CC BY
44
УДК 619:616.98:578.842.1
UDC 619:616.98:578.842.1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕРОТИПОВОИ СПЕЦИФИЧНОСТИ
НЕГЕМАДСОРБИРУЮЩИХ ШТАММОВ ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ чумы свиней
Середа Алексей Дмитриевич д. б. н., профессор
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Покров, Россия
Инактивированные по инфекционности гамма-облучением культуральные препараты (у-ОП) из негемадсорбирующих штаммов вируса африканской чумы свиней (АЧС) приобретают способность индуцировать гемадсорбцию в культуре клеток костного мозга свиней (ККМС). Получены экспериментальные данные, свидетельствующие, что модификация реакции задержки гемадсорбции (РЗГАд) - реакция «снятия» гемадсорбции, индуцируемой у-ОП, может быть использована в научноисследовательской работе при определении серотипоспецифичности негемадсорбирующих изолятов вируса АЧС
Ключевые слова: ВИРУС АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ, РЕАКЦИЯ ЗАДЕРЖКИ ГЕМАДСОРБЦИИ, НЕГЕМАДСОРБИРУЮЩИЕ ШТАММЫ
DETECTION OF SEROTYPE SPECIFICITY OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS NON-HAEMADSORBING STRAINS
Sereda Alexey Dmitrievich Dr. Sci. Biol., professor
State Research Institution National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology of Russia, Russian Academy for Agricultural Science, Pokrov, Russia
Gamma irradiation-inactivated cultural preparations (•-IP) of African swine fever (ASF) non-haemadsorbing strains acquire a potential for haemadsorption induction in porcine bone marrow culture (PBMC). We have obtained some experimental data indicating that a modification of haemadsorption inhibition assay (HIA) which is an assay aimed at “removal” of y -IP-induced haemadsorption may be used in research works to determine serospecificity rates of ASF virus non-haemadsorbing isolates
Keywords: AFRICAN SINE FEVER VIRUS, HAEMADSORPTION INHIBITION, NON-HAEMADSORBING STRAINS
Вирус АЧС гетерогенен по составу генома, физико-химическим свойствам, патогенности, антигенности, способности индуцировать гемадсобцию. Разработаны методы классификации штаммов, основанные на генотипических или фенотипических свойствах вируса АЧС [1, 2, 4-6]. Наиболее распространенным способом, позволяющим типировать штаммы и изоляты in vitro по фенотипическому признаку, была и остается РЗГАд. По данным РЗГАд и иммунологических проб на свиньях депонированные во ВНИИВВиМ штаммы и изоляты вируса АЧС разделены на 11 групп, из которых 8 охарактеризованы как сероиммуногруппы с соответствующими референс-штаммами. Однако, наличие значительного количества выделенных в Африке от аборигенных свиней и аргасовых клещей негемадсорбирующих штаммов и изолятов вируса АЧС создает
существенные трудности в их сероиммунотиповой классификации.
Было обнаружено, что у-ОП, приготовленные из лизатов адгезированных клеток (А-клеток) культуры ККМС, инфицированных гемадсорбирующими и негемадсорбирующими штаммами вируса АЧС, индуцируют развитие гемадсорбции в культурах ККМС [3]. Представлялось целесообразным изучить это явление и попытаться определить возможность его использования для серотипирования негемадсорбирующих штаммов, изолятов, вариантов вируса АЧС.
Условия и методика проведения исследований
Двухсуточную культуру ККМС в 1.5 литровых клинских матрасах заражали вирусом АЧС с множественностью 10-4 ГАЕ50 или ТЦД50/клетка. Через 4-5 суток культивирования при з7 ОС вируссодержащую суспензию дважды осветляли центрифугированием при з000 g з0 мин, в надосадок добавляли полиэтиленгликоль с м.м. 6000 кДа до 5 % и через 24 часа инкубирования при 4 ОС осаждали преципитат при з000 g в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в 0.15 М NaCl в фосфатном буферном растворе с рН 7.2 (ФБР) в объеме 1:100 от исходного и переосаждали через раствор з0 % сахарозы на ФБР при 50000 g в течение 2 часов. Осадок ресуспендировали в ФБР в объеме 1:500 от исходного и подвергали у-облучению в дозе 25 кГрей.
РЗГАд ставили в двух модификациях:
з
1. По 0.5-1.0 мл сыворотки вносили в 9 см двухсуточной культуры
з
ККМС и затем добавляли по 1 см у-ОП в разведениях от 1:16 до 1:512. Учет реакции производили через 1-2 суток.
з
2. В чашки Карреля с 9 см двухсуточной культурой ККМС вносили по
з
1 см у-ОП в разведениях от 1:16 до 1:1024. В течение трех суток наблюдали за развитием гемадсорбции. На вторые или третьи сутки
з
отбирали чашки с гемадсорбцией, вносили в них по 0.5-1.0 см гомологичных и гетерологичных по сероиммунотипу антисывороток. Учет
реакции производили через 30-60 мин инкубирования при 37 ОС.
Интенсивность гемадсорбции у-ОП в культуре ККМС оценивали по бальной шкале при наблюдении в световой микроскоп с увеличением х400:
(0) — нет адсорбции эритроцитов;
(1) — по 3-9 эритроцитов адсорбированы на 3-8 А-клетках;
(2) — по 3-9 эритроцитов на более 50 % А-клеток;
(3) — более 10 эритроцитов адсорбированы на более 50 % А-клеток;
(4)— более 10 эритроцитов адсобированы на более 90 % А-клеток. Результаты исследований
В сравнительном аспекте была изучена способность индуцировать гемадсорбцию у-ОП из гемадсорбирующего вирулентного эпизоотического штамма Катанга-78 и его культуральных вариантов: вирулентного с атипичной («рыхлой») гемадсорбцией Катанга-105, авирулентных и негемадсорбирующих вариантов Катанга-149, Катанга-170, Катанга-190. Установлено, что у-ОП из негемадсорбирующих вариантов вируса АЧС в 2-
4 раза более активны в способности индуцировать гемадсорбцию, чем — из гемадсорбирующих (табл. 1).
Таблица 1 — Гемадсорбирующая активность у-ОП из штаммов и
вариантов вируса АЧС
Штамм, вариант вируса АЧС Интенсивность гемадсорбции различных в баллах в присутствии у-ОП в разведениях
1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024
Катанга-78 3 3 2 2 2 2 1 0
Катанга-105 3 2 2 1 1 1 1 0
Катанга-149 4 4 4 4 4 4 2 0
Катанга-170 4 4 3 3 3 3 3 2
Катанга-190 4 4 4 4 3 3 2 2
Свойство у-ОП из негемадсорбирующих штаммов и вариантов вируса АЧС индуцировать гемадсорбцию побудило изучить ее серологическую типоспецифичность. В экспериментах использовали препараты из негемадсорбирующего авирулентного варианта Катанга-149, выделенного в
лабораторных условиях из вирулентного гемадсорбирующего шт. Катанга-78, относящегося к 1 сероиммунотипу; негемадсорбирующего авирулентного шт. Мфуати-79, относящегося по данным иммунопробы на свиньях к 2 иммунотипу; негемадсорбирующего авирулентгого варианта Фнг, выделенного из вирулентного гемадсорбирующего шт. Ф-32, являющегося референс-штаммом 4 сероиммунотипа, а также активные в РЗГАд антисыворотки к референс-штаммам 1—4 серотипов с титрами 1:160-1:640. Эксперименты показали, что добавление гомологичных по сероиммунотипу вируса антисывороток снижает интенсивность гемадсорбции у-ОП, а в ряде случаев полностью задерживает в первой модификации или «снимает» во второй модификации гемадсорбцию. Данные, представленные в таблице, свидетельствуют, что реакция «снятия» гемадсорбции серотипоспецифична (табл. 2).
Таблица 2 — Результаты РЗГАд с у-ОП из различных штаммов и вариантов вируса АЧС (модификация «снятия»)
Антисыворотки Интенсивность гемадсорбции в баллах в
присутствии у-ОП
Сероиммунотип Разведения Катанга-149 Мфуати - 79 Фнг
1 : 64 2 4 2
1 : 128 1 4 2
1 1 : 256 0 2 1
1 : 512 0 2 1
1 : 1024 0 1 0
1 : 64 3 2 4
1 : 128 2 1 4
2 1 : 256 1 0 2
1 : 512 1 0 1
1 : 1024 0 0 0
1 : 64 3 4 4
1 : 128 2 4 2
3 1 : 256 1 3 2
1 : 512 1 2 1
1 : 1024 0 1 0
1 : 64 3 4 2
1 : 128 1 4 1
4 1 : 256 1 2 0
1 : 512 0 2 0
1 : 1024 0 1 0
В большей степени это показательно со шт. Мфуати-79. Обращает на себя внимание активность в данной реакции антисыворотки 1 серотипа по отношению к у-ОП из варианта Фнг 4 серотипа и антисыворотки 4 серотипа по отношению к у-ОП из варианта Катанга-149 I серотипа. Вероятно, это связано с антигенным сходством штаммов этих серотипов. Из проведенных 23 экспериментов в 17 реакция задержки или «снятия» гемадсорбции была серотипоспецифична (74 %), в 4 сомнительна (17.4 %) и в двух - не серотипоспецифична (8.6 %).
Постановка реакции во второй модификации более экономична в отношении расходования антисывороток и более специфична. Последнее связано с тем, что до момента учета реакции при постановке в первой модификации происходит связывание активных в РЗГАд антител гомологичной антисыворотки, т.к. в ряде экспериментов наблюдали восстановление гемадсорбции, индуцируемой у-ОП, через 24-36 часов после ее «снятия» гомологичной антисывороткой.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что модификация РЗГАд - реакция «снятия» гемадсорбции, индуцируемой у-ОП, может быть использована в научно-исследовательской работе при определении серотиповой принадлежности негемадсорбирующих изолятов вируса АЧС.
Список литературы
1. Антигенное различие изолятов вируса африканской чумы свиней в пределах одного серотипа по данным количественной радиоиммунопреципитации / Е.Г. Анохина, А.Д. Середа, Н.И. Митин, В.В. Макаров // Актуал. вопр. вет. вирусол. -Покров, 1995. - С. 138.
2. Балышев, В.М. Изучение гетеротиповых взаимодействий штаммов вируса АЧС ин витро и ин виво / В.М. Балышев, И.В Федорищев, М.В. Салина // Вирус. болезни с.-х. животных. - Владимир, 1995. - С. 230.
3. Середа, А.Д. Физико-химический полиморфизм вирусной популяции и дефектные интерферирующие частицы вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа, Н.А. Власов , В.В. Макаров // Вестник РАСХН. - 1997.- № 5. - С.67-70.
4. Середа А.Д., Макаров В.В. Идентификация изолятоспецифического гликополипептида вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа, В.В. Макаров // Ветеринария. - 1992. - № 1. - С. 22-24.
5. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней / И.Ф. Вишняков , Митин Н.И.; Петров Ю.И.; Черятников Л.Л.; Киселев А.В.; Бурлаков В.А.; Балышев В.М.; Федорищев И.В.; Моргунов Ю.П. // Актуал. вопр. вет. вирусол., Покров. - 1995. - С. 141-143.
6. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterization / Bastos ADS, Penrith M-L, Cruciere C. // Arch. Virol. - 2003. -vol.148. - Р 693 - 706.
