CC BY
34
УДК 546.23:543.426 ББК 24.126.2 Ц 59
Цикуниб А.Д.
Доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой химии факультета естествознания, директор НИИ комплексных проблем Адыгейского государственного университета, Майкоп, e-mail: cikunib58@mail.ru Гончарова С.А.
Аспирант кафедры физиологии факультета естествознания, эксперт-нутрициолог лаборатории нут-рициологии и экологии НИИ комплексных проблем Адыгейского государственного университета, Майкоп, e-mail: lana_goncharova_2013@mail.ru Демченко Ю.А.
Старший преподаватель кафедры химии факультета естествознания, эксперт-биохимик лаборатории нутрициологии и экологии НИИ комплексных проблем Адыгейского государственного университет, Майкоп, e-mail: jesi-001 @mail.ru
Оптимизация алгоритма построения градуировочных графиков при флуориметрическом методе определения селена в питьевой воде с использованием разных калибровочных образцов
(Рецензирована)
Аннотация. Оптимизирован алгоритм построения градуировочных графиков при флуориметрическом методе определения селена в питьевой воде с использованием разных калибровочных образцов, таких как селен металлический, селенистокислый натрий, государственные стандартные образцы (ГСО).
Ключевые слова: флуориметрический метод определения селена, калибровочный раствор, селен металлический, селенистокислый натрий, ГСО.
Tsikunib A.D.
Doctor of Biology, Professor, Head of Chemistry Department of Natural Science Faculty, Director of Research Institute of Complex Problems, Adyghe State University, Maikop, e-mail: cikunib58@mail.ru Goncharova S.A.
Post-graduate student of Physiology Department of Natural Science Faculty, Expert-Nutritionist of Laboratory of Nutrition and Ecology of Research Institute of Complex Problems, Adyghe State University, Maikop, e-mail: lana_goncharova_2013@mail.ru
Demchenko Yu.A.
Senior Lecturer of Chemistry Department of Natural Science Faculty, Expert-Biochemist of Laboratory of Nutrition and Ecology of Research Institute of Complex Problems, Adyghe State University, Maikop, e-mail: jesi-001@mail.ru
Optimization of calibration schedule algorithm by a fluorimetric method of selenium definition in potable water with the use of different calibration sampes
Abstract. The algorithm is optimized for creation of calibration schedules by a fluorimetric method of selenium definition in potable water with the use of different calibration samples, such as a metal selenium, sodium selenite and the state standard samples (SSS).
Keywords: fluorimetric method of selenium definition, calibration solution, metal selenium, sodium selenite, the state standard samples (SSS).
Введение. В настоящее время для определения селена в объектах окружающей среды (воде, почве) и пищевых продуктах предлагают ряд методов: нейроно-активационный анализ, атомно-абсорбционную спектрометрию, эмиссионную спектроскопию и масс-спектрометрию с индуктивно связанной плазмой, газовую и жидкостную хроматографии, рентгено-флуоресцентный анализ и другие, но наиболее приемлемым, чувствительным и высокоспецифичным считается флуориметрический метод [1-3]. Однако отдельные этапы реализации данного метода, в частности проведение калибровки прибора, являющейся неотъемлемой частью количественного химического анализа и важным инструментом обеспечения достоверности и заданной точности измерительной информации, вызывает вопросы [4, 5].
Так, анализ действующих нормативных документов (НД) [6-8], патента [9] и статьи [3] на методы определения селена в продовольственном сырье и пищевых продуктах, питьевой
воде показал несоответствия метрологическим требованиям по приготовлению градуировоч-ных растворов и калибровки приборов.
Известно, что аналитической задачей флуориметрического метода определения селена является переведение селена (VI) (в такой форме селен преимущественно находится в природных водах, пищевых продуктах и биоматериалах) в селен (IV), который образует с 2,3-диаминонафталином комплексное соединение 4,5-бензопиазоселенол (рис. 1).
2,3-диаминонафталин селенистая кислота 4,5-бензопиазоселенол Рис. 1. Образование 4,5-бензопиазоселенола Для этого пробы пищевых продуктов, продовольственного сырья и комбикормов тщательно измельчают, подвергают минерализации азотной кислотой [8] или смесью азотной и хлорной кислот [6]. Пробы питьевой воды минерализуют прибавлением концентрированной азотной и хлорной кислот и выпариванием до появления белых паров хлорной кислоты [7]. Далее идут этапы удаления следов азотной кислоты, восстановления селена (VI) в селен (IV) путем нагревания с концентрированной [7] или 6 М [6] соляной кислотой, конденсации селенистой кислоты с 2,3-диаминонафталином при рН 1-1,5 [6, 7] или 1,5-2,0 [1, 3], экстрагирования гексаном образовавшегося 4,5-бензопиазоселенола с последующим измерением интенсивности флуоресценции органического экстракта. Аналогичную обработку, после предварительного растворения в 0,1 М соляной кислоте, проходят калибровочные образцы, используемые для приготовления градуировочных растворов: ГСО, представляющий собой, согласно прописи производителей, селенистую кислоту, подкисленную азотной кислотой [8], селенистокислый натрий [6] и селен металлический, который предварительно превращается в селенистую кислоту путем нагревания с концентрированной азотной кислотой по следующей реакции:
35е0 + 4ИЫОъ + И20 = 3Н2$е+40ъ2 + 4N0. [7]
Получается, что, несмотря на то, что в исследуемых пробах селен находится преимущественно в органической форме и шестивалентном состоянии, а в калибровочных образцах - в минерализованной форме и четырехвалентном состоянии, и пробы, и калибровочные образцы проходят одинаковые этапы обработки, включающие минерализацию и перевод селена (VI) в селен (IV), что нецелесообразно. Как отмечают ряд авторов [10, 11], стандартные растворы селенистой кислоты, проходящие ту же обработку, что и пробы (плазма и сыворотка крови), не дают воспроизводимых результатов.
Согласно требованиям НД, калибровочный график рекомендуется строить по 5 сериям шкал и количество концентраций, представленных значащими цифрами в каждой шкале, должно быть не менее 5 [12]. Анализируемые методы предлагают проводить градуировку прибора по следующим концентрациям селена: 0,0 и 0,5 мкг [8], 0,0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,5 и 0,6 нмоль [7], 0,00; 0,02; 0,05; 0,10; 0,20; 0,30; 0,40; 0,50 мкг [8], 0; 5; 10; 20; 30; 40 нг [9]. Несомненно, алгоритм градуировки из одной значащей цифры, представленный в [8], не соответствует требованиям построения калибровочных графиков и не позволяет получить достоверных результатов.
В нормативном документе на метод исследования должны быть определены метрологические характеристики, такие как чувствительность метода, диапазон измерений, повторяемость (сходимость), воспроизводимость и др. Эти показатели тесно связаны с градуиро-вочным графиком. Однако несмотря на то, что все анализируемые НД основаны на использовании одного и того же метода определения селена, то есть флуоресцентного, установленные в них метрологические характеристики существенно отличаются (табл. 1).
Таблица 1
Метрологические характеристики, установленные в анализируемых НД
Метрологические характеристики
НД предел обнаружения диапазон измерений предел повторяемости (сходимости), r, % предел воспроизводи-мости, R, % относительное стандартное отклонение, % норма погрешности, %
[71 0,08 мкг/кг - - - 10 -
[81 0,1 мкг/дм 0,1-5 мкг/дм3 30 - - 25
[91 0,1-2,0 млн- 31 - - -
2,0-100 млн-1 20 - - -
[10] - - - - 10 -
В анализируемых нормативных документах указаны такие показатели, как «нижний предел обнаружения» [6], равный 0,08 мкг/кг, и «предел обнаружения» [7], составляющий 0,1 мкг/дм3. Диапазон измерений указан в [7] и лежит в пределах 0,1-5 мкг/дм3 с нормативом повторяемости не более 30%, а также в [8] и лежит в пределах 0,1-100 млн-1 (что соответствует 0,1-100 мг/кг) с нормативом повторяемости не более 31% в диапазоне измерений в интервале 0,1-2,0 млн-1 (0,1-2,0 мг/кг) и не более 20% - свыше 2,0-100 млн-1. В [7] и [9] диапазон измерений не указан, однако в разделе «обработка результатов» отмечено, что относительное стандартное отклонение в интервале от 1 до 600 мкг/кг составляет 10% (возможность сохранения метрологических характеристик в таком широком диапазоне измерений также не может не вызывать вопросы).
Как известно [4, 5, 13], прямолинейность градуировочного графика сохраняется только в интервале концентраций, указанных в методике. Продлевать градуировочную прямую выше указанной в методике точки недопустимо. Также не рекомендуется находить значение концентраций испытуемого раствора ниже первой точки градуировочного графика, так как это определение несет большую погрешность. Согласно [7], первой точке градуировочного графика соответствует содержание селена в пробе 0,2 мкг/дм3, что незначительно выше заявляемой чувствительности метода, а последняя точка шкалы соответствует 5,0 мкг/дм3, что, в свою очередь, соответствует как заявленному диапазону измерений 0,1-5 мкг/дм3, так и назначению нормативного документа - определению общего содержания селена в питьевой воде на уровне ПДК, то есть не более 10 мкг/дм3.
Как уже было отмечено, в [6] диапазон измерений не указан, однако, согласно предложенной в методике формуле расчета и рекомендуемых навесках, первой точке градуировочного графика должна соответствовать концентрация 79 мкг/кг, а последней - 948 мкг/кг, то есть диапазон измерений селена должен лежать в пределах 79-948 мкг/кг (мкг/дм3), что не соответствует заявленному нижнему пределу обнаружения - 0,08 мкг/кг. Видимо, ошибка в формуле расчета.
Приведение концентраций, используемых в анализируемых методиках для приготовления градуировочных растворов к одинаковым единицам измерения, то есть мкг, показало, что максимальная концентрация градуировочного раствора в 0,5 мкг используется в [7] при соответствующем ему пределе измерения концентрации 5 мкг/дм3 (табл. 2).
Таблица 2
Соответствие максимальной концентрации градуировочного раствора пределу измерения, установленному в анализируемых НД
Метод Максимальная концентрация градуировочного раствора, мкг Предел измерения концентрации, мкг/дм3 или мкг/кг
[71 0,1 600*
[81 0,5 5,0
[101 0,04 600*
Примечание: * - взято из раздела «обработка результатов»
Максимальная концентрация, используемая для приготовления градуировочных растворов в [6] и [9], в 5 раз и 12,5 раза меньше, чем в [7], а предел измерений в 120 раз больше, чем в [7], что невозможно реализовать без многократного разбавления пробы, однако такая процедура в НД не прописана.
Для приготовления градуировочных растворов при определении содержания химических элементов в пищевых продуктах, биоматериалах и объектах окружающей среды, согласно требований НД на методы испытаний, в качестве калибровочного образца могут использоваться чистые элементы и (или) их соли различного по критериям химической чистоты статуса (ч.д.а., х.ч., о.с.ч.), а также государственные стандартные образцы (ГСО) [11]. Так, при флуориметри-ческом определении селена в питьевой воде, согласно [7], для приготовления калибровочных растворов используется селен металлический (ч), в продуктах питания, согласно [6], - натрий селенистокислый (Na2SeO3, ч), в пищевых продуктах, продовольственном сырье и комбикормах - ГСО [8], причем ни в одном НД не заложена возможность альтернативного выбора калибровочного образца, что ограничивает применение НД испытательными лабораториями.
С учетом выявленных на основании проведенного теоретического анализа неточностей и несоответствий, затрудняющих применение анализируемых НД на практике, целью исследования явилась оптимизация алгоритма построения градуировочных графиков из разных калибровочных образцов селена для определения селена в питьевой воде флуориметриче-ским методом.
Материалы и методы. Для проведения исследований использовали следующие реактивы: вода дистиллированная; азотная кислота (х.ч.); хлорная кислота (х.ч.); 2,3-диаминонафталин (имп.); ЭДТА динатриевая соль 2-водная (трилон Б, ч.д.а.); соляная кислота (ч.д.а.); н-гексан (ч.д.а.), градуировочные образцы: ГСО состава раствора ионов селена (ГСО № 7340-96, растворитель 0,1 М азотная кислота); селен элементарный (о.с.ч). Исследования проводили на следующем оборудовании: биохимический анализатор жидкости Флюо-рат-02-АБЛФ-Т; анализатор жидкости Эксперт-001 (модификация рН-метр-иономер); весы аналитические OHAUS; электрическая плита.
Объектом исследования явилась вода питьевая, отобранная согласно ГОСТ Р 515932000 из крана внутренней водопроводной сети лаборатории. Отобранная проба была поделена на три лабораторные пробы и исследована по [8] в контрольном (КМSeMeT) и опытном (ОМSeгco и ОМSeмeт) вариантах, которые отличались тем, что во втором случае калибровочные растворы готовили, согласно схемам 1 а и 1 б соответственно.
Согласно схеме 2а, для построения градуировочного графика в ряд стаканов вместимостью 50 см3 отбирали 0,0; 0,1; 0,5; 1,0; 3,0; 5,0 см3 рабочего градуировочного раствора селе-нистокислого натрия (схема 2а) или ГСО (схема 2б) массовой концентрации 0,1 мкг/см3, что соответствует 0,00; 0,01; 0,05; 0,10; 0,30; 0,50 мкг селена. Растворы доводили в первых пяти стаканах до 5 см раствором соляной кислоты молярной концентрации эквивалента 0,1 моль/дм3. В каждый стакан приливали по 5 см3 дистиллированной воды и 1 см3 раствора трилона Б с массовой долей 2%. Растворы оставляли на 5 мин и затем доводили pH до одинакового уровня в пределах 1,5-2,0 или 10%-ым раствором аммиака, или раствором соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм3. К подготовленной пробе приливали 1 см3 свежеприготовленного раствора 2,3-диаминонафталина с массовой долей 0,1%, перемешивали и нагревали на кипящей водяной бане в течение 5 мин. После охлаждения раствор пере-
33
носили в делительную воронку вместимостью 50-100 см , приливали 5 см гексана. Комплекс селена экстрагировали в течение 1 мин и давали отстояться до разделения фаз. Водную фазу отбрасывали, а органическую фазу фильтровали через фильтр «белая лента» в пробирку с притертой пробкой, в которой и хранили до перенесения в кюветы флуориметра. Флуори-метрирование проводили не позднее чем через 1-2 ч.
Схема 2б отличалась от предыдущей тем, что в качестве калибровочного образца использовался металлический селен, который переводили в селенистую кислоту путем растворения в концентрированной азотной кислоте.
Каждая лабораторная проба исследована в пяти повторностях (n=5) в условиях повторяемости с применением одной серии реактивов, одного набора мерной посуды, одним оператором. Статистическую обработку результатов проводили с использованием критериев Стьюдента. При статистической обработке результатов показатели выражали как M±m (средняя величина и стандартное отклонение).
Обсуждение результатов исследования. Как показали результаты исследования, гра-дуировочные графики, построенные опытным путем (ОМ&мет), характеризуются более высокими калибровочными параметрами, выраженными коэффициентами линейного уравнения зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации селена в растворе и коэффициентами аппроксимации (рис. 2а), 2б)), что может быть связано с тем, что повторная минерализация неорганической формы селена, то есть кипячение с концентрированной азотной и хлорной кислотами ГСО раствора селенита натрия или же селенистой кислоты, полученной из металлического селена путем нагревания с концентрированной азотной кислотой, приводит к определенным потерям селена.
-yl 0,367я I 0,00g -/2 0..311К+0.002 Y3 0.340k < 0.010 -■/4 0.268k i 0.008 y5 0,336* < 0,00^
Соде ржание селе на, мкг
уср 0,311я I 0,002 R3 0,876
-у1-0,Э£1н û.û I -у. 0,360* + 0,009 у.-. I'. Ï4.4* t ll.fllX -yi= 0,323*4 0,011 yj LUJljX+U.UUy
СО^СрЖЛНИе СеЛЙНЛ, ГЛК
I: <•*■■ * |] IKHJ ;
а) контрольный метод (КМ^емет) б) опытный метод (ОМ^емет)
Рис. 2. Калибровочные графики по определению содержания селена
Исключение этапов минерализации и перевода селена (VI) в селен (IV) при приготовлении градуировочных растворов не снизило интенсивность образования флуоресцентного комплекса с 2,3-диаминонафталином и позволило получить более стабильные результаты.
Сравнительный анализ показал, что калибровочные графики, полученные на основе ГСО и селенистокислого натрия, имеют более высокие калибровочные параметры, чем при использовании металлического селена (табл. 3).
Таблица 3
Калибровочные параметры градуировочных графиков, полученных на основе разных калибровочных образцов
Калибровочный образец Уравнение линейной зависимости, y=ax+b Коэффициент аппроксимации, R2
Металлический селен (ОМ5^емет) уСр=0,360х+0,009 R2=0,980
Селенит натрия (ОМ^есоль) уСр=0,352х+0,015 R2=0,984
ГСО (ОМ&гсо) уСр=0,329х+0,011 R2=0,991
Исходя из полученных данных, калибровочный график, построенный на основе ГСО по предлагаемому алгоритму (схема 1 б), был использован для проведения исследований по определению содержания селена в питьевой воде. Полученные результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4
Метрологические характеристики определения селена в питьевой воде контрольным и опытным методами
Метод X1 X2 X3 X4 Х5 Содержание селена, мкг/дм3 (M±m) Повторяемость, r
Норматив, не более, % Фактическое значение,%
КМSeмет 2,25 2,24 2,20 2,60 2,05 2,26±0,20 30 23,6
ОМ^егсо 2,16 2,32 2,25 2,45 2,58 2,35±0,16 17,7
Как видно из таблицы, среднее содержание селена в питьевой воде, исследованной контрольным методом, составило 2,26±0,20 мкг/дм3, а опытным - 2,35±0,16 мкг/дм3. При этом повторяемость КМ&мет ниже предела повторяемости результатов на 6,4%, а ОМ&ГСО - 12,3%.
Хронометраж времени проведения анализа показал, что исключение этапов минерализации и повторного этапа перевода селена (VI) в селен (IV) при приготовлении градуировоч-ных растворов позволило сократить время проведения анализа в среднем на 61,2±2,9 мин.
Вывод. Разработан оптимальный алгоритм построения градуировочных графиков приготовления градуировочных растворов из разных калибровочных образцов селена при флуо-риметрическом определении селена в питьевой воде, отличающийся исключением этапа минерализации калибровочных образцов и повторного перевода селена (VI) в селен (IV). Применение данного алгоритма позволило получить более высокие калибровочные параметры и сократить время проведения анализа.
Примечания:
1. Особенности количественного определения селена в биоматериалах / В.В. Ермаков [и др.] // Вестник Тюменского государственного университета. 2010. № 3. С. 206-214.
2. Орозбаева Ж.М., Чоноев. Н. Окружающая среда и распространение биогенного элемента селен // Вестник ИГУ. 2010. № 26(1). URL: http://nbisu.moy.Su/_ld/9/942_Orozbaeva_J.M-C.pdf (дата обращения: 03.06.2015)
3. Модифицированный флуориметрический метод определения селена / З.Т. Бутько [и др.] // ВЕСЦ1 НАЦЫЯНАЛЬНАЙ АКАДЭМ11 НАВУК БЕЛАРУС1. 2013. № 1. С. 50-54.
4. Р 50.2.028-2003 ГСИ. Алгоритмы построения гра-дуировочных характеристик средств измерений состава веществ и материалов и оценивание их погрешностей (неопределенностей). Оценивание погрешности (неопределенности) линейных градуиро-вочных характеристик при использовании метода наименьших квадратов. Введ. 03-05-14. М., 2003.
5. Яценко Е.А. Методика градуировки измерительных приборов по набору стандартных образцов с применением специализированного программного продукта: автореф. дис. ... канд. тех. наук. Сургут, 2010. 22 с.
6. Методы контроля. Химические факторы. Определение селена в продуктах питания: МУК от 24.07.1995 № 4.1.033-95: постановление Госком-санэпиднадзора России от 24.07.1995. М., 1995.
7. ГОСТ 19413-89. Вода питьевая. Метод определения массовой концентрации селена. Введ. 199007-01. М., 1990.
8. М 04.33.2004 Пищевые продукты и продовольственное сырье, комбикорма и комбикормовое сырье. Методика измерений массовой концентрации селена флуориметричсеким методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02». Спб., 2013.
9. Способ флуориметрического определения селена в биологических объектах или пищевых продуктах: пат. 12675 РБ; заявл. 08.05.08; опубл. 30.12.09, Бюл. № 6. 4 с.
10. Способ определения концентрации селена в крови: пат. 2482492 РФ; заявл. 20.05; опубл. 20.05.13, Бюл. № 14. 8 с.
11. Паркер С. Фотолюминесценция растворов. М.: Мир, 1972. 504 с.
12. ГСОЕИ. Градуировочные характеристики средств измерений. Методы построения. Оценивание погрешностей: МИ 2175-91. М., 1992.
13. Беднаржевский С.С., Назин А.Г., Шевченко Н.Г. Линейная калибровка экоаналитических измерительных комплексов по набору стандартных образцов: учеб. пособие. Сургут: Изд-во СурГУ, 2004. 71 с.
References:
1. Features of the quantitative determination of selenium in biomaterials / V.V. Ermakov [et al.] // Bulletin of Tyumen State University. 2010. No. 3. P. 206-214.
2. Orozbaeva Zh.M., Chonoev N. Environment and distribution of biogenic element selenium // Bulletin of Irkutsk State University. 2010. No. 26 (1). URL: http://nbisu.moy.su/_ld/9/942_Orozbaeva_J.M-C.pdf (date of access: 06/03/2015)
3. Modified fluorimetric method for the determination of selenium / Z.T. Butko [et al.] // Bulletin of the National Academy of Sciences of Belarus. 2013. No. 1. P. 50-54.
4. P 50.2.028-2003 GSI. Algorithms for constructing the calibration characteristics of measuring devices of the the composition of substances and materials and evaluation of their errors (uncertainties). Estimation of the error (uncertainty) of linear calibration characteristics when using a least squares method. Introd. 3.5.14. M., 2003.
5. Yatsenko E.A. Methods of calibration of measuring devices on a set of standard samples with the use of specialized software: Diss. abstract for the Cand. of Technical Sciences degree. Surgut, 2010. 22 pp.
6. Methods of control. Chemical factors. Determination of selenium in food products: MUK of 24.07.1995 No. 4.1.033-95: Resolution of the Russian State Committee of sanitary-and-epidemiologic supervision of 24.07.1995. M., 1995.
7. GOST 19413-89. Drinking water. Method for determination of the mass concentrations of selenium. Introduced 07/01/1990. M., 1990.
8. M 04.33.2004 Food products and food raw materials, compound feed and feed raw materials. Methods of measurement of the mass concentration of selenium by fluorimetric method by fluid analyzer «Flyuorat-02». SPb., 2013.
9. The method of fluorimetric determination of selenium in biological objects or food products: Pat. 12675 RB; Appl. 08.05.08; Publ. 30.12.09, Bul. No. 6. 4 pp.
10. A method for determination of the concentration of selenium in blood: Pat. 2482492 RF; Appl. 20.05; Publ. 05.20.13, Bul. No. 14. 8 pp.
11. Parker S. Photoluminescence of solutions. M.: Mir, 1972. 504 pp.
12. GSOEI. Calibration characteristics of measuring devices. Methods of construction. Estimation of errors: MI 2175-91. M., 1992.
13. Bednarzhevsky S.S., Nazin A.G., Shevchenko N.G. Linear calibration of eco-analytical measurement systems on a set of standard samples: a manual. Surgut: SurSU Publishing House, 2004. 71 pp.
