CC BY
27
УДК 616.741-009.54:575.224.22
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ЧИСЛА КОПИИ В ГЕНАХ БМЖ, SMN2, NAIP С ТЯЖЕСТЬЮ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ У ПАЦИЕНТОВ СО СПИНАЛЬНОЙ МЫШЕЧНОЙ АТРОФИЕЙ
Б. О. Камалиева, А. В. Боровикова, А. А. Нагимтаева., А. Б. Шевцов, Г. Ж. Абильдинова
АО «Национальный научный центр материнства и детства» Национального медицинского холдинга, г. Астана, Казахстан
Резюме. Пациентам с подозрением на спинальную атрофию проведена мультиплексная пробо-зависимая лигазная реакция, для выявления мутаций в генах БМЫ1, БМЫ2 и ЫД!Р. Из 42 обследованных пациентов диагноз подтвержден в 16 случаях, что составило 39 %. Более чем, в 90 % случаев выявлена гомозиготная делеция 7-го и 8-го экзонов гена БМЫ1.
Ключевые слова: спинальная мышечная атрофия, мутациив генах БМЫ1, БМЫ2 и ЫД!Р.
ВВЕДЕНИЕ
Спинальная мышечная атрофия (СМА) -полиморфная группа наиболее часто встречающихся нейромышечных заболеваний. СМА характеризуется дегенерацией а-мотонейронов передних рогов спинного мозга, в результате чего развиваются симметричные параличи конечностей и туловища, гипотония, нарушение сердечной проводимости, задержка умственного развития и др. симптомы. Предполагается, что патогенез заболевания определяется персистиро-ванием эмбрионального апоптоза в этих клетках. СМА является наиболее распространенным фатальным аутосомно-рецессивным заболеванием с уровнем заболеваемости по оценкам различных специалистов примерно 1 случай на 10000 населения. Частота гетерозиготного носительства составляет 1 на 40-60 человек [1, 2, 3].
Известны три клинические формы СМА: - тип ! - тяжелая форма (болезнь Верднига-Гофф-мана, ОМ!М: 253300), проявляется в первые 6 месяцев жизни и приводит к смерти в первые два года;
- тип II - средняя форма (OMIM: 253550), пациенты живут более 4 лет;
- тип III - ювенильная форма (болезнь Кугельбер-га-Веландера, OMIM: 253400) прогрессирующая мышечная слабость развивается после 2 лет.
В основе всех трех форм заболевания лежат мутации гена, картированого в области хромосомы 5q12.2-q13.3, получившего название SMN - Survival Motor Neuron («ген выживаемости мотонейронов») и имеет центромерную (SMN1) и теломерную (SMN2) копии. Данная область представлена инвертированным повтором и включает четыре гена (SMN, NAIP, SERF1A (H4F5), GTF2H2), мутации в которых могут иметь значение в развитии заболевания или модифицировать тяжесть его течения.
Белок, синтез которого контролируется геном SMN, играет важную роль в метаболизме нервных клеток, особенно в биогенезе ядерных рибонуклеопроте-инов и в процессах транспорта РНК по аксонам. Мутации гена SMN приводят к дефициту белка, от которого и зависит эффективность работы моторных нейронов передних рогов спинного мозга.
5
о
rN
ГО rN
5
а
I-
U ф
00
DEFINITION OF ASSOCIATION BETWEEN NUMBER OF COPIES IN GENES SMN1, SMN2, NAIP AND SEVERITY OF DISEASES IN PATIENTS WITH SPINAL MUSCULAR ATROPHY
B. O. Kamaliyeva, A. V. Borovikova, A. A. Nagimtaeva., A. B. Shevtsov, G. Z. Abildinova
National Research Center of Maternal and Childhood at the National Medical Holding Republic of Kazakhstan, Astana, KZ
Summary. Multiplex sample-dependent ligase reaction for the detection of mutations in SMN1, SMN2 and NAIP genes was carried out in patients with suspected spinal atrophy. The diagnosis was confirmed in 16 from 42 observed patients, accounting 39 %. In more than 90 % cases homozygous deletion of the 7th and 8th exons of the SMN1 gene was revealed.
Key words: spinal muscular atrophy, mutations in the SMN1, SMN2 and NAIP genes.
6
о
rN
m rN
5
a
0У
£
i-
u Ф 00
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
Оригинальные исследования
Ген SMN1 (OMIM: 600354) имеет 9 экзонов с совокупной длиной около 20 тысяч п.н. Более 95 % больных с 1-3 типами СМА имеют делецию 7 и (или) 8 экзо-на SMN1 гена в гомозиготном состоянии. Остальные больные являются компаунд-гетерозиготами по де-леции в одной копии гена SMN1 и точковой мутации в другой. Мутация в теломерной копии гена SMN может быть необходимым, но недостаточным условием возникновения заболевания, так как описаны здоровые люди, имеющие такую мутацию в гомозиготном состоянии[4, 5, 6].
Частота "de novo" генных конверсий составляет 2 %. Хромосомы с данным типом мутаций могут передаваться из поколения в поколение. Если генетическая конверсия захватывает гомологичные гены, то это приводит к формированию химерных генов. Образование подобных структур показано и для генов SMN 1 и SMN 2. Наиболее частым является случай, когда 3' конец гена SMN 1 "прикреплен" к 5' концу гена SMN 2. Существуют и другие варианты химерных генов SMN 1 и SMN 2 при СМА [7, 8].
Второй ген, расположенный в этой области, -NAIP (ген ингибитора нейронального апоптоза, OMIM: 600355) также имеет копии. Данный ген содержит 16 экзонов и имеет длину около 60 тысяч п.н. Деле-ции одного или нескольких экзонов этого гена в гомозиготном состоянии встречаются у 40-70 % больных с 1 типом СМА и у 14-22 % больных с 2 и 3 типом СМА. У подавляющего числа больных, имеющих делецию 7 и 8 экзонов SMN гена в гомозиготном состоянии, обнаруживается также делеция и в гене NAIP. В настоящее время общепринятой является точка зрения о том, что отсутствие гена NAIP показывает значительную протяженность делеции в локусе СМА, которая может являться дополнительным критерием, модифицирующим тяжесть заболевания [9, 10].
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучить взаимосвязь между числом копий генов SMN1, SMN2, NAIP и тяжестью течения заболевания методом мультиплексной пробазависимой лигазной реакции с последующей амплификацией у пациентов со спинальной амиотрофией.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования послужили образцы ДНК, выделенной из крови пробандов. Для оценки влияния числа копий генов локуса 5q13 на тяжесть течения проксимальной СМА I-III отобраны образцы ДНК пациентов, обратившихся для медико-генетической консультации. Пациенты отобраны на основе критериев Европейского консорциума по изучению нервно-мышечных заболеваний.
Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови выполнено с помощью набора реактивов для выделения Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) по протоколу производителя.
Определение числа копий генов SMN1, SMN2, NAIP,SERF1A (H4F5), GTF2H2 осуществлено методом мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции с последующей амплификацией (MLPA) с использованием генетического анализатора 3730xl DNA Analyzer. Математическую обработку результатов проводили с помощью программы Coffalyser V.3, представленной в свободном доступе на сайте MRC-Holland (www. mlpa.com).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Молекулярно-генетическое исследование для выявления мутаций в генах SMN1, SMN2 и NAIP было проведено 42 пациентам из неродственных семей с подозрением на спинальную атрофию. Диагноз подтвержден в 16 случаях, что составило 39 %.
Как видно из материалов таблицы 1, все пациенты СМА имеют делецию экзонов 7-8 гена SMN1 в гомозиготном состоянии. У трех пациентов со СМА I типа в 100 % случаев выявлены делеции 7 и 8 экзонов SMN1, и не отмечается увеличение числа копий SMN2, что говорит о тяжести течения данного типа заболевания и короткой продолжительности жизни пациентов.
Следует заметить, что у четырех пациентов со СМА II типа, в 75 % случаев встречались делеции 7 и 8 экзонов гена SMN1 и увеличение числа копий гена SMN2, и только в 25 % случаев делеции 7 и 8 экзонов гена SMN1. Белковый продукт гена SMN2 не может полностью компенсировать отсутствие экспрессии поврежденного гена SMN1, однако то небольшое количество полноценного транскрипта, продуцируемого
Таблица 1
Результаты MLPA-анализа у пациентов со спинальной мышечной атрофией
Типы СМА I тип II тип III тип Всего
Количество выявленной патологии (n) 3 4 9 16
Del 7 ex SMN1 ( %) 1 (33,3 %) - - 1 (6,3 %)
Del 7 ex SMN1 и увеличение числа копий SMN2 ( %) - 1 (25 %) 2 (22,2 %) 3 (18,7 %)
Del 7 и 8 ex SMN1 ( %) 1 (33,3 %) 1 (25 %) 1 (11,1 %) 3 (18,7 %)
Del 7 и 8 ex SMN1 и увеличение числа копий SMN2 ( %) - 2 (50 %) 6 (66,6 %) 8 (50 %)
Del 7 exSMN1 и NAIP5 ( %) 1 (33,3 %) - - 1 (6,3 %)
1 J
II II
Л j 1Ъ! и . * * я I ? и Я И И и Н Н П Ii tt i
шШйпШШШПШ
niiiiiii
фф
й
t и и и I и
jjilSSlSgSliBfc?!»
ШШШШШШЩШ
i Й ii д Z: z й с i -в. =■ t а - « ? » rt - t х- с- - -
^КПНА-Л lyt« jUIHMii I Г Jp I lirli.lii
7
о
rN
m rN
5
Рис. 1. Результаты MLPA-анализа у пациента с III типом спинальной мышечной атрофией
а £
I-
u Ф 00
геном SMN2, способно смягчать тяжесть течения заболевания у больных, имеющих увеличенное число копий гена SMN2 [4, 7].
В то же время, у девяти пациентов СМА III типа -в 89 % случаях преобладали делеции 7 и 8 зкзонов гена SMN1 и увеличение числа копий гена SMN2, в 11 % случаев выявлены делеция 7 и 8 зкзонов гена SMN1.
На рисунке 1 приведен пример электрофореграм-мы пациента с болезнью Кугельберга-Веландера, где отмечается делеция экзонов 7-8 гена SMN1 и увеличение числа копий гена SMN2. Результаты интерпретировались по отсутствию пиков, соответствующих экзонам 7-8 гена SMN1, и увеличению пиков экзонов 7-8 гена SMN2 в 1,5 раза относительно реферсных значений.
Известно, что увеличение числа копий гена SMN2 у пациентов с более мягким течением СМА может быть обусловлено генной конверсией посредством пол-
ного или частичного копирования гена SMN2 в тело-мерную часть и способно смягчать тяжесть течения заболевания у больных. Установлено, что у больных со СМА II-III типов число копий гена SMN2 больше, чем у лиц с I типом заболевания.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, при молекулярно-генетическом исследовании пациентов с классическими формами спинальной амиотрофии более чем в 90 % случаев выявляется гомозиготная делеция 7-го и 8-го экзонов гена SMN1. Это соответствует данным большинства авторов и позволяет заключить, что в нашей стране данный тип мутации также является ведущей причиной развития аутосомно-рецессивной спинальной амиотрофии детского возраста .
КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
ЛИТЕРАТУРА
Оригинальные исследования
1. Zeng G, Zheng H. et al. Analysis and carrier screening for copy numbers of SMN and NAIP genes in children with spinal muscular atrophy // Hum. Genet. 2014. Vol. 31(2). P. 152-5.
2. Russman B.S. Spinal muscular atrophy: clinical classification and disease heterogeneity // Journal of child neurology. 2007. Vol. 22, №8. P. 946-951.
3. Маретина, М. А., Киселев А. В., Железнякова Г. Ю. и др. // Медицинская генетика. 2012. Т.11, № 4. C. 25-28.
4. Yoon S, Lee CH, Lee KA. Determination of SMN1 and SMN2 copy numbers in a Korean population using multiplex ligation-dependent probe amplification // Korean J Lab Med. 2010. Feb. 30 (1). P. 93-6.
5. Ogino S., Wilson R.B. Spinal muscular atrophy: molecular genetics and diagnostics // Expert Rev. Mol. Diagn. 2004. Vol. 4, №1. P. 15-29.
6. Забненкова В. В., Дадали Е. Л., Поляков А. В. Модифицирующие факторы, оказывающие влияние на тяжесть течения спинальных мышечных атрофий I-Мтипов // Медицинская генетика. 2011. Т. 10, № 5. С. 15-21.
7. Arkblad E.L, Darin N, Berg K. Multiplex ligation-dependent probe amplification improves diagnostics in spinal muscular atrophy // Neuromuscul Disord. 2006. Dec.16 (12). P. 830-8.
8. Ермилова Е.В. и др. Количественный анализ экспрессии генов: Уч. пособие. СПб: ТЕССА, 2010. 104 с.
9. Alias L., Bernal S. et al. Mutation update of spinal muscular atrophy in Spain: molecular characterization of 745 unrelated patients and identification of four novel mutations in the SMN1 gene // Hum. Genet. 2009. Vol. 6. P. 29-39.
10. Jedrzejowska M., Milewski M., Zimowski J. et al. Phenotype modifiers of spinal muscular atrophy: the number of SMN2 gene copies, deletion in the NAIP gene and probably gender influence the course of the disease // Acta Biochimica Polonica. 2009. Vol. 56, №1. P. 103-108.
11. Интернет-ресурс http://mrc-holland.com.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Камалиева Бакытгуль Омаровна - врач-цитогенетик отделения лабораторной диагностики АО «Национальный научный центр материнства и детства» Национального медицинского холдинга.
г. Астана. 010000, пр. Туран, 32, г. Астана. Тел. 8 (7172) 704464; е-mail: bakytgul09@mail.ru.
Боровикова Анна Викторовна - врач-цитогенетик отделения лабораторной диагностики АО «Национальный научный центр материнства и детства» Национального медицинского холдинга.
010000, пр. Туран, 32, г. Астана, Казахстан. Тел. 8 (7172) 704464; е-mail: milanya_s@mail.ru.
Нагимтаева Алмагуль Аманжоловна - кандидат медицинских наук, врач-генетик отделения лабораторной диагностики АО «Национальный научный центр материнства и детства» Национального медицинского холдинга. 010000, пр. Туран, 32, г. Астана, Казахстан. Тел. 8 (7172) 704464; е-mail: almanja@mail.ru.
Щевцов Александр Борисович - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник национальной научной лаборатории коллективного пользования РГП «Национальный центр биотехнологии» Министерства образования и науки Республики Казахстан. 010000, ул. Валиханова, 13/1, Астана, Казахстан.
Тел. +7(7172)214020; e-mail: ncbshevtsov@gmail.com
Абильдинова Гульшара Жусуповна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая отделением лабораторной диагностики АО «Национальный научный центр материнства и детства» Национального медицинского холдинга. 010000, пр. Туран, 32, г. Астана, Казахстан.
Тел. 8 (7172) 704464; е-mail: labgen-astana@mail.ru.
ABOUT AUTHORS
Kamaliyeva Bakytgul Omarovna - cytogeneticist of laboratory diagnostics department of National Research Center at Maternal and Childhood at the National Medical Holding Republic of Kazakhstan. 010000, Turan av., 32, Astana, Kazakhstan. Ph. 8 (7172) 704464; е-mail: bakytgul09@mail.ru.
Borovikova Anna Viktorovna - cytogeneticist of laboratory diagnostics department at National Research Center of Maternal and Childhood at the National Medical Holding Republic of Kazakhstan. 010000, Turan av., 32, Astana, Kazakhstan. Ph. 8 (7172) 704464; е-mail: milanya_s@mail.ru.
Nagimtaeva Almagul Amanzholovna - candidate of medical sciences, geneticist of laboratory diagnostics department at National Research Center of Maternal and Childhood at the National Medical Holding Republic of Kazakhstan. 010000, Turan av., 32, Astana, Kazakhstan. Ph. 8 (7172) 704464; е-mail: almanja@mail.ru.
Shevtsov Aleksandr Borisovich - candidate of biological sciences, leading researcher of the national scientific laboratory of collective use of National Center of biotechnology of the Ministry of Education and Science Republic of Kazakhstan. 010000, Ualikhanov str., 13/1 Astana, Kazakhstan. Ph. +7(7172) 214020; e-mail: ncbshevtsov@gmail. com
Abildinova Gulshara Zhusupovna - doctor of medical sciences, professor, head of laboratory diagnostics department at National Research Center of Maternal and Childhood at the National Medical Holding Republic of Kazakhstan. 010000, Turan av., 32, Astana, Kazakhstan. Ph. 8 (7172) 704464; е-mail: labgen-astana@mail.ru.
Статья поступила в редакцию 21.11.2014, принята в печать 20.03.2015
