MgSO4 x 7H 2O 0,5 г/л, KCl 0,5 г/л, FeSO 4 7H 2O 0,01 г/л, агар - 20 г/л, рН 7,0 - 7,4) и LB (Lysogeny Broth, бактотриптон 10 г/л, бактодрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л, агар 20 г/л), культивировали 4 - 15 дней при 25оС и хранили при 4оС.

Выделение геномной ДНК. Для выделения мДНК исходные пробы, отобранные в ГТГ, лиофи-лизировали. Биоматериал, полученный при культивировании исходных проб на средах CD или LB, собирали со скошенного агара бактериологической петлей, ресуспендировали в 200 мкл Н2О (в количестве OD600 = 1 - 2), лиофилизировали. Лиофильно-высушенные образцы ресуспендировали в 200 мкл TES буфера (1% SDS, 1мМ ЭДТА, 100 мМ Tris-HCl, pH 8,5). Смесь интенсивно встряхивали на Vortex 3 мин, инкубировали 65оС 1 ч, периодически встряхивая на Vortex 1 мин. Охлаждали до комнатной температуры, добавляли 200 мкл фенола (насыщенного 0.2 M Tris-HCl, рН 8,5) и 0.5 объема стеклянных шариков (D = 500 мкм), встряхивали на Vortex 3 мин, центрифугировали 5 мин при 13400 об/мин на аппарате MiniSpin («Эппендорф», Германия). Затем отбирали верхнюю водную фракцию, промывали равным объемом смеси хлороформ/изоамило-вый спирт (24:1), встряхивали 1 мин, инкубировали 5 мин при комнатной температуре, повторно встряхивали 1 мин, ц/ф 5 мин при 13400 об/мин, отбирали верхнюю водную фракцию, добавляли 1/10 объема 3М ацетата калия (рН = 5.2) и 3 объёма 96% охлажденного этилового спирта. Инкубировали 20 мин, -20оС, ц/ф 13400 об/мин, осадок промывали охлажденным 70% этиловым спиртом, высушивали, ресуспендировали в 20 мкл Н2О. Полученные р-ры, содержащие геномные ДНК микроорганизмов, хранили при -20оС.

Проведение ПЦР. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе Mastercycler gradient («Эппендорф», Германия) с помощью наборов KAPA HiFi HotStart ReadyMixPCR Kit

(«Рош», Швейцария) или ScreenMix («Евроген», Россия). В качестве матрицы использовали полученные препараты мДНК, выделенные из микроорганизмов ранее собранных проб из ГТГ или после их культивирования на средах CD или LB [10]. Амплификацию региона V3/V4 прокариот проводили с парой праймеров 341F_BC/ R806_BC; амплификации участка ITS2 эукариотической рДНК проводили с парой праймеров ITS86F_BC/ ITS4_BC. Для определения оптимальной температуры отжига использовали режим градиентного ПЦР с параметрами: tube - 0.2 ml, T = 66.0o, G = 6.0o (для набора KAPA HiFi HotStart ReadyMixPCR Kit) или tube -

0.2 ml, T = 56.0o, G = 7.0o (для набора ScreenMix). Калибровку температуры отжига проводили на мДНК, выделенной из исходных образцов, STG-S52B или STG-S103. Отдельно подбирали оптимальные температуры отжига для пар праймеров, амплифицирующих фрагменты рДНК с регионов V3/V4 или ITS2. Оптимизированные условия ПЦР для набора KAPA HiFi HotStart ReadyMixPCR Kit: «хот-старт» - 98°С, 3 мин; 25 - 35 циклов реакций амплификации: отжиг - 60°С для пары 341F_BC/ R806_BC или 61°С для пары ITS86F_BC/ ITS4_BC, 30сек; элонгация - 72°С, 40 сек; денатурация -98°С, 30 сек. Оптимизированные условия ПЦР для ScreenMix: «хот-старт» - 95°С, 3 мин; 25 - 35 циклов реакций амплификации: отжиг - 54°С для пары 341F_BC/ R806_BC или 55°С для пары ITS86F_BC/ ITS4_BC, 30сек; элонгация - 72°С, 40 сек; денатурация - 95°С, 30 сек. Последовательности прайме-ров, использованных в работе приведены в таблице

1.

Таблица 1

ПРАИМЕРЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ

олигонук-леотид последовательность (5'^3') Длина, пн ис- точ- ник

341F BC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG 50 [3]

R806 BC GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC 55 [4]

ITS86F BC TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTGAATCATCGAATCTTTGAA 54 [12]

ITS4 BC GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTCCTCCGCTTATTGATATGC 54

Очистка ПЦР-фрагментов из реакционной смеси. Экстракцию амплифицированных фрагментов после проведения ПЦР проводили с использованием набора CleanupMini («Евроген», Россия) методом элюции из геля (после вырезания скальпелем агарозного фрагмента искомой длины) в соответствии с рекомендациями фирмы производителя. Результаты и обсуждение В нашей работе оптимизировали этапы подготовки образцов для метагеномного секвенирова-ния, отобранных ранее с произведений темперной живописи 16-го века, а также, с различных внутренних коммуникаций залов Живописи Древней Руси Государственной Третьяковской галереи [10].

Индексирование проб. В работе изучили исходные образцы, для которых удалось получить, по крайней мере, один тип культур (на среде CD или LB). Полный перечень исходных образцов и полученных на их основе смешанных культур микроорганизмов приведен в таблицах 2, 3. Исходные пробы получили индекс в формате STG-SN, где STG - название места отбора проб (State Tretyakov Galery), S - обозначение, что это исходная проба

(sample), N - номер отобранной пробы, от 1 до 109 (с пропуском для 39 - 41 проб, не относящихся к данной работе). Таким образом, индексировали 106 исходных проб. Номера культивируемых изолятов соответствовали номерам исходных проб, из которых их получили, и имели индексацию STG-N (для культивируемых изолятов на среде CD) или STG-LN (для культивируемых изолятов на среде LB). Для 58 отобранных образцов удалось получить рост микроорганизмов после высева аликвоты на среду CD (для 48 проб роста не было).

При культивировании некоторых проб на среде CD произошло «расщепление» на колонии разных морфологических типов с характерными доминантными грибными представителями (по данным световой микроскопии секвенирования по Сенгеру). Колонии разных типов изолировали и в дальнейшем культивировали по-отдельности. В результате, пробам STG-S23, STG-S25, STG-S52 и STG-S93 соответствуют пары культивируемых на среде CD изолятов: STG-23B и STG-23W, STG-25G и STG-25W, STG-52G и STG-52B, STG-93W и STG-93B. В результате, в коллекции культивируемых на

среде CD смешанных культур имеется 62 образца (соответствуют 58 исходным пробам, 4 из которых дали начало двум «расщепившимся» культурам).

На среде LB удалось получить микробиологический рост для 57 (из 106) инокулятов. Для 38 исходных проб удалось получить рост на обеих изучаемых средах, причем, для 3-х образцов (STG-S23,

STG-S25 и STG-S52) получили по три культивируемых аналога (два на CD и один на LB). Для 20-ти проб удалось получить культуру только на среде CD (всего 21 такой образец, поскольку STG-S93 дал начало двум культурам); еще для 19-ти проб получили культуры, выросшие только на среде LB.

Таблица 2

Пробы, полученные с иконы «Церковь Воинствующая» и бюста Георгия Победоносца

№ Объект Рост на среде № Объект Рост на среде

CD LB CD LB

STG-SI цв - - ■■■ ЦВ 8 +

STG-S2 ЦВ - + Ш^Ш ЦВ 1 +

STG-S3 цв 1 ЦВ _ S

ETG-Я ЦВокр 1 + STG-S30 ЦВ 1 +

STG-S5 ЦВ - - STG-S31 ЦВокр + +

STG-S6 ЦВ - - ш^т ЦВокр 1 +

STG-S7 ЦВ - - шт ЦВокр - 1

STG-S8 ЦВ - - STG-S34 ЦВокр - +

STG-S9 ЦВ - + STG-S35 ЦВокр + +

STG-S10 ЦВ - + ИМ ЦВокр 1 +

STG-S11 ЦВ - + STG-S37 ЦВокр - +

STG-S12 ЦВ - - STG-S38 ЦВокр + +

тш ЦВ 1 + STG-S42 гп - +

STG-S14 ЦВ„Кр - - STG-S43 гп - +

STG-S15 ЦВ - - ГП - 1

STG-S16 ЦВ + + STG-S45 ГП - -

STG-S17 ЦВ - - STG-S46 гп - -

STG-S18 ЦВокр + + шш гп 1 +

STG-S19 ЦВокр - - т&щ гп 1 +

STG-S20 ЦВ - - шш гп - 1

(ШШ1 ЦВ 1 - STG-S50 гп - -

STG-S22 ЦВ0К|, - + STG-S51 ГГ1 - -

нв ЦВокр II + гп ftl* +

STG-S24 ЦВокр + + STG-S53 гп - -

шшшш ЦВ 11 + STG-S54 гп - -

mm ЦВ 1 + STG-S55 гп - +

Примечания: знаками «+» или «-» отмечен рост или отсутствие роста на микробиологических средах соответственно; в боксах залиты образцы, выбранные для метагеномного анализа; звездочками отмечены культивируемые изоляты, использованные для инокуляции ЛКМ.

Выбор проб для метагеномного секвениро-вания. На первом этапе в нашем распоряжении имелось 225 образцов (106 исходных проб, 62 CD-культуры и 57 LB-культуры). Для оптимизации работы по метагеномному секвенированию выбрали 41 исходную пробу и 45 культивируемых изолятов

(39 - на среде CD и 5 - на среде LB). При этом руководствовались основаниями, подробно рассмотренными ниже.

1) Рост высеянной аликвоты исходного образца также свидетельствовал о наличие в нем жиз-

неспособного и достаточного количества микроорганизмов для развития на средах СБ и/ или ЬВ. Это могло коррелировать с увеличением вероятности эффективного выделения и амплификации мДНК для таких образцов. Кроме того, само наличие культивируемого аналога давало возможность для сравнения исходного и культивируемого микробиомов. Исходя из этого, все отобранные образцы для работы по метагеномному секвенированию - парные; 41-ой исходной пробе соответствует 45 культур (37-ми исходным пробам соответствует одна культура, а 4 - представлены двумя культурами).

Таблица 3

Пробы, полученные с иконы «Св. Великомученик Димитрий Солунский» и из залов 56,67,61 ГТГ

2) Выбранные пробы должны равномерно представлять изучаемые экспонаты темперной живописи и окружение в залах ГТГ.

3) Внутри изучаемых объектов пробы также должны размещаться как можно равномернее.

4) Выбранные для анализа проба должны иметь биологический интерес, в частности представлять все разнообразие охарактеризованных нами ранее мицелиальных грибов, методами световой микроскопии и секвенированием по Сенгеру.

Объект

Рост на среде

Объект

Рост на среде

СР

1.В

ХТО-Х56 ДС ЯТС-ЯвЗ Зал 61 + +

ПН ДС 1* Зал 61 |

ШШ Дс | + м. Зал 61 I +

ХТО-859 ДС - + Зал 61 |* +

ДС | + ШЯ ДС I 8ТС-Х87 Зал 61 + + 8ТГ;-Х88 Зал 61 + +

ЯТС-862 ДС - + 8ТС-Я89 Зал 61 +

ДС 1 ХТС-ХОО Зал 61 - +

ДСокр Зал 61 | +

ДС окр 1 ЯСЛИ Зал 61 I

ЯТСт-Ябб ДС Зал 61 |

■Н ДС 1 8ТС-Я94 Зал 61 +

8ТС-Х68 ДС" 8ТС-Я95 Зал 61 + +

ИШ ДС | Зал 61 +

8ТС-870 {ил 61 + + УШ-ЯР1 Зал 61 I +

8ТСт-Я71 Зал 61 + М'( Зал 61 | +

8ТС-Я72 Чат 61 + + Лто-ам! зал 61 |

ЯТС-873 Зал 61 + + ЯТС-ЯЮО Зал 61

ВТС-874 Зал 61 | + 8ТС;-Х101 Зал 56

ЯТСт-875 Зал 61 + вТС-вШ Зал 56

ХТС-Х76 Зал 61 + ЙбЩ Зал 56 I*

8ТС-877 Зал 61 + вТС-вКМ Зал 56

ХТС-Х78 Зал 61 + ХТ(;-Х105 Зал 57

8ТС-Э79 Зал 61 + ВИН Зал 57 I*

ЩЩ Зал 61 I + ХТО-М(17 Зал 57

Зал 61 + ХТ(;-Х1«8 Зал 57

ЯТСт-Явг Зал 61 + 8ТС-8109 Зал 57

Примечания: знаками «+» или «-» отмечен рост или отсутствие роста на микробиологических средах соответственно; в боксах залиты образцы, выбранные для метагеномного анализа; звездочками отмечены культивируемые изоляты, использованные для инокуляции ЛКМ).

5) Поскольку 10 культивируемых изолятов STG93W, 8Т093В, 8Т096, 8Т0103 и 8Т0106) ис-(8Т0-250, 8Т0-36, 8Т0-52В, 8Т057, 8Т086, пользовали в работах по изучению биоповрежде-

ния темперных материалов [10,11], было важно понять, насколько их состав близок к микробиологическому сообществу в исходной пробе. Эти изо-ляты и соответствующие им исходные пробы также взяли для анализа. На Рис. 1, 2 представлены культивируемые изоляты на среде CD (25оС, 26 сут), используемые в экспериментах для инокуляции лакокрасочных поверхностей. С обратной стороны видны характерные пигментные окраски (представляющие смеси низкомолекулярных соединений), выделяемые в агаризованную среду через 12-20 сут инкубации (Рис. 1). Как известно, пигменты, выделяемые паразитирующими на произведениях искусства микроорганизмами, являются одним из важнейших наносящих ущерб факторов.

6) В предыдущей работе в результате секвени-рования по Сенгеру для 15 образцов получили дан-

71.

ные об регионах [11]. Как правило, се-

квенирование по Сенгеру позволяет получить более длинное прочтение для отдельно взятого образца, чем NGS. В связи с этим предыдущие данные интересны для сравнения. Пробы, предварительно охарактеризованные в секвенировании по Сенгеру, также взяты для анализа.

7) Наконец, последним критерием для выбора проб на метагеномное секвенирование служил тип микробиологических сред, на которых удалось получить смешанную культуру микроорганизмов. Если проба вырастала на обеих средах, для дальнейшего изучения брали материал со среды CD как наиболее подходящей для культивирования мице-лиальных грибов, интересующих нас с точки зрения возможности биодеструкции материалов, используемых в темперной живописи.

W V* •1

25G

б*

? f

1 I

86 93В |

I

36

103

Рисунок 1. Культивирование изолятов, задняя сторона. Агаризованная среда СП, 25оС, 26 сут. А - скошенный агар, В - чашки Петри, после инокуляции со скошенного агара. Культивируемые изоляты, слева направо: 8Т0-250, 8ТО-52Б, 8ГО-57, БГО-Яб, 8ГО-86, 8ГО-93Ь, 8ГО-36, 8ТО-1д3, STG-93W, 8ГО-106.

Для последующего изучения отобрали 25 образцов, где с исходных проб получили оба типа изолятов (на средах CD и LB); во всех 25 случаях выбор сделали в пользу CD культур (всего 28 образцов: 22 «нерасщепивщиеся» и 3 «расщепившиеся»). Также выбрали 11 проб, давшие только CD культуры (всего 12 образцов: 10 «нерасщепившихся» и

1 «расщепившийся»). В тех случаях, когда важная с точки зрения остальных критериев проба имела рост только на среде LB, брали ее. Отобрали 5 таких проб. Исходные пробы, для которых не удалось получить культивируемых аналогов, в данной работе не изучали.

Рисунок 2. Культивирование изолятов, передняя сторона. Агаризованная среда СБ, 25оС, 26 сут. А -скошенный агар, В - чашки Петри, после инокуляции со скошенного агара. Культивируемые изоляты, слева направо: STG-25G, STG-52Б, STG-57, STG-96, STG-86, STG-93b, STG-36, STG-103, STG-93W, STG-

106.

Оптимизация этапов для получения ПЦР фрагментов из мДНК. Итоговый протокол включает предварительную лиофильную сушку образцов. Затем разрушение клеток микроорганизмов и очистка мДНК проходит в результате инкубации при 65°С в TES буфере (1% SDS, 1мМ ЭДТА, 100 мМ Tris-HCl, pH 8,5) с последующей фенольной экстракцией с добавлением стеклянных шариков (D = 500 мкм) и однократной очисткой смесью хлороформ/ изоамиловый спирт (24:1). Необходимо отметить, что данный метод представляет собой компромисс между чистотой ДНК (от низкомолекулярных примесей) и ее потерями. Сорбция с использованием силикатных сорбентов, эффективно связывающих НК в растворе с высокой ионной силой, с последующей отмывкой от белков и низкомолекулярных соединений и элюцией раствором с низкой ионной силой может приводить к значительным потерям и без того малого количества мДНК. Минимизация этапов очистки при феноль-ной экстракции в сочетании с предварительной лиофилизацией образцов позволила нам амплифи-цировать рДНК со всех отобранных проб.

Предварительная лиофилизация материала. Все образцы предварительно лиофилизировали. Это требовалось для эффективной последующей экстракции мДНК из грибов. На предварительном этапе провели эксперименты по выделению мДНК различными методами (кипячение, экстракция в TES буфере без последующей обработки фенолом, фенольная экстракция без предварительной лио-фильной сушки). В большинстве случаев удавалось амплифицировать V3/V4 фрагмент, но не фрагмент рДНК грибов (содержащий ITS1 и ITS2 или только ITS2). Только совмещение стадий предварительной

лиофильной сушки и последующей фенольной экстракции по приведенному протоколу позволил эффективно нарабатывать оба желаемых ПЦР-фрагмента.

Влияние следов фенола на ПЦР. В результате очистки нуклеиновых кислот методом фенольной экстракции одним из факторов, затрудняющих последующие генно-инженерные манипуляции, могут являться примеси самого фенола, взаимодействующие с ферментами и ингибирующие различные реакции, в том числе, ПЦР. Во многих протоколах фенольная экстракция происходит смесью фенол/ хлороформ (1:1) с последующей двукратной отмывкой от фенола смесью хлороформ/ изоамиловый спирт (24:1). Поскольку каждый этап очистки неизбежно связан с потерями исходного материала, мы решили сократить отмывку образца от фенола до 1-го раза. Однако тот факт, что в наших экспериментах после применяемого протокола очистки эффективно нарабатывались ПЦР-продукты нужной длины, свидетельствует о возможности такого подхода к получению мДНК для NGS.

Время и температура инкубации образцов с фенолом. В предыдущих экспериментах оптимизировали условия инкубации микробиологического образца в растворе с фенолом [11]. Получали материал, эффективный для амплификаций фрагментов рДНК V3/ V4 или ITS1/ ITS2 и секвенирования по Сенгеру. Лиофильно-высушенные образцы ресус-пендировали в 200 мкл TES буфера и сразу добавляли стеклянные шарики (D = 500 мкм) и 200 мкл фенола (насыщенного 0.2 M Tris-HCl, рН 8,5). Смесь интенсивно встряхивали на Vortex 5 мин, ин-

кубировали 65oC, 1 ч. Затем проводили аналогичную обработку: повторно встряхивали на Vortex 5 мин, центрифугировали 10 мин при 13400 об/мин, отбирали верхнюю водную фракцию, промывали равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1), осаждали кислым спиртом, делали промывку 70% спиртом, осадок ресуспендировали в аликвоте H2O. Принципиальное отличие этой методики заключалось в инкубации в течение часа в горячем феноле (65oC). В этих условиях большинство низкомолекулярных примесей также деградировало, что выражалось, в том числе, в исчезновении различных пигментных окрасок после растворения геномной ДНК в воде на последнем этапе очистки. Низкомолекулярные примеси крайне нежелательны, поскольку могут ингибировать реакцию ПЦР; при сорбции НК на твердофазном носителе уходят на этапе промывки. Их прямое разрушение позволяло в подобранных условиях получать геномную ДНК без низкомолекулярных примесей при фенольной экстракции. Однако при этом происходила также частичная деградация высокомолекулярной фракции геномной ДНК (по данным электрофореза в агарозном геле, не приведены). Выделенная таким методом геномная ДНК давала эффективные ПЦР продукты. Однако для подготовки образцов на NGS необходимо было исключить даже частичную деградацию мДНК, в том числе, чтобы получить данные о минорных геномных матрицах. В связи с этим фенольную экстракцию проводили в более мягких условиях (5 мин, комнатная температура), после предварительной инкубации в TES буфере (65oC, 1 ч).

Влияние низкомолекулярных соединений на ПЦР. В результате фенольной экстракции вместе с нуклеиновыми кислотами остаются водорастворимые низкомолекулярные соединения, которые могут ингибировать ПЦР. Это обстоятельство представляет важнейшее ограничение метода. Способы очистки, связанные с сорбцией НК на твердофазном носителе с последующей промывкой от примесей и элюцией снимают это ограничение, позволяют эффективно избавляться от низкомолекулярных примесей [1]. В наших экспериментах было важно установить, являются ли примеси, получаемые при сборе проб с поверхностей темперной живописи, такими ограничениями для применения фе-нольной экстракции. В результате проведенных экспериментов показано, что все исходные образцы, взятые с поверхности темперных образцов, эффективно амплифицируются после очистки мДНК оптимизированным методом фенольной экстракции. Для сопоставимости результатов пробы, отобранные с участков залов ГТГ, а также, из культур чистили по тому же протоколу (фенольной экстракции). Несмотря на то, что исходное количество биологического материала в этих образцах было достаточным для применения более эффективных с точки зрения очистки протоколов, важно было выделить матрицы ДНК один методом. Однако в одном случае среди образцов, собранных в залах ГТГ, примесные соединения ингибировали ПЦР реакцию. В частности, STG-S92 собрали из трещины в потолке зала 57 Живописи Древней Руси; после фе-нольной экстракции и ресуспендирования в 20 мкл H2O образец имел исходную мутную белую

окраску. ПЦР реакция с ДНК полимеразой KAPA HiFi HotStart не проходила ни с одной из пар прай-меров. Это было довольно странно, поскольку выделенные из соседних проб мДНК (STG-S91, STG-S93) давали эффективные ПЦР-продукты. 50-кратное разведение (с целью разбавления ингибирую-щей примеси) так же не приводило к желаемому результату. Однако использование набора ScreenMix неожиданно позволило получить как V3/V4, так и ITS2 фрагменты рДНК. Возможно, это связано с большой чувствительностью высокоточной поли-меразы KAPA HiFi HotStart к чистоте исходного препарата.

Для CD- или LB-культур при данном методе выделения мДНК в ряде случаев происходило ин-гибирование ПЦР. Для эффективной реакции мДНК разводили в 50 раз, затем сравнивали результаты амплификаций, полученных для базовой и разведенной матриц. Для последующего эксперимента элюировали из геля ПЦР-образец с эффективно наработанной матрицей. В результате на матрице мДНК, выделенной методом фенольной экстракции, для всех выбранных культур получили ПЦР-фрагменты, содержащие V3/V4 и ITS2 рДНК,

По-видимому, исходное (невидимое глазом) количество биологического материала, собранного «сухим» способом с темперных поверхностей, содержит настолько мало материала, что выражается также в низком содержании низкомолекулярных соединениях, не приводящих к ингибированию реакции ПЦР. С другой стороны, в залах ГТГ пробы отбирали также с различных коммуникаций, в том числе, из видимых очагов биологического поражения и при этом могли захватывать сопутствующие материалы (элементы штукатурки, досок, и другие). В одном случае наблюдали ингибирование образца примесными продуктами. В любом случае показали, что спектр применения разработанного протокола выделения полностью применим для деликатно отобранных проб с темперных поверхностей. Если исходного материала критично мало, то низкомолекулярные примеси биологической природы не критичны для ПЦР реакции. Кроме того, низкомолекулярные примеси с темперной поверхности, которые могут присутствовать после используемого протокола очистки, также не критичны в силу метода и количества взятого материала. Для очистки мДНК из проб, собранных с поверхностей коммуникаций залов ГТГ (в частности, из очагов микробиологического роста), а также, из культур микроорганизмов, более подходит метод с применением сорбции на твердофазном носителе. Для сопоставимости данных все очистки провели одним способом (фенольной экстракции), который обусловлен лимитируемым количеством материала, собранного с темперных образцов.

Оптимизация условий ПЦР амплификации. Определяющим этапом для пробоподготовки в нашей работе являлось получение искомых ПЦР-фрагментов с навесками для последующего «штрихкодирования» («баркодирования») с использованием Nextera XT Index kit ("Illumina, Inc", США). На первом этапе на амплификаторе Master-cycler gradient в градиентном режиме подобрали оптимальные температуры отжига для обоих изучае-

мых пар праймеров. В качестве матриц для калибровки использовали мДНК исходных образцов, взятых с темперной поверхности (STG-S52) или из зала ГТГ (STG-S103). Этот этап важен для получения эффективных ПЦР-продуктов, позволяющих извлечь качественные данные при NGS. Также меняли время денатурации (15-30 сек), отжига (15-40 сек) и элонгации (20-40 сек).

Одним из необходимых условий NGS - использование высокоточных ДНК-полимераз. Используемая нами ДНК-полимераза KAPA HiFi HotStart рекомендована для подготовки NGS-библиотек и имеет точность 2.8 x 10-7 ошибок/ основание

(https://rochesequencingstore.com/catalog/kapa-hifi-hotstart-readymix/). Поскольку эффективность ПЦР с различных метагеномных матриц идет с различной эффективностью, увеличение числа циклов ведет к искажению начального соотношения ДНК различных микроорганизмов в пробе. Подобранные нами оптимальные условия амплификации для KAPA HiFi HotStart на приборе Mastercycler gradient позволили получить продукты реакции искомой длины на большинстве мДНК матрицах за 25 циклов. Такие показатели достигнуты не только для культур или исходных образцов из залов ГТГ, но и для исходных проб, взятых с поверхностей темперной живописи. Однако в некоторых случаях при 25 циклах не амплифицировался ПЦР-фрагмент. В этом случае, реакцию увеличивали до 30-35 циклов, что является верхним пределом количества циклов при подготовке препаратов для NGS, заявленных производителем HiFi HotStart (https://rochesequencingstore.com/catalog/kapa-hifi-hotstart-readymix/).

Заключение

В заключение можно сделать вывод, что оптимизированные нами условия позволили эффективно наработать и выделить методом элюции из геля все выбранные для метагеномного анализа образцы. Последующие эксперименты по метагеном-ному секвенированию этих образцов позволят сделать как дальнейшие выводы об эффективности пробоподготовки, так и дадут информацию о мик-робиомах, обитающих в залах и на экспонатах темперной живописи XVI-го века в ГТГ. От этих результатов зависит оценка риска биоповреждения для изучаемых произведений искусства и пути поиска антисептиков нового поколения, избирательно уничтожающих паразитирующие микробиомы и не повреждающие сами экспонаты.

Авторы выражают благодарность главному хранителю музейных предметов Государственной Третьяковской галереи Татьяне Семеновне Город-ковой за предоставленную возможность работать с материалом галереи, старшему научному сотруднику Государственной Третьяковской галереи Елене Александровне Любавской за квалифицированную помощь при работе с произведениями искусства, студенту Московского Политехнического Университета Ширяеву Михаилу Игоревичу за помощь в подготовке проб мДНК, ведущему научному сотруднику ФИЦ Биотехнологии РАН Михаилу Анатольевичу Эльдарову за ценные консультации по выделению мДНК и всестороннюю помощь в проведении работы.

Работа поддержана грантом РФФИ 17-2904349.

Список использованной литературы

1. Ребриков Д. В., Коростин Д. О., Шубина Е. С. ИВВ. NGS: высокопроизводительное секвенирование [Internet]. 2М-е изд. ed. Ребриков Д. В., editor. Москва: Издательство "БИНОМ. Лаборатория знаний"; 2015. Available: http://pilotlz.ru/books/270/8606/

2. Жгун АА, Авданина ДА. Микробиологическое поражение произведений темперной живописи. Порт Луи: LAP LAMBERT Academic Publishing; 2018.

3. Caporaso JG, Lauber CL, Walters WA, BergLyons D, Lozupone CA, Turnbaugh PJ, et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proc Natl Acad Sci US A. 2011;108 Suppl 1: 4516-22. doi:10.1073/pnas.1000080107

4. Edwards U, Rogall T, Blöcker H, Emde M, Böttger EC. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 1989;17: 7843-53. Available: http ://www. ncbi.nlm. nih. gov/pubmed/2798131

5. Martin KJ, Rygiewicz PT. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 2005;5: 28. doi:10.1186/1471-2180-5-28

6. Kumar M, Shukla PK. Use of PCR Targeting of Internal Transcribed Spacer Regions and Single-Stranded Conformation Polymorphism Analysis of Sequence Variation in Different Regions of rRNA Genes in Fungi for Rapid Diagnosis of Mycotic Keratitis. J Clin Microbiol. 2005;43: 662-668. doi:10.1128/JCM.43.2.662-668.2005

7. Korabecna M, Korabecna M. The Variability in the Fungal Ribosomal DNA (ITS1, ITS2, and 5.8 S rRNA Gene): Its Biological Meaning and Application. Med Mycol Commun Curr Res Educ Top TRENDS Appl Microbiol MENDEZ-VILAS. 2007; Available: http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/summary?doi=10. 1.1.628.3446

8. Park Y-J, Min B-R. Sequence analysis of the internal transcribed spacer of ribosomal DNA in the genus rhizopus. Mycobiology. 2005;33: 109-12. doi:10.4489/MYC0.2005.33.2.109

9. Krakova L, Soltys K, Otlewska A, Pietrzak K, Purkrtova S, Savicka D, et al. Comparison of methods for identification of microbial communities in book collections: Culture-dependent (sequencing and MALDI-TOF MS) and culture-independent (Illumina MiSeq). Int Biodeterior Biodegradation. 2017; doi:10.1016/J.IBI0D.2017.02.015

10. Zhgun AA, Avdanina DA, Simonenko NP, Volkov IA, Ivanov VV. Detection of biodeterioration on materials used in tempera painting. Znan misel J. 2018;1: 7-15.

11. Zhgun AA, Avdanina DA, Potapov MP, Stepanov MG, Shitov M V. Genotyping of microorganisms capable of damaging materials used in tempera painting. Znan misel J. 2018;20: 6-13.

12. Vilgalys R, Hopple J, Hibbett DS. Phylogenetic implications of generic concepts in fungal taxonomy: the impact of molecular systematic studies. Mycol Helv. 1994;6: 73-91.