CC BY
104
Вестник ДВО РАН. 2009. № б
УДК 543:547.917 Ю.Н.ЕЛЬКИН
Определение тетраацетата 1-дезокси-1-фтор-глюкопиранозида методом хромато-масс-спектрометрии
В связи с ошибкой в масс-спектре тетраацетата гексозилфторида-1 (отсутствие пика m/z 188) базы данных US NIST обосновывается достоверность исправленного спектра путем рационализации картины фрагментации его молекулярного иона при электронной ионизации. Выявлено, что масс-спектр этого соединения существенно отличается от близких по структуре О-гликозидов и даже от его гомолога — гексозилбромида, причиной чего является сильный индукционный эффект электроотрицательного атома фтора, вызвавшего специфическое распределение молекулярных ионов по энергиям.
Ключевые слова: идентификация, анализ, углеводы, хромато-масс-спектрометрия.
Identification of tetraacetate 1-desoxy-1-fluorine-glucopyranoside using the method of chromato-mass-spectrometry. Yu.N.EL’KIN (Pacific Institute Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).
In connection with a mistake in the mass spectrum of tetra-aceylated hexosylfluorine (lack of ion m/z 188) in US NIST database a reliability of the corrected mass-spectrum is grounded. It is done by means of improvement of fragmentation pattern of the molecular ion obtained under electron ionization. It is revealed that mass spectrum of this substance differs from similar O-glycosides and even from homologous hexosylbromine. The reason for such phenomenon is a strong induction effect of the electronegative fluorine atom, which caused a specific energy distribution of molecular ions.
Квy words: identification, analysis, carbohydrates, gas chromatography—mass spectrometry
Обнаружение и идентификация нано- и пикограммовых количеств органических веществ при контроле лекарственных препаратов, наркотических и иных подобных веществ, а также многочисленных веществ маркеров, индикаторов функционирования органов в медицинской диагностике и фармакинетике должны осуществляться с высокой степенью достоверности. Хромато-масс-спектрометрия, в технике которой масс-спектрометр сопряжен с газовым (ГХ-МС) или жидкостным (ЖХ-МС) хроматографами, является арбитражным методом. Достоверность идентификации вещества в ГХ-МС основывается на базе масс-спектров Национального бюро стандартов США, проверенных специальными компьютерными программами. В 1970-1980-х годах Национальный центр по молекулярной спектроскопии при СО АН СССР собирал спектральные данные и передавал в упомянутую базу. Автором в сотрудничестве с Центром подготовлены два каталога масс-спектров производных моносахаридов [1]. Недавно обнаружена не замеченная программой контроля ошибка достоверности в масс-спектре тетраацетата гексозилфторида-1 (рис. 1 а).
Это вещество не относится к индикаторам функционирования органов. Оно может появляться при биохимическом исследовании нарушений в строении сигнальных углеводных антенн функциональных белков (гликанов) в биомедицинской диагностике заболеваний, а также при изучении строения О-антигенов бактерий, вызывающих инфекционные заболевания. Гликаны поверхности всех эукариотических клеток, играющие решающую роль в определяющих биологических функциях и физиологических процессах,
ЕЛЬКИН Юрий Николаевич - кандидат химических наук, старший научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток). E-mail: yurielkin@piboc.dvo.ru
Рис. 1. Масс-спектры электронной ионизации 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-фтор-а,В-глюкопиранозида 1 (а); 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-бром-р,В-глюкопиранозида 2 (б)
изменяются при патологии и воспалениях [11]. Картина гликолизирования поверхности, являясь кодом клеточной физиологии на молекулярном и функциональном уровнях, становится все более четкой благодаря внедрению современных методов масс-спектромерии, с помощью которых можно распознавать гликан целиком. Этому достижению в значительной мере способствовал тот факт, что углеводный состав гликанов, N и О-связанных с белками эукариотов, уже был известен и ограничен 6 типами моносахаридов. В случае наружной мембраны прокариотических клеток, особенно природных грамотрицательных бактерий, в полисахаридной цепи молекул липополисахаридов открывают новые типы моносахаридов [12]. Методом ГХ-МС определяют моносахаридный состав углеводсодержащих соединений (гликоконъюгатов), для чего проводят их химическую деградацию с целью расщепления гликозидных связей и высвобождения моносахаридов. При кислотном расщеплении часть моносахаридов, кроме основной циклической пиранозной формы (рис. 1а), приобретает фуранозную форму (не показана). Многообразие моносахаридных форм может усложнить задачу их количественного анализа из-за возможного совпадения времен удерживания в газовом хроматографе, но оно повышает надежность идентификации моносахаридов по картине фрагментации в масс-спектрометре циклических форм моносахаридов, предварительно ацетилированных для придания летучести в сопряженном газовом хроматографе [4].
Биологически наиболее значимые моносахариды, такие как глюкозамин, эффективно высвобождаются из гликопротеинов и бактериальных полисахаридов плавиковой кислотой (ЫЕ-сольволиз) в метиловом спирте [9]. Благодаря последнему глюкозамин превращается в метилгликозид, устойчивый против атаки сольватных протонов. В качестве побочных продуктов ЫЕ-сольволиза упомянутых гликоконъюгатов образуются гексозилфториды, и это также делает их объектом аналитического интереса. В то же время масс-спектры тетраацетата гексозилфторида-1 в базе данных [1] и измеренном (рис. 1а) различаются тем, что в первом из них отсутствует пик 188. Техническая ошибка очевидна, но, принимая во внимание арбитражный статус масс-спектральных данных, следует обосновать легитимность введения этого потерянного иона в масс-спектр. Однако исправление ошибки
в масс-спектре тетраацетата гексозилфторида-1 предполагает необходимость обосновать достоверность уже всей картины его масс-спектра. Оказалось, что сведений о фрагментации молекулярных ионов (М+) тетраацетата гексозилфторида, образовавшихся в результате электронной ионизации, нет. Таким образом, определение этого соединения в продуктах HF-сольволиза методом ГХ-МС ставится под сомнение.
Известная фрагментация протонированных молекул гликозилфторидов, имеющих два уровня избыточной энергии благодаря использованию газ-реагентов i-C4H10 и CH4 в источнике химической ионизации, соответствовала этим энергиям [6]. Индукционный эффект атома фтора компенсирован протоном, что обеспечило ожидаемую картину фрагментации, определяемую преимущественно потерей молекул HF с последующим отрывом молекул AcOH и CH2CO. Подобный мотив фрагментации М+' показан и для ацетилированных арил-гликозидов при электронной ионизации [3]. Если принять во внимание данные о фрагментации при электронной ионизации тетраацетатов дезоксигексоз и расположение атома фтора при С2-, С3- и С4-атома кольца гексозы [7], следует ожидать заметного влияния отрицательного индукционного эффекта фтора на картину фрагментации ацетилированного пиранозного кольца [4]. Масс-спектры аналогичных гексоз с ОН и t-OBu группами при С1- атоме также были измерены в качестве моделей сравнения (не показаны) наряду с гек-созилбромидом: 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-бром-р,Б-глюкопиранозида 2 (рис. 1б). Энергия ионизации атома брома гораздо ближе к таковой для эфиров, чем для фтора. Поэтому масс-спектр гексозилбромида-2 очень напоминает спектры названных выше О-гликозидов и, особенно, масс-спектры арилгликозидов [3]; все вместе они поразительно отличаются от спектра гексозилфторида-1 (рис. 1а). Причина этого лежит в электронном строении атомов фтора и брома и поэтому в различии их влияния на атомы С1 и О5 (рис. 2).
Интерпретация масс-спектра гексозилфторида-1 для его определения методом ГХ-МС основана на концепции виртуальной функции распределения молекулярных ионов по содержанию избыточной внутренней энергии Р(Е) [8]. Интеграл функции условно разбит на секторы, отнесенные к М+' с определенной локализацией заряда, отражающей их рейтинг популяции. Такая модель позволила определить роль гетерогенных заместителей (иных, чем ОАс) на фрагментацию ацетилированных ациклических и циклических производных аминосахаров [2, 5]. С этой позиции можно представить три популяции М+' (рис. 2), фрагментация которых определяет картину спектра соединения 1, отличную от таковой для его гомолога 2. Положительный индукционный эффект атома Br на атом О5 молекул соединения 2 приводит к фрагментации его М+ с высокой скоростью в направлении образования оксониевого иона А1. Этот процесс также достаточно эффективно проходит при электронной ионизации всех О-гликозидов, особенно О-арилгликозидов. Электронная ионизация привносит в М+' значительную избыточную энергию, диссипация которой по колебательным уровням приводит к почти полному пилингу (от англ. pilling) родительского иона Ар m/z 331 до ионов АД m/z 169, А52 , m/z 127 и АД m/z 109 (рис. 1б). Здесь нижний индекс указывает на общее число ОАс групп, оторванных от родительского иона А1, а верхний - на число оторванных групп в виде молекул кетена (СН2СО) от общего числа отрывов. Ионы сквозного разрыва кольца, представленные только трехуглеродными ионами G, обладают существенно меньшей долей (рис. 1б). Обычно обильные в масс-спектрах ацетилированных сахаров ацетоксониевые ионы (a, b, c) оказались на удивление менее обильными, чем ионы G. Высокое сечение и низкая энергия ионизации ароматического агликона арилгли-козидов [3], как и атома брома, определяют эффективное стягивание электронов неподе-ленной пары атома О5 в М+' типа 3 (рис. 1б), так что ионный ток этих гликозидов полностью представлен оксониевыми ионами А, если не брать во внимание ничтожную долю ацетоксониевого иона a, m/z 43. Присутствие атома брома в молекуле отражается только в характерных дублетах очень низких пиков ионов Р и Е. Эти ионы формируются от доли слабо возбужденных М+ типа 4 (рис. 2), поэтому его избыточной энергии едва хватает на незначительную потерю ацетоксильных заместителей в боковой цепи.
Рис. 2. Вид виртуальной функции Р(Е), показывающей возможное распределение молекулярных ионов 3, 4 и 5 по содержанию в них избыточной внутренней энергии
В масс-спектре гексозилфторида-1 картина фрагментации М+' иная (рис. 1а). В спектре нет ионов А (М+'-Б), а доминируют ионы серии Р т^ 308, 307, 291, 248, 230, 205, 188, 168, 146 и 126, включая те, что теряют молекулы НБ наряду с ожидаемым отрывом нейтральных молекул НОАс и СН2СО. При этом нейтральные молекулы последних двух типов делают это с большей скоростью, чем первые, так что пики ионов Р-НЕ7, т^ 168 и т^ 126 доминируют в серии ионов Р. Их родительские ионы т^ 188 и т^ 146, сохраняющие атом фтора, также обусловливают высокие пики в спектре. Картина фрагментации прото-нированных молекул этого соединения прямо противоположна [6]. Подтверждением этого могут служить два низких пика ионов МН+, т^ 351 и 331. Ввод соединения 1 в ионный источник через ГХ-колонку в виде пара высокой концентрации обеспечил образование в стандартной ионизационной камере незначительных количеств ионов МН+, которые, с высокой скоростью [6] теряя НБ, формируют ион А т^ 331.
Несмотря на разность масс 20 Ба нескольких пар ионов, указывающую на потерю молекул НБ, их массы были точно измерены (188,0493; 168,0407 и 146,0375; 126,0292), что и подтвердило правомерность отнесения. Ацетоксониевые ионы а, Ь, с вносят сопоставимую долю в полный ионный ток. Описанный характер фрагментации гексозилфторида-1 следует отнести на счет высокого отрицательного индукционного эффекта атома фтора, в результате чего его связь с С1 атомом оказалось усиленной. Поэтому же популяция М+ типа 3 с зарядом на атоме О5 (рис. 2) оказалась незначительной, и заряд распределился по атомам кислорода ОАс-групп двух наиболее обильных популяций М+ (4 и 5) с высоким содержанием избыточной энергии. Из этого следует обильный пилинг ацетоксильных групп от данных двух типов М+', обозначенных символом Р. Избыток внутренней энергии этих ионов также обусловливает заметное присутствие в спектре трехуглеродных ионов в, образующихся при сквозном разрыве моносахаридного кольца. Следует также заметить, что ионы в представленны дублетами пиков: т^ 157, 158 или т^ 115, 116, а также, возможно, т^ 97, 98. Состав С7Н10О4 и С5Н8О3 нечетноэлектронных ионов т^ 158 и т^ 116, соответственно, определенный точным измерением масс, позволяет отнести их к гомологам ионов в, т^ 157 и 115. Наличие такого типа ионов в спектре может быть признаком их высокоэнергичных предшественников, тогда как в случае реакций, приводящих к перегруппировкам и потерям только нейтральных молекул НОАс/СН2СО или СН3СО
от ацетилированных метил(гексаметил)уронатов, предшественники обладают незначительным избытком энергии [11].
Таким образом, пик m/z 188 обусловлен фрагментным ионом гексозилфторида-1, его масс-спектр характеристичен и его отличие от позиционных изомеров [7] и от О-глико-зидов рационализировано с позиции функции распределения молекулярных ионов по содержанию избыточной внутренней энергии [8]. Масс-спектры соединений 1 и 2 получены на LKB 9000S ГЖХ-МС-системе прямым вводом образца 2 в источник ионов и образца 1 через ГХ стеклянную колонку (200 х 0,4 см) и заполнены хроматоном N-AW-DMCS (100-120 меш) с 1,5%-ным содержанием QF-1 жидкой фазы.
Точные измерения масс ионов выполнены В.Ю.Витковским (Иркутский институт органической химии СО РАН), которому автор выражает глубокую признательность.
ЛИТЕРАТУРА
1. Атлас масс-спектров органических соединений. Вып. 13, 18. Масс-спектры производных моносахаридов / под ред. В.А.Коптюга. Новосибирск: НИЦ МС СО АН СССР, 1984.
2. Елькин Ю.Н., Книрель Ю. А., Кочарова Н. А., Виноградов Е.В., Чапек К. Масс-спектры метилпиранозидов N-ацетилированных моно- и диаминосахаров // Биоорган. химия. 1994. Т. 17. С. 790-797.
3. Елькин Ю.Н., Воинов В.Г., Возный Я.В. Масс-спектры отрицательных и положительных ионов ацетатов арилгликозидов // Химия природ. соединений. 1984. № 5 . P. 623-628.
4. Елькин Ю.Н. Масс-спектры электронной ионизации ацетатов метил- и ацетилгликозидов гомологического ряда глюкопиранозы // Масс-спектрометрия. 2007. Т. 4. С. 119-124.
5. Елькин Ю.Н., Суриц В.Б. Определение сахаров в виде ацетатов метилоксимов методом хроматомасс-спектрометрии // Биоорган. химия. 1985. Т. 12. С. 391-398.
6. Каденцев В.И., Трушкина И.В., Чижов О.С., Возный Я.В. Поведение а- и p-гликозилфторидов в условиях мягкого и жесткого протеолиза в газовой фазе // Изв. АН СССР. Сер. Химия. 1987. С. 2580-2583.
7. Chizhov O.S., Kadentzev V.I., Zolotarev B.M. et al. Fluorinated carbohydrates. IX. The mass spectra of deoxy-fluorohexopyranose derivatives // Org. Mass Spectrom. 1971.Vol. 5. P. 437-445.
8. Howe J., Williams D.H., Bowen R.D. Mass Spectrometry: Principles and Applications. 2nd ed. N.Y.: McGrow-Hill, 1981. P. 37-40.
9. Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Mort A.J. Application of anhydrous hydrogen fluorine for the structural analysis of polysaccharides // Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. N.Y.: Acad. Press, 1989. Vol. 47. P. 167-202.
10. Kovacek V., Mihalov V., Kovac P. Identification of methyl(methyl-O-acetyl-O-methylhexopyranosid)urinates by mass spectrometry // Carbohyd. Res. 1977. Vol. 54. P. 23-31.
11. Liu X., McNally D.J., Nothaft H., Szymanski C.M., Brisson J.-R., Li J. Mass Spectrometry - Based Glycomics Strategy for Exploring N-Linked Glycosylation in Eukaryotes and Bacteria // Anal. Chem. 2006. Vol. 78. P. 6081-6087.
12. Nazarenko E.L., Komandrova N.A., Gorshkova R.P. et al. Structures of polysaccharides and oligosaccharides of some Gram-negative marine Proteobacteria // Carbohyd. Res. 2003. Vol. 338. P. 2449-2457.
