CC BY
17
УДК 535.8
ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ КЛЕТОЧНО-ТКАНЕВЫХ ИМПЛАНТАТОВ, НАХОДИВШИХСЯ В УСЛОВИЯХ НЕВЕСОМОСТИ
П. Е. Тимченко1, Е. В. Тимченко1, Л. А. Жердева1, Н. В. Белоусов1, Л. Т. Волова2, В. В. Россинская2, В. В. Болтовская2, Е. И. Пугачев2
В работе представлены результаты исследований процесса интеграции клеток в составе клеточно-тканевых имплантатов, находившихся в условиях невесомости, с помощью комплекса методов конфокальной флуоресцентной микроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния (КР). Изучено влияние факторов космического полета на процессы жизнедеятельности клеток опорно-двигательной системы человека.
Ключевые слова: интеграция клеток, имплантат, флуоресценция, космический полёт, конфокальная микроскопия, спектроскопия комбинационного рассеяния.
Введение. Изучение процессов жизнедеятельности и развития соединительных и опорных тканей живых организмов in vitro в условиях космического полета ведётся с начала освоения космоса [1, 2]. Десятилетия исследований показали, что отсутствие гравитации меняет морфологическое состояние клеток, их пролиферативную активность, экспрессию генов и другие внутриклеточные процессы. Особенно выражены эти эффекты у дифференцированных клеток, таких как остеоциты, фибробласты, миоциты, эн-дотелиальные клетки. Эти изменения проявляются нарушениями опорно-двигательной системы у космонавтов [3].
Соответственно, дальнейшее изучение влияния физических факторов в условиях невесомости на активность культур клеток хондробластического дифферонов является особенно актуальным. Одним из информативных методов исследования состояния
1 Самарский государственный аэрокосмический университет имени академика С. П. Королева (национальный исследовательский университет), 443086 Россия, Самара, ул. Московское шоссе, 34; e-mail: timpavel@mail.ru.
2 Институт экспериментальной медицины и биотехнологий (ИЭМБ) СамГМУ, 443079 Россия, Самара, ул. Гагарина, 20.
клеток, заселенных в бионоситель, является метод конфокальной, в том числе конфокальной флуоресцентной микроскопии [3], который обеспечивает увеличение контраста изображения за счет применения сфокусированного излучения и диафрагмирования рассеянного излучения в плоскости наблюдения. К достоинствам лазерной флуоресцентной конфокальной микроскопии относятся возможности селективной визуализации отдельных органелл при использовании соответствующих флуорофоров и наблюдения клеток в естественных условиях. Благодаря этому флуоресцентная конфокальная микроскопия оказалась оптимальным методом для изучения состояния клеток и самого имплантата [4, 5].
Целью работы являлось применение оптических методов для оценки жизнеспособных клеток в составе клеточно-тканевых имплантатов, находившихся в условиях невесомости.
Материалы и методы. Для исследований была использована биологическая модель (патент №143101 от 30.12.2013) [6], которая представляет собой трехмерный пористый бионоситель (деминерализованная губчатая кость, основными этапами обработки которой являются воздействие ультразвуком, раствором соляной кислоты и лиофилизация), заселенный культурами клеток и помещенный в целиком заполненную ростовой средой герметично закрытую емкость. Клетки выращивали в лаборатории культуры клеток ИЭМБ СамГМУ: образцы фибробластов культивировались из дермы человека по методике Гринберга и соавторов [7], а образцы хондробластов - из гиалинового хряща человека по методике Бриттберга [8] в собственной модификации.
Клетки высевали на 3В-носитель в дозе 2000 клеток на 1 мм3. Полученный клеточный продукт помещали в пробирки (БреИаг, Сербия) объемом 4 мл, заполненные ростовой средой, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ООО "Биолот", Россия). Экспериментальный материал в количестве 12 пробирок был доставлен на борт непилотируемого космического аппарата (КА) "БИОН-М" № 1 и культивировался в течение всего полёта (30 суток) при постоянной температуре 37 °С с использованием научной аппаратуры "Биоконт-Б". Для сопоставления результатов аналогичная группа образцов культивировалась и на Земле с периодичностью контроля 1 неделя. Дополнительным контролем чистоты опыта служил пустой 3В-носитель, помещённый в аналогичную ростовую среду. рН ростовой среды контролировали непосредственно перед полётом и сразу же после доставки материала в ИЭМБ.
Изучение процесса интеграции клеток в костный имплантат проводилось с помощью стенда флуоресцентной конфокальной микроскопии, описанного в работах [4, 5]. В ка-
честве флуорофора использовался пропидиум йодид (propidium iodide, PI Sigma Aldrich США), который концентрируется в цитоплазме клеток, полоса его возбуждения имеет максимум на 535 нм, а полоса испускания на 617 нм.
В качестве вспомогательного метода исследования структурного состава бионосителя был использован стенд для спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) [9] (обработка данных в программной среде Mathematica'8).
Рис. 1: Микроснимки костного имплантата, находившегося в наземных условиях (верхние) и в условиях невесомости (нижние): до обработки (слева), после обработки (справа) в программе "ЛЫБОЯ Щ"( размер снимков 400 х 400 мкм).
Результаты исследований. Далее представлены микроснимки костных бионосителей (рис. 1), находившихся в наземных условиях и в условиях невесомости на космическом аппарате (КА), с зарегистрированными хондробластами. Для контроля заселённости экспериментальных имплантатов была использована следующая формула:
иа п
V = тт, Ьа = п х а, Ьь
где п - относительная площадь клеток, п - среднее количество клеток на 400 х 400 нм микроснимка, а - средняя площадь ьтой клетки, Ьь - площадь кадра. В результате в объектах, побывавших в условиях невесомости, интегрированные в имплантат клетки были зарегистрированы на 3% поверхности имплантата, а в объектах, побывавших в наземных условиях, - на 20%. Экспериментально выявлено, что средняя площадь
Рис. 2: (а) спектр КР бионосителя; (б) зависимость коэффициента М от глубины слоя.
клетки а в космосе на 23% меньше, чем в наземных экспериментах. А также количество зарегистрированных клеток в наземных образцах выше.
Для проверки однородности имплантатов были проведены эксперименты по исследованию их поверхности. Характерный спектр КР (усреднённый по 7 спектрам, погрешность в пределах 10%) костного имплантата (снято с приповерхностного слоя), находившегося в наземных условиях, представлен на рис. 2 с соответствующими линиями (табл. 1). Как можно видеть из рисунка, в спектре линии 960 и 1070 см-1 слабо выражены, что говорит о низком содержании минеральных компонент образца.
Также было проведено послойное исследование спектров КР бионосителя размером 4 х 5 х 4 мм (контролировалась центральная область слоя) с шагом 1.0 мм ± 0.1 мм. В качестве контролируемых критериев было выбрано отношение интенсивности линии 960 и 1660 см-1 (соотношение минеральной и органической составляющих):
М = /(Р°4)3- ,
1аш1ё1
На рис. 2(б) представлена зависимость параметра М в зависимости от глубины сло-ёв образца бионосителя (0, 1; 2; 3 и 4 мм, 0 и 4 мм - противоположные поверхности транплантата), находившегося в наземных условиях.
Результаты ЛДГ-теста. Проводились биохимические исследования экспериментального материала: активность ЛДГ (лактатдегидрогеназа - фермент, вырабатывающийся при жизнедеятельности клеток) в среде была выше в 7 раз в образцах, побывавших в условиях невесомости, что говорит об активности клеток в космосе. В космическом эксперименте активность хондробластов была выше почти в 2 раза, чем активность фибробластов.
Таблица 1
Расшифровка спектров КР
N k, см 1 Колебание, составляющая
1 429 V2 (PO4)3-, гидроксиапатит
2 527, 581, 609 V4 (PO4)3-, гидроксиапатит
3 648 V4 (PO4)3-, гидроксиапатит
4 852 V (C-C), пролин
5 875 V (C-C), гидроксипролин
6 921, 936 V (C-C), пролин
7 960 V1 (PO4)3-, гидроксиапатит
8 1006 V (C-C), фенилаланин
9 1031, 1045 V3 (PO4)3-, гидроксиапатит
10 1070 V1 (CO3)2- тип B, (PO4)3- замещен (CO3)2-
11 1100 V1 (CO3)2- тип A, OH-замещен (CO3)2-
12 1204 ш (CH2, тирозин и гидроксипролин
13 1242, 1268 V (C-N) и 8 (N-H), Амид III
14 1340 V (C-N) и 8 (N-H), Амид III
15 1445 8 (CH2, CH3), коллаген
16 1530, 1570 8 (N-H) и V (C-N), Amide II
17 1660 V (C=O), Амид I (коллаген I типа)
18 1740, 1774 V (C=O), липиды
Таблица 2
Активность ЛДГ мкм/мл в модельных объектах с клетками
Тип клеток Космический эксперимент Наземный эксперимент
В среде В лизате Суммарная В среде В лизате Суммарная
Хондробласты 416.0 35.5 451.5 57.0 0 57.0
Фибробласты 246.4 15.6 262.0 156.7 0.2 156.8
Выводы. Конфокальный флуоресцентный микроскопический анализ показал, что клетки проникают в имплантат, расселяясь по его внутренней поверхности в сообщающиеся открытые поры с частым закреплением клеток в микропорах. Клетки в космическом эксперименте выявлены на 3-х % поверхности имплантата, а в наземном эксперименте - на 20-ти%. В результате анализа выявлено, что в условиях невесомости клетки,
несмотря на большую активность (согласно анализу активности ЛДГ), значительно хуже прикрепляются к имплантату, при этом продолжают находиться в питательной среде вне имплантата. Проведено исследование неоднородности состава и структуры имплантатов с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния. Полученные выводы подтверждены результатами морфологического анализа и биохимических методов контроля.
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Н. А. Константинова, Кандидатская диссертация в области биологических наук (ГНЦ РФ-ИМБП РАН, Москва, 2008).
[2] М. Г. Таирбеков, Молекулярные и клеточные основы гравитационной чувствительности (М., изд-во Института медико-биологических проблем, 2002).
[3] Robert H. Webb, Rep. Prog. Phys. 59, 427 (1996).
[4] Л. Т. Волова, В. В. Болтовская, В. В. Россинская и др., Технологии живых систем 10(8), 21 (2013).
[5] P. E. Timchento, E. V. Timchenko, V. P. Zakharov, et al., Pacific Science Review 3, 182 (2011).
[6] Л. Т. Волова, В. В. Россинская, В. В. Болтовская и др., "Устройство для культивирования клеток во время беспилотного космического полета". Патент РФ на полезную модель № 143101 от 30.12.2013.
[7] К. Н. Гринберг, В. И. Кухаренко, В. Н. Ляшко и др., Культивирование фибробластов человека для диагностики наследственных болезней ( Л., Наука, 1988).
[8] M. Brittberg, A. Lindahl, A. Nilsson, et al., Nord Med. 110(12), 330 (1995).
[9] E. V. Timchenko, P. E. Timchenko, L. T. Volova, et al., Proc. SPIE 9198, 17 (2014).
По материалам IV Международной молодежной научной школы-конференции "Современные проблемы физики и технологий".
Поступила в редакцию 12 мая 2015 г.
