CC BY
85
УДК: 616-QQ6.Q4-Q97
ОПТИМИЗАЦИЯ Аутологичных ДЕНДРИТНО-КЛЕТОЧНЫХ ВАКЦИН ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ
Т.Л. Нехаева
ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, г. Санкт-Петербург 197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68, e-mail: oncl@rion.spb.ru
Исследованы иммунобиологические xаpактеpистики дендритным клеток (ДК) для оптимизации теxнологии получения дендритно-клеточньк вакцин (ДК-вакцин). Проведен сравнительный анализ иммунологического фенотипа незрелый и зрелый ДК, диффеpенциpованныx in vitro в присутствии ростового фактора GM-CSF (CellGenix, Германия) и ГМ-КСФ (Фармсинтез, Россия) в ранее изученной концентрации 72 нг/мл, и IL-4 (CellGenix, Германия) в интервале концентраций от Q до 45 нг/мл. Для стандартизации теxнологического процесса получения вакцинныи ДК рекомендуется использовать оптимальную панель моноклональный антител: CD14, CD^, CDS3, CDS6, CDSQ, CCR7, HLA DR. Результаты проточной цитометрии и иммуноцитоxимического анализа показали отсутствие достоверный различий в экспрессии маркеров зрелый ДК (p>Q,Q5), что свидетельствует о целесообразности использования ростового фактора ГМ-КСФ (Фармсинтез, Россия) для приготовления пpотивоопуxолевыx вакцин на основе ДК. С помощью однофакторн^гк полиномиальный моделей второго порядка установлен оптимальный интервал концентрации IL-4 для дифференцировки ДК от 5 до 15 нг/мл.
Ключевые слова: иммунотерапия, дендритные клетки, вакцина, оптимизация.
AUTOLOGOUS DENDRITIC CELL VACCINE OPTIMIZATION FOR THERAPY OF PATIENTS WITH DISSEMINATED MALIGNANT NEOPLASMS T.L. Nehaeva N.N. Petrov Research Institute of Oncology 68, Leningradskaya Street, 197758-St. Petersburg, Pesochny, Russia e-mail: oncl@rion.spb.ru
Immunobiological features of the dendritic cells (DC) were studied for the production of DC-vaccine (DCV) optimization. DC were differentiated in vitro in GM-CSF (previously studied concentration 72 ng/ml and IL-4 0-45 ng/ml containing medium. GM-CSF compounds by Pharmsynthez (Russia) and Cell Genix (Germany) and IL-4 by Cell Genix (Germany) were used. Comparative assays of mature and immature DC immunophenotype using different GM-CSF compounds was performed. CD1a, CD83, CD86, CD80, CCR7 h HLA DR are recommended optimal markers of DC for the standardization of technologic process. Flow cytometry and immunocytochemistry assays revealed no differences in mature DC markers expression (p>0,05). This indicates the expediency of Pharmsynthez (Russia) GM-CSF usage for DCV production. Optimal IL-4 concentrations (5-15 ng/ml) providing qualitative characteristics for DCV production were found using second level one-way polynomial model.
Key words: immunotherapy, dendritic cell, DC-vaccine, optimization.
Создание терапевтических вакцин на основе дендритных клеток (ДК) рассматривается как один из перспективных подходов в комплексной терапии злокачественных новообразований, результаты международных и отечественных клинических исследований свидетельствуют о клинической эффективности данного метода лечения у некоторых категорий больных [1, 2, 5]. Вместе с тем использование ДК-вакцин, обладающих эффективностью. безопасностью и надлежащим уровнем качества
в рутиннои клиническом практике, предполагает оптимизацию и стандартизацию рекомендованных методик [3, 8, 9].
Дифференцировка вакцинных ДК из моноцитов периферической крови in vitro с использованием различных питательных сред, ростовых факторов и факторов дифференцировки различной активности в ряде случаев препятствует получению стандартного клеточного продукта охарактеризованного качества. В частности, появление на фармацевти-
ческом рынке гранулоцитарно-макрофагеального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) Неостим отечественного производства (Фармсинтез, Россия) для клинического использования позволяет заменить дорогостоящий импортный аналог GM-CSF (СеІЮепіх, Германия) и значительно удешевить стоимость изготовления ДК-вакцин. Вместе с тем предполагаемый технологический переход не изучен. Более того, не определена оптимальная концентрация интерлейкина-4 (^-4). в присутствии которого осуществляется дифферен-цировка ДК из моноцитов периферической крови. Более чем в 200 клинических исследованиях были использованы различные концентрации ^-4 без достаточно аргументированного обоснования. чаще в диапазоне от 6,75 нг/мл до 180 нг/мл [7. 11]. Несомненно, это затрудняет стандартизацию ДК-вакцин, что определило проблему научного поиска и цель настоящего исследования.
Целью исследования является изучение иммунологического фенотипа незрелых и зрелых ДК, дифференцированных из моноцитов периферической крови больных злокачественными новообразованиями в присутствии фиксированной концентрации GM-CSF (СеІЮепіх, Германия) или ГМ-КСФ (Фармсинтез, Россия), и различных концентраций ^-4 (СеІЮепіх, Германия).
Материал и методы
Дифференцировку ДК из адгезионной моноци-тарной фракции мононуклеаров периферической крови больные меланомой кожи проводили в сбалансированной бессывороточной среде «Cell-Gro DC», приготовленной в условияx надлежащей производственной практики GMP (Cell Genix, Германия), адгезионные культуральный флаконаx с вентилируемыми крышками (Sarstedt, Германия) в условияx СО2 инкубатора «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия) при 37°С, 5 % CO2 и 98 % влажности. В исследовании использовали ростовой фактор GM-CSF (CellGenix, Германия) и ГМ-КСФ (Фармсинтез, Россия) в ранее изученной концентрации 72 нг/мл и IL-4 (CellGenix, Германия) в интервале концентраций от Q до 45 нг/мл. Ростовые факторы и фактор дифференцировки вносили на 1, 3 и 5-й день культивирования (незрелые ДК). На 7-й день вносили коктейль лизированнык оxа-растеризованныи аутологичные и/или аллогеннык опуxолевыx клеток (клеточные линии Mel 226, Mel 515, Mel 519, Mel 52Q), экспрессирующж иммуногенные раково-тестикулярные антигены (NY-ESO-1+, MAGE+, HAGE+, GAGE+) и фактор некроза опуxоли (TNFa) 2Q нг/мл (BD, США). Инкубацию с опуxолевым лизатом проводили в течение 4S ч.
Таблица 1
Иммунофенотип зрелых ДК, выращенных в присутствии ростового фактора GM-CSF
различных производителей и iL-4, M±m, б
Дифференцировочные/ линейноспецифические антигены GM-CSF Фармсинтез, Россия GM-CSF CellGenix, Германия Критерий Фишера (F), уровень значимости (p)
CD14+ 2,Q2 ± Q,91 %; 3,18 6,12 ± 2,34 %; 5,17 F=3,91; p=Q,Q7 (>Q,Q5)
CD1a+ 24,Q3 ± 9,11 %; 26,22 2Q,Q8 ± 9,13 %; 23,Q1 F=Q,Q7; p=Q,79 (>Q,Q5)
CDS3+ 82,15 ± 6,Q7 %; 18,34 66,14 ± 4,21 %; 1Q,12 F=3,85; p=Q,Q7 (>Q,Q5)
CD1a+ CD83- 13,11 ± 5,Q1 %; 15,12 13,23 ± 6,16 %; 15,32 F=Q,QQ1; p=Q,97 (>Q,Q5)
CD1a+CD83+ 1Q,12 ± 4,Q6 %; 13,1Q 8,12 ± 4,21 %; 11,15 F=Q,Q8; p=Q,78 (>Q,Q5)
CD1a-CD83+ 72,22 ± 9,12 %; 27,15 59,41 ± 7,26 %; 17,16 F=1,1Q; p=Q,31 (>Q,Q5)
CDS3+ CDS6+ 47,Q5 ± 7,11 %; 21,14 51,24 ± 6,12 %; 15,16 F=Q,11; p=Q,74 (>Q,Q5)
CDS3+ CDSQ+ 78,23 ± 5,Q7 %; 15,1Q 65,25 ± 4,12 %; 9,Q6 F=3,63; p=Q,Q8 (>Q,Q5)
CCR7+ 83,23 ± 8,Q2 %; 24,14 82,56 ± 11,31 %; 28,31 F=Q,Q1; p=Q,94 (>Q,Q5)
CCR7+CDS3+ 76,16 ± 9,13 %; 23,43 64,14 ± 7,16 %; 13,Q5 F=Q,74; p=Q,41 (>Q,Q5)
HLA DR+ 93,Q3 ± 2,11 %; 6,23 91,31 ± 5,33 %; 12,14 F=Q,17; p=Q,68 (>Q,Q5)
Примечание: М - среднее значение экспрессии иммунофенотипического маркера, т - ошибка среднего значения, 5 - стандартное отклонение, концентрация GM-CSF - 72 нг/мл, !Ъ-4 - 45 нг/мл.
Подсчет количества и оценку жизнеспособности ДК осуществляли с помощью автоматического счетчика клеток «Countess™» («Invitrogen», США) и Q,4 % трипанового синего (Sigma, США). Экспрессию линейноспецифическж и дифферен-цировочныгс антигенов на моноцит, незрелый и зрелый ДК изучали с помощью моноклональный антител (DAKO, Дания) и системы визуализации «In vision» (DAKO, Дания) для иммуноцитоxими-ческого метода; напрямую меченный флуоpоxpо■ мами моноклональныx антител (anti-CDS3-PE-Cy5, anti-CD1а-PE, anti-CDSQ-FITC, anti-CDS6-FITC, anti-CD14-FITC, anti-CCR7-FITC, anti-HLA-DR-Per CP-Cy5.5), для метода лазерной проточной цитофлуориметрии («BD Biosciences», США). В последнем случае использовали программное обеспечение CellQuest Pro (tm).
Оценку результатов исследования проводили с помощью описательной статистики, однофакторного дисперсионного и регрессионного анализа
[4].
Результаты и обсуждение
Сравнительный анализ экспрессии иммуно-фенотипическиx маркеров зрелый ДК, диффе-pенциpованныx в присутствии фиксированной концентрации ростового фактора GM-CSF (CellGenix, Германия) или ГМ-КСФ (Фармсинтез, Россия) 72 нг/мл в сочетании с IL-4 (CellGenix, Германия) 45 нг/мл (табл. 1), не выявил статистически значимые различий (p>0,05), что свидетельствует
о сопоставимой активности ростовых факторов импортного и отечественного производства. Вместе с тем интересным является изучение особенностей дифференцировки ДК на разных стадиях созревания в присутствии ГМ-КСФ отечественного производства.
Результаты исследования (табл. 2) демонстрируют дифференцировку моноцитов в незрелые ДК: появление на клеточной мембране молекулы CD1a (71 ± 4,01 %) и утрату CD14 (3,02 ± 1,01 %). Зрелые ДК характеризуются высокой экспрессией маркера дифференцировки CD83 (76,1 ± 4,01 %) и утратой CD1a антигена (22,03 ± 6,02 %), а также статистически достоверным усилением экспрессии костимулирующих молекул CD80 с 31,01 ± 12,02 % до 73,03 ± 4,02 % (р=0,0003) и CD86 с 8,01 ± 2,02 % до 49,11 ± 5,03 % (р=0,00001). Высокий уровень экспрессии молекул хемокинового рецептора (CCR7). обеспечивающего миграцию зрелых ДК в лимфатические узлы, и белков, участвующих в презентации антигена (HLA DR) на 7-й и 9-й день культивирования, свидетельствует о созревании ДК.
Уровень зрелости ДК определяли по коэкспрес-сии антигенов CD1а и CD83. Анализ результатов свидетельствует о снижении содержания незрелых ДК ^1а^83") с 52,01 ± 11,02 % до 13,01 ± 4,02 % (р=0,0003) и увеличении зрелых ДК (cDla"CD83+) с 11,01 ± 4,04 % до 67,05 ± 6,02 % (р=0,00001) ДК к 9-му дню культивирования. Низкое содержание ДК промежуточной степени зрелости (CD1a+CD83+) в
Таблица 2
Сравнительный анализ иммунофенотипа ДК на разных стадиях созревания, M±m, б
Дифференцировочные/ линейноспецифические антигены ДК незрелые (7-й день) ДК зрелые (9-й день) Критерий Фишера (F), уровень значимости (p)
CD1a+ 71,12 ± 4,Q1 %; 11,21 22,Q3 ± 6,Q2 %; 24,36 F=25,73; p=Q,QQQQ1 (<Q,Q5)
CD14+ 3,Q2 ± 1,Q1 %; 3,18 4,Q4 ± 1,Q2 %; 4,13 F=Q,25; p=Q,62 (<Q,Q5)
CD83+ 32,Q2 ± 12,1 %; 33,26 76,1 ± 4,Q1 %; 17,41 F=17,18; p=Q,QQQ5 (<Q,Q5)
CD1a+ CD83- 52,Q1 ± 11,Q2 %; 29,42 13,Q1 ± 4,Q2 %; 14,21 F=18,59; p=Q,QQQ3 (<Q,Q5)
CD1a+CD83+ 21,Q3 ± 9,Q4 %; 23,17 9,Q2 ± 3,Q3 %; 12,25 F=2,79; p=Q,11 (>Q,Q5)
CD1a-CD83+ 11,Q1 ± 4,Q4 %; 11,31 67,Q5 ± 6,Q2 %; 24,43 F=34,Q7; p=Q,QQQQ1 (<Q,Q5)
CD83+ CD86+ 8,Q1 ± 2,Q2 %; 6,24 49,11 ± 5,Q3 %; 19,32 F=31,56; p=Q,QQQQ1 (<Q,Q5)
CD83+ CD8Q+ 31,Q1 ± 12,Q2 %; 31,11 73,Q3 ± 4,Q2 %; 14,34 F=19,574 p=Q,QQQ3 (<Q,Q5)
CCR7+ 63,Q3 ± 14,1 %; 38,32 82,Q2 ± 6,Q1 %; 25,18 F=2,Q44 p=Q,17 (>Q,Q5)
HLA-DR+ 91,Q1 ± 3,13 %; 8,26 92,Q2 ± 2,Q2 %; 9,Q2 F=Q,16; p=Q,68 (>Q,Q5)
Примечание: М - среднее значение экспрессии иммунофенотипического маркера, т - ошибка среднего значения, 5 - стандартное отклонение.
Рис. 1. Микрофото. Иммунофенотип зрелые вакцинные ДК (CD1a-, CD83+, CD11c+, HLA DR+, CD86+), выращенные in vitro в присутствии ростового фактора GM-CSF (72 нг/мл), Фармсинтез (Россия) и IL-4 (45 нг/мл), CellGenix (Германия), нагpуженныx опуxолевым лизатом и активированные TNF-a (2Q нг/мл, BD (США), (световой микроскоп, x1QQ)
Рис. 2А. Зависимость экспрессии иммунофенотипических маркеров незрелых ДК от концентрации ^-4. Ось абсцисс - концентрации ^-4, нг/мл. Ось ординат - уровень экспрессии иммунофенотипических маркеров, %
Рис. 2Б. Отсутствие зависимости экспрессии иммунофенотипических маркеров незрелых ДК от концентрации Иг4. Ось абсцисс - концентрации Иг4, нг/мл.
Ось ординат - уровень экспрессии иммунофенотипических маркеров, %
указанные сроки свидетельствует об их высокой функциональной активности.
Признаком функциональной активности ДК является повышение уровня экспрессии костиму-лирующих молекул СБ80, СБ86, молекул адгезии СБ209, антигена СБ83, характерного для терминальной степени созревания ДК по сравнению с незрелыми ДК.
На рис. 1 представлен иммунофенотип вакцинных ДК, изученный с помощью иммуноцито-химического метода. Маркеры активированных ДК (^А БЯЬібЬ, СБ1аІ0" СБ80Ь«Ь, СБ86ЬІ«Ь) экспрессируют 65-80 % клеток, что сопоставимо с результатами, полученными методом проточной цитофлуориметрии.
Для дифференцировки ДК из моноцитов периферической крови чаще используют GM-CSF в сочетании с ^-4 и их синергизм в индукции
созревания [6, 10]. При этом используются различные концентрации ^-4 и GM-CSF без достаточно обоснованной аргументации, что свидетельствует о широком диапазоне их активности. На основе однофакторного регрессионного анализа нами проведена оценка влияния различных концентраций ^-4 на экспрессию иммунофенотипических маркеров незрелых и зрелых ДК. В результате были получены полиномиальные модели второго порядка: Y=A0+A1xC+A2xC2 (1), где Yi - уровень экспрессии иммунофено-типического маркера (%), соответственно для У1(СБ1а+СБ83-), Y2(CD1а+CD86+), Yз(CD1а+CD80+). У4(СБ1а+СБ40+), Y5(CD1а+CD209+), Y6(HLA-DR+); А А А2 - численные значения коэффициентов моделей; С - концентрация ^-4, нг/мл. Коэффициенты детерминации моделей ^2) составили от 70,0 до 82,0. Это свидетельствует о возможности
корректного применения выражения (1) для определения зависимости изменений соответствующей величины (^) от параметра (С).
На рис. 2А представлено наличие зависимостей экспрессии маркеров CD1а+CD83-; CD1а+CD40+ и CDlа+CD209+ от концентрации 1Ь-4 от 0 до 45 нг/мл. На рис. 2Б демонстрируется отсутствие существенных изменений уровня экспрессии маркеров CD1а+CD86+; CD1а+CD80+ и HLA-DR+. Расчеты показывают, что оптимальный интервал концентрации ^-4 при дифференцировке ДК находится в пределах от 5 до 15 нг/мл. Дальнейшее увеличение этой концентрации не приводит к значимому повышению уровня экспрессии изучаемых маркеров.
Таким образом, незрелые и зрелые ДК, дифференцированные из моноцитов периферической крови в присутствии изученных концентраций GM-CSF и ^-4, обладают выраженной функциональной активностью, определяемой по экспрессии молекул активации, миграции и костимулирующих сигналов.
Выводы
Применение для созревания ДК ростового фактора ГМ-КСФ отечественного производства (Фармсинтез, Россия) обеспечивает получение результатов, сопоставимых с таковыми при использовании GM-CSF импортного производства ^е^епіх, Германия).
Оптимальный интервал концентрации ^-4 для дифференцировки ДК находится в пределах от 5 до 15 нг/мл.
Для стандартизации технологического процесса получения вакцинных ДК рекомендуется исполь-
зовать оптимальную панель моноклональных антител: CD14, CDb, CD83, CD86, CD80, CCR7, HLA DR, метод проточной цитометрии или имму-ноцитохимическое окрашивание.
ЛИТЕРАТУРА
1. Балдуева И.А., Новик А.В., Моисеенко В.М., Нехаева Т.Л. Клиническое исследование (II фаза) вакцины на основе аутологичных дендритных клеток с иммунологическим адъювантом у больных с меланомой кожи // Вопросы онкологии. 2012. Т. 58, № 2. С. 212-221.
2. Леплина О.Ю., Насонова Г.В., Тихонова М.А. и др. IFNa-индуцированные дендритные клетки у больных множественной миеломой // Сибирский онкологический журнал. 2009. № 6 (36). С. 37-43.
3. Моисеенко В.М., Балдуева И.А. Принципы создания и использования лечебных вакцин в онкологии // Российский онкологический журнал. 2011. № 2. С. 49-53.
4. Медик В.А., Токмачев М.С., Фишман Б.Б. Статистика в медицине и биологии. М.: Медицина, 2000. Т. 1. 454 с.
5. СемилетоваЮ.В., АнисимовВ.В., ВагнерР.И. Лечение больных первичной меланомой кожи. Современное состояние проблемы // Сибирский онкологический журнал. 2010. № 4 (40). С. 71-77.
6. Ahn J.S.,AgrawalB. IL-4 is more effective than IL-13 for in vitro differentiation of dendritic cells from peripheral blood mononuclear cells // Int. Immunol. 2005. Vol. 17 (1). P 1337-1346.
7. Bohnenkamp H.R., Но11 T. Development of a standardized protocol for reproducible generation of matured monocyte-derived dendritic cells suitable for clinical application // Cytotechnology. 2003. Vol. 42 (3). P. 121-131.
8. Chiang C.L., Maier D.A., Kandalaft L.E. et al. Optimizing parameters for clinical-scale production of high IL-12 secreting dendritic cells pulsed with oxidized whole tumor cell lysate // J. Transl. Med. 2011. Vol. 9. P. 198-230.
9. Draube A., Klein-Gonzalez N., Mattheus S. et al. Dendritic Cell Based Tumor Vaccination in Prostate and Renal Cell Cancer: A Systematic Review and Meta-Analysis // PLoS One. 2011. Vol. 6 (4). E. 18801. doi: 10.1371/journal.pone.0018801.
10. Hettihewa L.M. Prolonged expression of MHC class I - peptide expression in bone marrow derived retrovirus transfected matured dendritic cells by continuous centrifugation in the presence of IL-4 // Ind. J. Med. Res. 2011. Vol. 134 (5). P. 672-678.
11. Ning J., Morgn D., Pamphilon D. A Rapid Culture Technique Produces Functional Dendritic-Like Cells from Human Acute Myeloid Leukemia Cell Lines // J. Biomed. Biotechnol. 2011. Vol. 2011. 172965. doi: 10.1155/2011/172965. Epub. 2011. Dec 5.
Поступила 5.04.13
