CC BY
257
цитология
© коллектив авторов, 2012
удк 618.14-006.04-076.5
Е. А. Коган1, Н. м. Файзуллина1, Т. А. Демура1, А. в. Козаченко1, О. А. Павленко2, О. А. Пермякова2
оптимальным скрининг рака шейки матки - сочетание метода пцр в реальном времени (прибор cobas 4800) с жидкостной цитологией
'Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. в. И. Кулакова минздравсоцразвития России, 2ООО «Рош Диагностика Рус», москва
Цель исследования - оценить чувствительность комбинированного метода диагностики предрака и рака шейки матки (РШМ), сочетающего жидкостную цитологию с выявлением клинически значимого количества ДНК ВПЧ в цервикальных образцах шейки матки.
Цервикальные образцы 62 женщин были собраны в среду для жидкостной цитологии и окрашены по Папаниколау в системе B&D TriPath. Результаты оценивали по классификации Bethesda. Параллельно в том же материале проведена ПЦР в реальном времени на приборе Cobas 4800. Для уточнения цитологического диагноза ASC-US, а также при L-SIL и H-SIL, проводили иммуноцитохимическое (ИЦХ) выявление онкомаркеров pl6INK4a и Ki-67 на дополнительно приготовленных стеклах из того же материала, полученного методом жидкостной цитологии.
B результате проведенного исследования выявили ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) онкогенных типов в 12 случаях из 13 H-SIL (92,3%) и в 3 из 4 L-SIL (75%). У 31 пациентки с ASC-US не выявлено клинически значимого количества ДНК ВПЧ, что коррелировало с результатами ИЦХ исследований, в которых экспрессия маркераp16INK4a отсутствовала. У 5 (55,6%) из 9 пациенток в возрасте 21-24 лет с цитологическим диагнозом NILM выявили ДНК ВПЧ.
Цитологическое исследование выявило у 53 (85,5%) из 62 пациенток атипичные клетки плоского эпителия шейки матки. Комбинированный метод выявил патологию у 58 (93,5%) пациентов. Дополнение цитологического исследования ВПЧ тестированием на приборе Cobas 4800 повысило чувствительность диагностики с 85,5 до 93,5%. Мы рекомендуем проводить ВПЧ-тестирование на приборе Cobas 4800, так как данная система позволяет выявлять 14 высокоонкогенных типов ВПЧ с отдельным генотипированием ВПЧ 16-го и 18-го типов.
Ключевые слова: полимеразная цепная реакция с учетом результатов в режиме реального времени, cobas-тест, жидкостная цитология, иммуноцитохимическое исследование, онкомаркеры р16 (INK4a) и Ki-67
Ye.A. Kogan, N.F. Fayzullina, T.A. Demura, A.V. Kozatchenko, O.A. Pavlenko, O.A. Permyakova THE OPTIMAL SCREENING OF CERVIX CANCER: COMBINATION OF POLYMERASE CHAIN REACTION TECHNIQUE IN REAL TIME (COBAS 4800 DEVICE) WITH LIQUID CYTOLOGY The study was organized to assess the sensitivity of combined technique of diagnostics of pre-cancer and cervix cancer consisted of liquid cytology and detection of clinically significant amount of Human Papillomavirus DNA in cervical samples of cervix. The cervical samples of 62 women were collected to into medium for liquid cytology and Papanikolau's stained in the system B&D TriPath. The results were evaluated according the Bethesda classification. Concurrently, with the same material, the polymerase chain reaction technique in real time was applied using the Cobas 4800 device. To specify the cytological diagnosis ASC-US and under L-SIL and H-SIL the immunocitochemical detection of oncomarkers p16INK4a and Ki-67 was implemented using additionally prepared glass of the same material obtained by the liquid cytology technique.
The study detected Human Papillomavirus DNA of oncogenic types in 12 cases out of 13 H-SIL (92.3%) and in 3cases out of 4 L-SIL (75%). In 31 female patients with ASC-US no clinically significant amount of Human Papillomavirus DNA was detected. This result correlated with the results of immunocitochemical analyses where expression ofmarker p16INK4a was not present. In 5 out of 9 female patients (55.6%) aged 21-24 years with cytological diagnosis NILM Human Papillomavirus DNA was detected. The cytological analysis detected in 53 out of 63 female patients the atypical cells of cervix pavement epithelium (85.5%). The combined technique detected pathology in 58 female patients (93.5%). The cytological analysis of Human Papillomavirus was complemented by testing with Cobas 4800 device because this system permits to detect 14 highly oncogenic types of Human Papillomavirus with separate genetic typing of Human Papillomavirus of 16 and 18 types.
Key words: polymerase chain reaction technique in real time, cobas-test, liquid cytology, immunocitochemical analysis, oncomarkers p16INK4a and Ki-67
Цитологический метод, традиционный или жидкостной, является основным методом ранней диагностики предрака и рака шейки матки (РШМ). Внедрение национальных про-
Для корреспонденции:
Коган Евгения Алтаровна, д-р мед. наук, проф., рук. первого
патолого-анатомического отд-ния
Адрес: 117997, Москва, ул. акад. Опарина, 4
Телефон: 8-926-533-12-71
E-mail: kogancvg@gmail.com
грамм цитологического скрининга позволило многим странам снизить заболеваемость РШМ. Однако, имея высокую специфичность, чувствительность метода уступает молекулярным методам диагностики. Выявление ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) имеет большую чувствительность в диагностике предрака и РШМ по сравнению с цитологией, что дает возможность ранней детекции предраковых изменений шейки матки и, следовательно, уменьшает риск развития РШМ [2, 3], уменьшает смертность женщин, вселяет оптимизм в тех из них, кто получил отрицательный результат при цитологическом скрининге и подтвердил его ВПЧ-тестированием.
ЦИТОЛОГИЯ
Кроме того, ВПЧ-тестирование позволяет безопасно расширить интервалы скрининга [4, 5]. Превышающая чувствительность ВПЧ-теста над цитологическим позволяет выявлять железистый рак - аденокарциному и аденокарцино-му in situ, что чрезвычайно важно из-за роста этого заболевания в последние годы. Таким образом, ВПЧ-тестирование, проводимое отдельно или вместе с цитологическим исследованием, дает возможность надежного, более эффективного скрининга РШМ.
Важным аспектом использования ВПЧ-тестирования, как для первичного скрининга, так и в качестве дополнения к жидкостной цитологии, является мониторинг ВПЧ-положительных женщин. Такие женщины, в возрасте 30 лет и старше, имеющие цитологическое заключение NILM (negative for intraepithelial lesion or malignancy) должны через 1 год сдать анализы повторно [6]. Такой подход представляется не совсем оптимальным, поскольку лишь у небольшой группы женщин остается вероятность развития инвазивного рака в период между скринингами [7, 8]. Для улучшения ВПЧ-тестирования предложено дополнительное исследование с целью выявления тех, у кого риск развития цервикального рака высокий, и кого немедленно нужно отправлять на кольпоскопию. Таким исследованием является генотипирование ВПЧ16 и ВПЧ18, поскольку именно эти два генотипа ассоциированы с 70% всех инвазивных цервикальных карцином [9].
Существуют несколько ВПЧ-тестов, выявляющих клинически значимые количества вирусной ДНК высоко онкоген-ных типов: Hybrid Capture 2 (Qiagen, USA), Cervista HPV HR (Hologic, USA) и cobas HPV тест (Roche Molecular Systems, USA) на базе платформы Cobas 4800 [1]. Cobas 4800 - полностью автоматизированная система, которая выявляет наличие ДНК ВПЧ по трем отдельным каналам: индивидуально ДНК ВПЧ16, ДНК ВПЧ18 и общий пул ДНК других 12 высокоон-когенных генотипов ВПЧ (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68) [10]. При сравнении с Hybrid Capture 2 cobas HPV тест демонстрирует такую же высокую эффективность, при этом не имеет перекрестной реактивности с генотипами ВПЧ низкого онкогенного риска. Ярким преимуществом теста cobas HPV является выявление отдельно ВПЧ16 и ВПЧ18 [12].
Исследования по изучению эффективности комбинированного метода диагностики РШМ, сочетающего в себе жидкостную цитологию и cobas-тест, немногочисленны [11].
Следует отметить, что ВПЧ-инфекция сама по себе недостаточна для развития РШМ, но данные о дополнительных нарушениях, необходимых для развития инвазивного процесса, малочисленны. Ряд последних работ направлены на решение этой проблемы. Полученные результаты важны не только для понимания биологии ВПЧ-заболеваний [12], но и для выявления потенциальных диагностических и лечебных маркеров. Например, гиперэкспрессия рецепторов онкоста-тина М изменяет поведение клеток [14] и, следовательно, его торможение может иметь терапевтическое значение. Кроме того, Drosha был определен в качестве потенциального онкогена цервикального канцерогенеза [15] через свое участие в регуляции микроРНК, которые все чаще замешаны в ВПЧ-ассоциированном раке [16, 17]. Эти успехи дополняют известные взгляды на канцерогенез, такие как роль ВПЧ-инфекции, позволяют глубже понимать роль известных молекулярных нарушений и дают возможность нового понимания путей развития опухолей.
Цель исследования - оценить чувствительность комбинированного метода диагностики предрака и РШМ, сочетающего жидкостную цитологию с выявлением клинически значимого количества ДНК ВПЧ в цервикальных образцах шейки матки.
Материалы и методы. Цервикальные образцы 62 женщин, средний возраст которых составил 30 лет, были со-
Результаты теста cobas HPV
Цитологический диагноз Количество образцов Отрицательный результат ВПЧ 16 типа ВПЧ 18 типа ВПЧ других 12 типов ВПЧ 16 типа и других 12 типов
H-SIL 13 1 8 - 2 2
L-SIL 4 1 1 - 2 -
ASC-US 36 31 1 - 3 1
NILM 9 4 1 - 3 1
Общее количество 62 37 11 10 4
браны в среду для жидкостной цитологии и окрашены по Папаниколау в системе B&D TriPath. Результаты оценивались по классификации Bethesda. У 9 (14,5%) женщин из 62 цитологическое исследование не выявило патологических изменений (NILM по системе Bethesda), у 36 (58,1%) пациенток обнаружили цитологию ASC-US, у 4 (6,5%) - L-SIL, у 13 (20,9%) - H-SIL. Параллельно в том же материале проведена ПЦР на приборе Cobas 4800, позволяющая выявить 14 типов ВПЧ высокого онкогенного риска. Для уточнения цитологического диагноза Asc-us, а также при L-sIL и H-SIL, проводили иммуноцитохимическое (ИЦХ) выявление онкомаркеров p16INK4a и Ki-67 на дополнительно приготовленных стеклах из того же материала, полученного методом жидкостной цитологии.
Результаты и обсуждение. В результате проведенного исследования выявили ДНК ВПЧ онкогенных типов в 12 случаях из 13 H-SIL (92,3%) и в 3 из 4 L-SIL (75%) (см. таблицу).
При подозрении на H-SIL в 8 случаях был выявлен вирус только 16-го типа, в 2 случаях - суммарный пул 12 онкогенных типов, в других двух - сочетанное поражение вирусом 16-го типа и онкогенными типами 31-68. В 3 случаях L-SIL выявили ДНК ВПЧ: в 1-м случае 16-го типа, в 2 - онкогенные типы 31-68 ВПЧ. У 31 пациентки с ASC-us не было выявлено клинически значимого количества ДНК ВПЧ, что коррелировало с результатами ИЦХ исследований, в которых экспрессия маркера p16INK4a отсут-
40 -i
35 -
30
25 -
20
15 -
10
5
H-SIL
L-SIL ASC-US
NILM
Отрицательный результат ВПЧ 16 типа+ВПЧ других 12 типов У//А ВПЧ других 12 типов Щ ВПЧ 16 типа
Частота выявления типов ВПЧ при разных вариантах патологии шейки матки.
0
ствовала. У 5 (55,6%) из 9 пациенток в возрасте 21-24 лет с цитологическим диагнозом NILM выявили ДНК ВПЧ: в одном случае 16-го типа ВПЧ, в 3 - 31-68 типы ВПЧ, в одном - сочетанное поражение вирусом 16-го типа и он-когенными типами 31-68. Мониторинг этих 5 пациенток требует особенно внимательного отношения. Частота выявления ДНК ВПЧ при различных вариантах патологии шейки матки представлена на рисунке.
Заключение. Цитологическое исследование выявило у 53 (85,5%) из 62 пациенток атипичные клетки плоского эпителия шейки матки. Комбинированный метод выявил патологию у 58 (93,5%) пациентов. Дополнение цитологического исследования ВПЧ-тестированием на приборе Cobas 4800 повысило чувствительность диагностики с 85,5 до 93,5%.
Полученные нами данные согласуются с результатами американских коллег, показавших на большой выборке женщин (47 208), что жидкостная цитология выявляет патологические процессы в шейке матки в 53,3% случаев, в то время как при комбинированном методе чувствительность возрастает до 96,7% [1].
Мы рекомендуем проводить ВПЧ-тестирование на приборе cobas 4800, так как данная система позволяет выявлять 14 высокоонкогенных типов ВПЧ с отдельным генотипировани-ем ВПЧ 16-го и 18-го типов. Наряду с тестом Hybrid Capture 2 (Qiagen, USA), тест cobas HPV (Roche Molecular Systems, USA) сертифицирован FDA (Food and Drug Administration, USA) и СЕ (Conformité Européenne) и успешно применяется в странах Европы и США для диагностики папилломавирус-ной инфекции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Castle P. E., StolerM. H., Wright T. C. Jr. et al. Performance of carcinogenic human papillomavirus (HPV) testing and HPV16 or HPV18 genotyping for cervical cancer screening of women aged 25 years and older: a subanalysis of the ATHENA study // Lancet Oncol. -2011. - Vol. 12. - N 9. - P. 880-890.
2. AnttilaA., Kotaniemi-TalonenL., LeinonenM. et.al. Rate of cervical cancer, severe intraepithelial neoplasia, and adenocarcinoma in situ in primary HPV DNA screening with cytology triage :randomised study within organised screening programme // BMJ. - 2010. - Vol. 340. - P. 1804.
3. Ronco G., Giorgi-Rossi P., Carozzi F. et.al. Efficacy of human papillomavirus testing for the detection of invasive cervical cancers and cervical intraepithelial neoplasia: a randomised controlled trial // Lancet Oncol. - 2010. - Vol. 11, N 3. - P. 249-257.
4. Dillner J., Rebolj M., Birembaut Ph. et al . Long term predictive values of cytology and human papillomavirus testing in cervical cancer screening: joint European cohort study // BMJ. - 2008. - Vol. 337. - P. 1754-1761.
5. KjaerS. K., FrederiksenK., MunkC. et al. Long-term absolute risk of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 or worse following human papillomavirus infection: role of persistence // J. Natl. Cancer Inst. -2010. - Vol. 102. - P. 1478-1488.
6. Wright T. C. Jr., Massad S. L., Dunton C.J. et al. 2006 Consensus guidelines for the management of woman with abnormal cervical screening tests // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2007. - Vol. 197. - P. 346-355.
7. Kitchener H. C., Almonte M., Thomson C. et al. HPV testing in combination with liquid-based cytology in primary cervical screening (ARTISTIC): a randomised controlled trial // Lancet Oncol. - 2009.
- Vol. 10. - P. 672-682.
8. Kinney W., Ffetterman В., Cox J. T. et. al. Characteristics of 44 cervical cancer diagnosed following Pap-negative, high risk HPV-positive screening in routine clinical practice // Gynecol. Oncol. - 2011. -Vol. 121. - P. 309-313.
9. de Sanjose S., Quint W. G. V., Alemany L. et al. Human papillomavi-rus genotype attribution in invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional worldwide study // Lancet Oncol. - 2010. - Vol. 11.
- P. 1048-1056.
10. Castle P. E., Sadorra M., Lau Т. et al. Evaluation of a prototype real-time PCR assay for carcinogenic human papillomavirus (HPV) detection and si^ltaneous HPV genotype 16 (HPV16) and HPV18 genotyping // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47. - P. 3344-3347.
11. StolerM. H., Wright T. C., Sharma A. et al. High-risk human papillomavirus testing in women with ASC-US cytology // Am. J. Clin. Pathol. - 2011. - Vol. 135. - P. 468-475.
12. Lindemann M. L. M., Domínguez M. J. R., de Antonio J. C. et al. Analytical Comparison of the cobas HPV Test with Hybrid Capture 2 for the Detection of High-Risk HPV Genotypes // The Journal of Molecular Diagnostics. - 2012. - Vol. 14, N 1. - P. 65-70.
13. Peter M., Couturier J., Hupe P. et.al. Frequent genomic structural alterations at HPV insertion sites in cervical carcinoma // The Journal of Pathology. - 2010. - Vol. 221. - P. 320-330.
14. WinderD. M., Chattopadhyay A., Muralidhar В. et al. Overexpression of the oncostatin M receptor in cervical squamous cell carcinoma cells is associated with a pro-angiogenic phenotype and increased cell motility and invasiveness // The Journal of Pathology. - 2011.
- Vol. 225. - P. 448-462.
15. Muralidhar В., Winder D. M., Murrey M. et al. Functional evidence that Drosha overexpression in cervical squamous cell carcinoma affects cell phenotype and microRNA profiles // The Journal of Pathology. - 2011. - Vol. 224. - P. 496-507.
16. Farazi T. A., Spitzer J. I., MorozovP. et al. miRNAs in human cancer // The Journal of Pathology. - 2011. - Vol. 223. - P. 102-115.
17. Li Y., Wang F., Xu W. et al. Progressive miRNA expression profiles in cervical carcinogenesis and identification of HPV-related target genes for miRNA-29 // The Journal of Pathology. - 2011. - Vol. 224.
- P. 484-495.
Поступила 15.07.12
