CC BY
42УДК 634.1/7
ОПТИМИЗАЦИЯ ЭТАПА ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ ТКАНИ В КЛОНАЛЬНОМ МИКРОРАЗМНОЖЕНИИ МАЛИНЫ
М.Г.Маркова, Е.Н. Сомова — Удмуртский НИИСХ E-mail: [email protected]
Для эффективного развития растений в культуре ткани большое значение имеет подбор питательной среды и эффективность стерилизации исходного материала, которая в конечном итоге влияет на выход развившихся эксплантов. Исследования проведены в меристемной лаборатории Удмуртского научно-исследовательского института сельского хозяйства. Объектами исследования служили точки роста малины красной сорта Гусар. Вычленение апексов осуществляли в стерильных условиях ламинар-бокса, их культивирование - в светокомнате лаборатории. Для стерилизации сегментов подземных этиолированных ростков малины использованы 33 % раствор пергидроли, 10% раствор «Domestos», 0,1 % раствор сулемы с последующей многократной промывкой материала стерильной дистиллированной водой. Исследуемыми были питательные среды Кворина-Лепорье и Андерсона, за контрольную взята питательная среда Мурасиге-Скуга. Все питательные среды имели в своем составе 6-БАП (6-бензиламинопурин) в дозе 0,5 мг/л. Учет выживаемости эксплантов проведен через три недели после помещения их на питательную среду. Оптимальной для культивирования эксплантов малины красной сорта Гусар при введении в культуру in vitro оказалась питательная среда Кворина-Лепорье, выживаемость эксплантов, независимо от применяемого стерилизующего агента, была в 1,6 раза выше, чем в контроле. При использовании в качестве стерилизующего агента 33,0 % раствора пергидроли выживаемость эксплантов достоверно выше (45,5 %), чем после обработки раствором «Domestos» (38,4 %) и почти в 3 раза выше, чем при использовании сулемы.
Ключевые слова: клональное микроразмножение, малина красная, питательная среда, стерилизующий агент, выживаемость эксплантов.
В системе производства оздо- тивирования. На этапе введения в
ровленного посадочного материала прочное место занимает метод культуры изолированных тканей. Несмотря на его эффективность при массовом производстве посадочного материала возникают вопросы, связанные с оптимизацией отдельных элементов технологии клонального микроразмножения, обеспечивающих стабильность, предсказуемость и удешевление конечного результата [1].
Процесс микроразмножения состоит из ряда последовательных операций или этапов: 1) ведение экспланта в культуру; 2) собственно размножение; 3) укоренение растений; 4) адаптация растений к нестерильным условиям [2]. Каждый из этапов имеет свою специфику. Однако подбор оптимальной питательной среды с определенной концентраций ее компонентов необходим для каждого этапа куль-
Владишрскш ЗемлеШеЩ)
культуру ткани успех часто определяется не только правильно подобранной питательной средой, но и эффективностью стерилизации, которая влияет на выход развившихся эксплантов. Правильно выполненная стерилизация - это необходимое условие хорошо растущей культуры. Грибная или бактериальная инфекция, попав вместе с экс-плантом в благоприятные условия культивирования (богатая питательная среда, внешние условия), будет развиваться более быстрыми темпами и угнетать растение, что, в конечном итоге, приведет к его гибели [3].
Для введения в культуру ткани малины единственно пригодны в качестве эксплантаов почки этиолированных подземных побегов, поэтому для освобождения их от всех инфекций стерилизующий эффект применяемого дезинфицирующего
средства должен быть действенным.
Регенерационная способность апексов малины в значительной мере связана с сезонностью. Оптимальным временем для вычленения является период активного роста. Для введения в культуру ткани используют меристематические верхушки размером 0,25-0,75 мм с последующим культивированием их на питательных средах [4].
Цель исследований - подбор оптимального стерилизующего агента и питательной среды для введения в культуру in vitro малины красной.
Объектами исследования служили точки роста малины красной сорта Гусар. Точки роста были введены в стерильную культуру во второй половине мая. Все работы проводили согласно «Технологии клонального микроразмножения растений» [4], а также «Методическим указаниям по клональному
№ 3 (77) 2016
Выживаемость эксплантов малины в зависимости от питательной
микроразмножению черной и красной смородины» [5].
Вычленение апексов осуществляли в стерильных условиях ла-минар-бокса, их культивирование - в светокомнате лаборатории при освещенности 5,0 тыс. лк, 16-часовом световом дне, температурном режиме 23...260С, относительной влажности воздуха 70 - 75%. Перед стерилизацией растительный материал промывали проточной водой в течение 1 часа. Для стерилизации сегментов этиолированных ростков использованы 33 % раствор пер-гидроли (продолжительность 6-8 мин., контроль), 10 % «Domestos» (6-7 мин.), 0,1 % раствор сулемы (1-2 мин.) с последующей многократной промывкой материала стерильной дистиллированной водой. Исследовали питательные среды Кворина-Лепорье (Ц^) и Андерсона, за контрольную была взята питательная среда Мурасиге-Скуга (М^). Все питательные среды имели в своем составе 6-БАП (6-бензи-ламинопурин) в дозе 0,5 мг/л. Учет выживаемости эксплантов проведен через три недели после помещения их на питательную среду.
Статистическую обработку экспериментальных данных прово-
Юг 3 (77) 2016
дили в программе Microsoft Excel 97 по алгоритмам дисперсионного анализа, изложенным Б. А. Доспе-ховым [6].
На выживаемость эксплантов малины красной на этапе введения в культуру ткани оказали влияние как питательная среда для их культивирования, так и вещество, используемое для стерилизации исходного материала.
Наибольший выход выживших эксплантов отмечен по всем применяемым стерилизующим агентам на питательной среде Кворина-Лепо-рье (рисунок). Их выживаемость на данной среде достоверно (на 23,3, 9,2 и 13,7 %) выше, чем в контрольном варианте на Мурасиге-Скуга при НСР05 9,2 %. На питательной среде Андерсона разница в выживаемости эксплантов существенна (на 13,3 % выше) в сравнении с контролем только при обработке исходного материала пергидролем, а при обработке «Domestos» и сулемой разница несущественна (7,0 и 0,4 % соответственно).
Оптимальным при стерилизации исходного материала оказался пергидроль. Его применение по всем питательным средам обеспечило выживаемость эксплантов соответ-
среды и стерилизующего агента, %
ственно 33,3 %, 56,6 и 46,6 %, что существенно (на 22,7, 32,3 и 35,6 % соответственно) выше, чем при дезинфекции сулемой при НСР05 6,4 %. Использование «Domestos» в сравнении с контролем значительно снизило выживаемость экс-плантов по питательной среде Кворина-Лепорье
(на 14,4 %) и по среде Андерсона (на 6,6 %). На контрольной питательной среде Мурасиге-Скуга обработка «Domestos» и пергидролем (контроль) оказалась одинаковой по эффективности: выживаемость эксплантов 33,0 и 33,3 % соответственно.
Проанализировав данные по выживаемости эксплантов на различных питательных средах, можно сделать вывод о достоверном преимуществе культивирования их на питательной среде Кворина-Ле-порье. Выживаемость эксплантов на этой среде в среднем, независимо от стерилизующего агента, в 1,6 раза выше, чем на питательной среде Мурасиге-Скуга (контроль). Выживаемость эксплантов на среде Андерсона несущественно (на 6,9 %) выше, чем в контрольной при НСР05 9,2 %.
Можно также сделать вывод
ß/iaöuMipckiü ЗемдеШецТ)
о значительной эффективности использования в качестве стерилизующего агента пергидроли в сравнении с другими дезинфицирующими средствами. Выход активно развивающихся эксплантов после обработки исходного материала данным агентом наибольший и составил (независимо от питательной среды) 45,5 %, что достоверно выше (на 7,1 %), чем после обработки раствором «Domestos» при НСР 6,4 %, а также почти в 3 раза выше, чем при использовании сулемы. Следует отметить, что использование раствора 0,1%-ной сулемы было менее эффективным по причине большого количества обожженных эксплантов.
Отмечено также, что не все экс-планты, освобожденные от инфекции, начинали расти и развиваться. Возможно они повреждались во время стерилизации или травмировались во время изоляции и посадки на питательную среду. На этапе введения в культуру ткани отбраковывали также микропобеги с некрозами и витрифицированные, так как они нежизнеспособны.
Таким образом, исследования по подбору оптимальной питатель-
ной среды и стерилизующего агента для введения в культуру in vitro малины красной показали:
- оптимальной для культивирования эксплантов при введении в культуру in vitro на примере малины красной сорта Гусар оказалась питательная среда Кворина-Ле-порье, так как выживаемость эксплантов, независимо от применяемого стерилизующего агента, в 1,6 раза выше, чем на контрольной питательной среде Мурасиге-Скуга;
- оптимальным в качестве стерилизующего агента стало использование 33,0 % раствора пергидроли, при котором выживаемость эксплантов достоверно самая высокая и составила 45,5 %.
Литература
1.Панькова О.А, Несмелова Н.П. Совершенствование приемов кло-нального микроразмножения ягодных кустарников// Аграрная наука Евро - Северо - Востока, 2008, №11.- С.72 - 76.
2. Шипунова А.А., Высоцкий В.А. Влияние некоторых факторов культивирования на клональное микроразмножение плодовых и ягодных
растений// Плодоводство и ягодо-водство России, 2002, № 9. - С.193-200.
3. Шорников Д.Г., Гляделкина
A.С. Влияние типа эксплантов на эффективность введения in vitro сортов малины красной/ Сучасний стан i прюритет розвитку фiзiолоrií рослин, генетики та бютехнологп: Матерiали десято'|' конференц'п мо-лодих вчених (25 - 26 жовтня 2007 року), Ки1в : 1нститут фiзiологií рослин i генетики НАН Укра1ни, 2007.-С. 157-158.
4. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микро-клонального размножения растений - Киев:Наукова Думка, 1992.232 с.
5. Поликарпова Ф.Я, Высоцкий
B.А, Тарашвили З.Г. Методические указания по клональному микроразмножению черной и красной смородины: НИЗИСНП - М., 1986.-15с.
6. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта- М.: Колос, 1985.- 416 с.
OPTIMIZATION OF INTRODUCTION STAGE IN THE FABRIC STANDARD IN CLONAL MICROREPRODUCTION OF RASPBERRIES M.G. Markova, E.N. Somova
The selection of nutritive medium and efficiency of source material sterilization, which in the final end determines the outcome of the developed explants, is dramatically important for efficient plants growth in the fabric standard. The researches were carried out in meristematic laboratory of Udmurtia scientific-research university of agriculture. The objects of research were growing points of raspberries, variety Gusar. Disarticulation of apexes was carried out in sterile conditions of laminar flow safety hood, their cultivation - in luminous box of the laboratory. In order to sterialize the segments of subterranean etiolated raspberries sprouts there were used 33% solution of perhydrol, 10% solution of "Domestos", 0,1% solution of mercuric chloride with successive multiple washout of the material in sterile aqua destillata. The nutritive mediums were Kvorina-Leporie and Andersona, the nutritive medium Murasige-Segura was assessed as the control one. All nutritive mediums contained 6-BAP (6-benzylaminopurine ) in the dose of 0,5 mg/l. The track of survival ability of explants was kept 3 weeks later after they had been placed in the nutritive medium. The nutritive medium Kvorina-Loporie appeared the optimal one for explants cultivation of raspberries, variety Gusar, while bringing the standard in vitro: survival ability of explants independently on the used steriolized agent, was 1,6 times higher as compared to the control variant. Explants' survival ability with the use of 33,0% solution of perhydrol as the means of the steriolizing agent proved to be higher (45,5%) than after being treated with "Domestos" solution (38,4%) and approximately 3 times higher during mercuric chloride use.
Keywords: clonal microreproduction, red raspberries, nutritive medium, sterializing agent, explants survival ability.
Владишрскш ЗемлеШеф
№ 3 (77) 2016
