CC BY
24БИОТЕХНОЛОГИИ
УДК: 663.038; 57.042.5
Определение рациональных параметров акустической обработки с целью активации пивных дрожжей
Карпенко Дмитрий Валерьевич
ФГБОУ ВО «Московский государственный университет пищевых производств»
Корреспонденция, касающаяся этой статьи, должна быть адресована Карпенко Д.В., ФГБОУ ВО «Московский государственный университет пищевых производств», адрес: 125080, город Москва, Волоколамское шоссе, дом 11. E-mail: doka.65@mail.ru
В бродильных производствах, в том числе, в пивоварении актуальными являются задачи повышения бродильной активности дрожжей и/или интенсификация накопления их биомассы. Для их решения в настоящее время предлагаются различные способы, одним из которых может быть предварительная обработка волновыми или полевыми воздействиями. Ранее в наших исследованиях была показана принципиальная возможность интенсификации развития дрожжевых популяций за счет предварительной обработки звуком слышимого диапазона. Данная статья посвящена изучению влияния параметров акустической обработки на характеристики процесса культивирования дрожжей: прирост общего титра клеток, доля нежизнеспособных клеток, убыль веса среды культивирования. Определяли эффективность обработки засевных дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Saflager W34/70) звуком слышимого диапазона, варьируя параметры акустического воздействия: частоту звука, продолжительность обработки, амплитуду, расстояние от источника звука до обрабатываемого объекта (навески сухих дрожжей). Обработанными и необработанными звуком дрожжами засевали модельные среды (стерилизованные 5 %-ные растворы сахарозы) и вели культивирование при температуре 21-26 °С без принудительного перемешивания в течение 4 сут. Сразу после засева и ежедневно в процессе культивирования определяли контролируемые показатели. Рациональными параметрами предварительной акустической обработки засевных дрожжей были признаны: частота звука 2765 Гц, продолжительность 30 мин, амплитуда 100 % при мощности 2 Вт, расстояние между источником звука и навеской дрожжей 5 см. В условиях экспериментов в опытных вариантах убыль веса питательной среды была в 1,5-2,3 раза больше, а процент нежизнеспособных клеток на 5-30 % меньше по сравнению с контролем. Общий титр клеток в опытных образцах был равен контрольному или на 5-10 % ниже. На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что предварительная акустическая обработка, проведенная в рациональных условиях, позволяет интенсифицировать утилизацию компонентов питательной среды клетками популяции пивных дрожжей. Это создало предпосылки для апробации предлагаемого способа активации пивных дрожжей в условиях, приближенных к производственным.
Ключевые слова: пивные дрожжи, звук слышимого диапазона, акустическая обработка, общий титра клеток дрожжей, утилизация сухих веществ, доля нежизнеспособных клеток
Введение
Роль производственных (культурных) дрожжей во многих пищевых технологиях является определяющей. Так, в бродильных производствах от активности дрожжевой популяции зависит скорость сбраживания сусла, и, следовательно, продолжительность этого процесса и экономика предприятия в целом. Более того, в некоторых отраслях, включая виноделие и пивоварение, дрожжи накапливают метаболиты, принимающие активное
участие в формировании органолептических характеристик готового напитка, причем разные группы продуктов жизнедеятельности оказывают противоположно направленное воздействие. В силу этого технолог бродильного, в том числе, пивоваренного производства выбирает и контролирует в процессе применения целый ряд характеристик производственных дрожжей. Одними из наиболее важных являются увеличение общего титра клеток, скорость и глубина сбраживания. Поэтому перспективными могут быть мето-
Материал опубликован в соответствии с международной . . _
лицензией Creative Commons Attribution 4.0. 140
_ Как цитировать _
Карпенко, Д. В. (2020). Определение рациональных параметров акустической обработки с целью активации пивных дрожжей. Health, Food & Biotechnology, 2(1). https://doi.org/10.36107/hfb.2020.il.s290
ды, базирующиеся на различных принципах, но обеспечивающие эффективное улучшение этих характеристик.
Важными условиями при выборе метода активации развития дрожжевых популяций в пищевых, в частности, бродильных производствах являются:
• сравнительно невысокие затраты;
• отсутствие необходимости существенного аппаратурного переоснащения предприятия;
• минимизация негативных воздействий обработки на оборудование и персонал;
• незначительные изменения химического состава технологических сред и готовой продукции, обеспечивающие сохранение органолеп-тических, физико-химических характеристик готовой продукции, показателей ее безопасности на уровне не ниже контрольных;
• технологическая и экономическая эффективность обработки.
Все это делает необходимым не только выбор адекватного принципа, на котором базируется метод активации развития дрожжевых популяций, но и установление рациональных параметров проведения обработки.
Литературный обзор
В литературных источниках рассматривается чрезвычайно широкий спектр подходов к решению задачи активации жизнедеятельности объектов различной биологической природы. Однако, некоторые из них не могут быть применены к дрожжам бродильного (пивоваренного) производства ввиду высокой стоимости, недостаточной технологичности или значимого изменения, в конечном итоге, химического состава готового пищевого продукта. Тем не менее, разработаны, а в ряде случаев и реализуются в производственной практике несколько способов активации спиртообразующих дрожжей или интенсификации технологических стадий, на которых они применяются. В качестве примеров могут быть приведены следующие:
• максимально возможное приближение параметров культивирования популяции к значениям, оптимальным для конкретной дрожжевой культуры (Heard & Fleet, 1988; Jenkins, Kennedy, Hodgson, Thurston, & Smart, 2003; Kopecka et al., 2015; Noé Arroyo-López, Orlic, Ouerol, & Barrio, 2009; Somani, Bealin-Kelly, Axcell, & Smart, 2013);
• минимизация, когда это возможно, стрессовых факторов (Bleoanca & Bahrim, 2013; Bryant, 2019; Powell, Ouain, & Smart, 2003; Smart, 2017;
Zhuang, Smart, & Powell, 2017), что тесно связано с предыдущим подходом;
• введение в среду культивирования тех или иных компонентов, стимулирующих развитие популяции (Anghel, 2019; Кошова, Яжло, Каплуненко, & Огородник, 2015), в частности, витаминов группы В и минерального азота (Vukosavljevic, Pajovic-Scepanovic, Matijasevic, & Maletic, 2016), цинка (De Nicola & Walker, 2009; De Nicola & Walker, 2011);
• проведение селекции (Libkind et al., 2011; Michel et al., 2015), гибридизации (Gibson et al., 2017; Krogerus, Magalhäes, Vidgren, & Gibson, 2017) или генетических модификаций (Alexander et al., 2016; Gorter de Vries, Pronk, & Daran, 2019; Hinchliffe, 1989; Karabin, Jelinek, Kotrba, Cejnar, & Dostalek, 2017), мутагенеза (Liu, Zhang, & Sun, 2008; Liu, 2018; Selecky, Smogrovicova, & Sulak, 2005) и последующее использование дрожжей с улучшенными свойствами;
• подбор новых родов и видов дрожжей, не принадлежащих к роду Saccharomyces (Iattici, Catallo, & Solieri, 2020);
• фотоактивация, в том числе, с помощью ближнего ультрафиолетового (337 нм) излучения (Belenikina, Strakhovskaya, & GYa, 1991);
• обработка ультразвуком при определенных параметрах (Бодрова & Кречетникова, 2007), в том числе, импульсная (Muthu et al., 2018); во многих случаях эффект такого воздействия объясняется в литературных источниках кави-тационными явлениями и локальным прогревом обрабатываемой среды (Cheeke & David, 2002).
Анализ научной литературы позволил заключить, что каждый из этих подходов обладает как достоинствами, так и недостатками. Это сделало целесообразным изучение альтернативных возможностей решения задачи интенсификации развития популяций дрожжей рода Saccharomyces, используемых в пивоваренном производстве.
В ФГБОУ ВО «МГУПП» на протяжении ряда лет проводятся исследования эффективности такого технологического приема, как обработка объектов различных уровней организации звуком слышимого диапазона с определенной фиксированной частотой. Была установлена возможность повышения за счет такой обработки интенсивности процессов экстракции технологически ценных компонентов сырья пивоваренного и безалкогольного производств (светлого ячменного солода (Карпенко & Беркетова, 2012), хмеля, мяты перечной), активности гидролаз различной специфич-
ности (Карпенко, Тихонова, Ходарев, Овчинников, & Безгубов, 2015), а также интенсивности развития популяции пивных дрожжей рода Saccharomyces (Кагрепко et а1., 2019). В рамках проведенных нами ранее исследований предварительную акустическую обработку засевных дрожжей проводили в следующих условиях: частота 3070 Гц, продолжительность 60 мин, мощность источника звука 2 Вт, амплитуда 100 %, синусоидная форма сигнала, расстоянии от источника звука до обрабатываемого объекта 10 см. Это обеспечило в условиях эксперимента (с применением модельных питательных сред) улучшение технологически важных показателей развития популяции пивных дрожжей: прироста титра жизнеспособных клеток в процессе культивирования, доли утилизированных сухих веществ питательной среды, снижения процента нежизнеспособных клеток. В то же время, имеющиеся экспериментальные данные, а также литературная информация позволили предположить, что установление рациональных параметров предварительной обработки, в данном случае акустической, позволит достичь еще большего положительного эффекта воздействия такого типа. Для этого был проведен следующий этап работы, результаты которого представлены в данной статье.
Теоретическое обоснование
Воздействие ультразвука на биологические объекты, как было отмечено выше, обычно объясняется возникновением явлений кавитации и областей локального нагрева в обрабатываемом материале. Предположить такой же механизм низкоэнергетического воздействия звука слышимого диапазона затруднительно. Однако и звуковые колебания привносят в живую систему, в частности, микробную клетку, определенное количество энергии. Кроме того, определенную роль может играть и резонанс, возбуждаемый акустическими колебаниями. Механизм такого воздействия должен быть исследован дополнительно, однако, возможно, он базируется, хотя бы отчасти, на изменении конформации молекул белков, в том числе, обладающих каталитической активностью. При этом положительные изменения характеристик обрабатываемого объекта имеют место только тогда, когда количество введенной энергии оптимально. При избытке введенной энергии характеристики объекта могут ухудшаться, а при недостатке обработка будет неэффективной. Ранее (Кагрепко et а1., 2019) была показана принципиальная воз-
можность изменения показателей развития популяций спиртообразующих дрожжей за счет их предварительной обработки звуком слышимого диапазона, причем направление этих изменений (в положительную или отрицательную сторону) зависело от частоты акустических колебаний. Целью обсуждаемого в статье этапа работ являлось установление параметров акустической обработки засевных дрожжей, обеспечивающих, по меньшей мере, технологический эффект. Следует отметить также, что предварительной акустической обработке подвергали негидратированные, сухие дрожжи, чего никогда не делается в производственном масштабе. Это решение было продиктовано следующим соображением: гидратация, тем более разбраживание дрожжей приводили бы к увеличение различий в состоянии дрожжевых клеток перед акустической обработкой/засевом сусла в разных экспериментах, что вводило бы дополнительный трудно учитываемый фактор, влияющий на результаты определения показателей, по которым судили об интенсивности развития популяций дрожжей, и затрудняло сопоставление их результатов и формулирование выводов на основании проведенных исследований.
Исследование
Материалы и методы исследования
Пивные дрожжи W-34/70 (Saflager, Fermentis (Франция)) обеспечивают получение хорошо сбалансированного пива с фруктовым и цветочным ароматом. Широко используются на современных пивоваренных предприятиях различной мощности. Обладают следующими характеристиками:1
• Сухие вещества (СВ), %: 94,0 - 96,5;
• Кол-во живых клеток при упаковке: > 6 • 109/г;
Акустическую обработку проводили с использованием колонки для персонального компьютера мощностью 2 Вт.
Частоту звука, используемого для обработки засев-ных дрожжей, устанавливали с помощью компьютерной программы "Generator".
Содержание сухих веществ определяли пикноме-трическим методом.
Общий титр дрожжевых клеток определяли подсчетом в камере Горяева.
1 Сафлагер W-34/70 Сухие дрожжи низового брожения [Saflager W-34/70 Dry yeast of bottom fermentation]. Retrieved from http://
www.fptl.ru/biblioteka/pivo/saflager_w34-70.pdf (in Russian)
Интенсивность утилизации компонентов питательной среды оценивали, ежесуточно измеряя убыль веса среды культивирования.
Долю нежизнеспособных клеток определяли прямым микроскопированием после окраски метиле-новым синим.
Условия культивирования дрожжевых популяций: продолжительность 4 сут, температура 2126 °С. В качестве питательной среды использовали 5 %-ный раствор сахарозы в водопроводной воде, который перед засевом стерилизовали трехкратным кипячением в течение 60 мин. Объемы питательных сред в контрольных и опытных вариантах - 100 см3. Навески сухих дрожжей, использованных для засева, равнялись 45 мг, Культивирование вели в конических колбах емкостью 250 см3 без принудительного перемешивания, за исключением су-спендирования содержимого колбы 1 раз в сутки непосредственно перед отбором проб для измерения контролируемых показателей.
Все измерения проводили в трех повторностях, в таблицах приведены средние значения измеряемых показателей.
Результаты
Нам представлялось целесообразным в первую очередь установить значение частоты звука, обеспечивающее наилучшие результаты, ввиду того, что ранее было установлено, что звук разных частот может оказывать выраженное как отрицательное, так и положительное влияние на контролируемые показатели. В качестве «стартовой точки» была выбрана частота, при которой на предыдущем этапе исследований (Кагрепко et а1., 2019) была зафиксирована наибольшая интенсификация развития популяции пивных дрожжей, а
именно, 3070 Гц. Следует отметить, что используемая нами программа для ПК «Generator», позволяла генерировать звук определенных частот только с дискретными, а не произвольно установленными значениями. В силу этого, уточнение влияния частоты звука на результаты обработки засевных дрожжей проводили при значениях, указанных в табл. 1. Остальные параметры предварительного акустического воздействия на дрожжи опытных вариантов перед засевом - продолжительность акустического воздействия 60 мин, амплитуда 100 %, мощности источника звука 2 Вт, расстояние от источника до обрабатываемого объекта 15 см. Условия культивирования приведены в разделе «Материалы и методы исследований». Отметим, что в данном эксперименте контрольный вариант (с использованием дрожжей, не подвергнутых акустической обработке) не ставили ввиду большого количества опытных вариантов. Положительное влияние акустической обработки было доказано на предыдущем этапе исследований, целью обсуждаемого эксперимента являлось выявление наиболее целесообразной частоты звука. Полученные результаты представлены в табл. 1.
После подтверждения сделанного ранее вывода о значимости такого параметра акустической обработки, как частота звука, мы сочли целесообразным уточнить значение рациональной частоты звука, обработка которым дает наилучшие результаты. С этой целью был проведен эксперимент, в котором диапазон используемых частот был сужен. Таким образом, в условиях, аналогичных предыдущим, проводили обработку образцов сухих дрожжей при частотах, указанных в табл. 2.
Дальнейшее сужение диапазона исследуемых частот было признано нецелесообразным, и в описанных ниже экспериментах обработку проводили при частоте звука 2765 Гц, варьируя другие параметры предварительной акустической обработки.
Таблица 1
Влияние обработки навески сухих дрожжей звуком (2460 - 3528 Гц) на показатели культуральной жидкости после 4 сут культивирования
Показатель Длина волны, Гц
2460 2765 3070 3223 3528
Нежизнеспособные клетки, % 23,1 22,6 23,0 22,0 23,4
Клетки1) , млн/см3 52,5 57,5 57,5 55,0 52,0
СВ, % масс. 4,54 4,55 4,64 4,59 4,61
Убыль веса, % от исходного 3,74 3,81 2,11 1,63 3,42
Примечание.1 Общий титр дрожжевых клеток, здесь и в следующих таблицах
Таблица 2
Влияние обработки навески сухих дрожжей звуком (2150 - 3070 Гц) на показатели культуральной жидкости после 4 сут культивирования
Показатель Длина волны, Гц
2150 2380 2460 2765 3070
Нежизнеспособные клетки, % 23,1 22,6 23,0 22,0 23,4
Клеток, млн/см3 52,5 57,5 52,0 57,5 57,5
СВ, % масс. 4,64 4,64 4,43 4,42 4,43
Убыль веса, % от исходного 4,73 2,11 6,54 8,32 6,54
Следующим из них являлась продолжительность воздействия звуком слышимого диапазона. В исследованиях, проведенных ранее, и на основе анализа литературных источников установлено, что продолжительность обработки волновыми/полевыми воздействиями влияет как на ее технологическую эффективность, так и на набор мероприятий по реорганизации традиционного технологического процесса, определяет производственные затраты.
Для оценки влияния продолжительности акустического воздействия была реализована следующая серия экспериментов. Обработку сухих пивоваренных дрожжей проводили в звукоизолированной ячейке в течение 5, 20, 40 и 60 мин при комнатной температуре и частоте звука 2765 Гц. За исключением продолжительности обработки остальные ее параметры были такими же, как указано ранее. Контрольный вариант формировали, используя навеску дрожжей той же партии, которую выдерживали при комнатной температуре в соседнем помещении так, чтобы она не подвергалась воздействию звука.
После акустической обработки различной продолжительности в опытных вариантах производили засев дрожжами питательных сред. Культивирование вели в течение 4 сут, по ходу процесса и по его окончании определяя показатели, значения которых приведены в табл. 3.
Для более точного установления рациональной продолжительности акустической обработки дрожжей на ее эффективность был проведен дополнительный эксперимент, «центром» которого выбрали 40 мин, то есть значение, при котором ранее были получены наибольшие величины контролируемых показателей, шаг варьирования был уменьшен до 10 мин. Остальные условия проведения эксперимента были аналогичны предыдущим. Полученные результаты представлены в табл. 4.
Мы сочли целесообразным провести еще один эксперимент данной серии для подтверждения того, что именно 30-минутная обработка звуком дает наилучшие результаты. В этом эксперименте «шаг» варьирования продолжительности обработки был уменьшен и равнялся 5 минутам.
Условия проведения эксперимента были аналогичны предыдущим. Результаты приведены в табл. 5.
В ранее проведенных исследованиях установлено, что одним из значимых факторов, определяющих эффективность волновых воздействий на обрабатываемый объект, является их амплитуда (иначе говоря, мощность). Применительно к обработке пивных дрожжей этот вопрос ранее не исследовался, поэтому в нашей работе было решено оценить влияние упомянутого параметра на результаты обработки сухих пивных дрожжей.
Для этого проводили обработку сухих пивных дрожжей в течение 30 мин звуком частотой 2765 Гц в условиях, аналогичных описанным выше. Исключением являлись величины амплитуды акустических колебаний. Они составляли 0, 25, 50, 75 или 100 % от максимального значения, которое использовали во всех предыдущих экспериментах. Контрольным образцом являлась навеска из той же партии дрожжей, которую не подвергали целенаправленному воздействию звука. По окончании обработки дрожжами каждого варианта засевали 5 %-ный раствор сахарозы и определяли показатели, значения которых представлены в табл. 6.
Известно, что звуковые колебания затухают по мере удаления от источника звука, причем скорость такого затухания зависит от ряда факторов, в частности, от свойств среды, в которой он распространяется.
Для того чтобы, с одной стороны, изучить зависимость изменения характеристик обрабатыва-
Таблица 3
Влияние продолжительности (5-60 мин) обработки дрожжей звуком (2765Гц) на показатели культуральной жидкости после 4 сут культивирования
Продолжительность обработки, мин
Показатель 5 20 40 60 Без обработки
Нежизнеспособные клетки, % 29,80 34,30 32,20 34,10 46,80
Клеток, млн/см3 62,50 68,30 60,00 68,00 62,00
СВ, % масс. 4,40 4,27 4,23 4,23 4,18
Убыль веса, % от исходного 6,00 3,69 8,11 5,80 3,50
Таблица 4
Влияние продолжительности (30 - 50 мин) обработки дрожжей звуком (2765 Гц) на показатели
культуральной жидкости после 4 сут культивирования
Показатель Продолжительность обработки, мин
30 40 50 Без обработки
Нежизнеспособные клетки, % 32,5 29,4 35,1 37,8
Клетки, млн/см3 62,5 55,0 57,5 62,5
СВ, % масс. 4,51 4,56 4,72 4,72
Убыль веса, % от исходного 4,77 3,32 3,07 2,07
Таблица 5
Влияние продолжительности (25 - 35 мин) обработки дрожжей звуком (2765 Гц) на показатели
культуральной жидкости
Показатель Продолжительность обработки, мин
25 30 35 Без обработки
Нежизнеспособные клетки, % 34,5 33,6 31,6 35,3
Клетки, млн/см3 52,5 57,5 52,0 57,5
СВ, % масс. 4,40 4,33 4,45 4,40
Убыль веса, % от исходного 3,47 4,42 3,57 2,87
Таблица 6
Влияние амплитуды звука (2765 Гц), использованного для обработки дрожжей в течение 30 минут, на показатели культуральной жидкости
Амплитуда, %
Показатель -
0 25 50 75 100 Без обработки
Нежизнеспособные клетки, % 27,6 23,3 23,5 24,3 24,2 29,9
Клетки, млн/см3 55,0 57,5 57,5 55,0 52,0 55,0
СВ, % масс. 4,76 4,69 4,73 4,71 4,69 4,74
Убыль веса, % от исходного 2,06 2,90 3,07 3,28 3,90 1,86
емых пивоваренных дрожжей от их удаленности от источника звука, а с другой стороны, оценить возможность проведения такой обработки в промышленных условиях, был проведен следующий эксперимент.
Навески сухих дрожжей размещали на картонном лотке квадратного сечения, условно разделенном на секции шириной 1 см так, чтобы через каждые
5 см располагалась одна навеска дрожжей, равная 0,045г. Таким образом, получили 6 образцов, которые в процессе предварительной акустической обработки располагались от источника звука на расстоянии 0, 5, 10, 15, 20, 25 см. Источник звука (акустическую колонку) устанавливали вплотную к одному из торцов этого лотка. Обработку проводили в течение 30 минут при 2765 Гц и амплитуде, равной 100 %.
После проведения акустической обработки сухими кую же питательную среду навеску дрожжей, не
дрожжами каждого варианта засевали равные объ- подвергавшуюся воздействию звука. Результаты
емы 5 %-ного раствора сахарозы, формируя опыт- определения показателей культуральной жидко-
ные образцы. Контрольный получали, внося в та- сти приведены в табл. 7.
Таблица 7
Влияние удаленности навески дрожжей от источника звуковых колебаний (2765 Гц) на показатели культуральной жидкости
Расстояние от источника звука, см
Показатель -
0 5 10 15 20 25 Без обработки
Нежизнеспособные клетки, % 23,5 22,3 23,5 23,2 22,6 22,3 23,5
Клетки, млн/см3 55,0 52,0 52,5 47,5 52,0 57,5 57,5
СВ, % масс. 4,16 4,07 4,13 4,14 4,15 4,18 4,20
Убыль веса, % от исходного 3,26 4,65 3,95 3,72 3,02 2,56 2,80
Обсуждение полученных результатов
На основании данных таблицы 1 можно заключить, что наибольшее снижение содержания сухих веществ в модельной питательной среде достигнуто в результате обработки акустическими колебаниями частотой 2765 Гц. Так, убыль веса в этом варианте была в 2,3 раза больше, чем при обработке звуком с частотой 3223 Гц, продемонстрировавшей в условиях эксперимента наименьшую эффективность. Обработка при этой частоте также обеспечила наибольший прирост титра дрожжей, превосходивший значения в большинстве других вариантов на 5 - 10 %. По доле нежизнеспособных клеток этот вариант незначительно (2,7 %) уступал только одному, в котором предварительную акустическую обработку проводили при частоте 3223 Гц.
Сделанный вывод подтверждается данными дополнительного эксперимента (табл. 2), в котором наибольшее (в 1,3 - 4 раза) снижение содержания сухих веществ в модельной питательной среде в результате воздействия звуковыми колебаниями на дрожжи также было достигнуто при 2765 Гц. Значения остальных контролируемых показателей были близкими к таковым в остальных вариантах или лучше их.
Выявлено, что продолжительность звукового воздействия является значимым фактором, обуславливающим эффективность обсуждаемого технологического приема. Из таблицы 3 видно, что наилучшей с точки зрения убыли сухих веществ в условиях эксперимента следует признать обработку в течение 40 минут - значение этого показателя составило более 8,11 % - в 2,5 раза больше, чем в контроле. При 40-минутной продолжительности обработки наблюдалась и меньшая - на 30 % - по
сравнению с контролем доля нежизнеспособных клеток.
Уточнение значения рациональной продолжительности предварительной акустической обработки позволило заключить (табл. 4), что максимальное снижение количества сухих веществ в модельной питательной среде обеспечила в условиях эксперимента обработка в течение 30 минут. В этом варианте предварительное акустическое воздействие обусловило увеличение убыли веса на 130 %, снижение доли нежизнеспособных клеток на 14 % по сравнению с контролем; общий титр клеток равен контрольному.
Этот вывод подтверждается и данными таблицы 5, полученными при сужении диапазона продолжительности обработки. Видно, что лучшие результаты (убыль веса 154 %, доля нежизнеспособных клеток 95 % по отношению к контролю) обеспечила обработка сухих дрожжей именно в течение 30 минут; при этом наименьшая доля нежизнеспособных клеток - 90 % по сравнению с контролем -зафиксирована в опытном варианте с использованием дрожжей, перед засевом обработанных звуком в течение 35 минут. Тем не менее, по совокупности всех проанализированных показателей было решено, что именно 30-минутная обработка является наиболее эффективной с точки зрения улучшения пивоваренных характеристик дрожжей. Все следующие эксперименты проводили, используя акустическую обработку именно такой продолжительности.
Изучение влияния амплитуды акустических колебаний дало результаты (табл. 6), на основании которых нами был сделан ряд выводов: 1. влияние значения амплитуды звуковых колебаний на характер утилизации питательных
веществ модельной среды имело закономерный характер: при амплитуде, равной 0 (что фактически означает отсутствие звука) величины убыли веса в модельной питательной среде опытного и контрольного вариантов были близкими - 2,06 % и 1,86 %, соответственно. По мере увеличения значения варьируемого фактора убыль содержания сухих веществ в модельной питательной среде возрастала -вплоть до 210 % к контролю при 100 %.
2. влияние значения амплитуды звуковых колебаний на другие показатели культуральной жидкости, определявшиеся в ходе эксперимента, ни имело линейного характера, однако в большинстве случаев их значения были лучше, чем в контрольном варианте;
3. наибольшее снижение содержания сухих веществ в модельной питательной среде обеспечила амплитуда звуковых колебаний, равная 100 % от максимально возможной на использованном оборудовании. Именно при максимальной амплитуде проводили последующие эксперименты;
4. данные обсуждаемого эксперимента позволили предположить, что использование устройства, генерирующего звук (акустической колонки) большей мощности позволит повысить эффективность звуковой обработки пивных дрожжей с целью улучшения их пивоваренных характеристик - степени сбраживания сахаров и физиологического состояния клеток.
Проведенные исследования показали, что результативность акустической обработки значимо зависит и от расстояния между источником звука и обрабатываемым объектом. Из представленных в таблице 7 данных видно, что по мере увеличения расстояния между обрабатываемыми дрожжей и акустической колонкой убыль количества сухих веществ в модельной питательной среде ожидаемо снижается, что свидетельствует о поглощении звуковых волн клетками дрожжей, рассеянии их в пространстве и уменьшении амплитуды звуковых колебаний по мере удаления от их источника.
В целом, наиболее рациональным было признано расстояние от колонки до обрабатываемых дрожжей равное 5 см: в этом варианте зафиксирована наиболее интенсивная утилизация питательных веществ (наибольшая убыль веса - 166 % к контролю), а также определенное - на 5 % по сравнению с контролем - снижение доли нежизнеспособных клеток.
Заключение
На основании всего приведенного массива экспериментальных данных, по нашему мнению, можно сделать вывод о том, что изменение параметров акустической обработки существенно влияет на ее эффективность. Проведенные исследований позволили установить рациональные параметры обработки: значение частоты звука слышимого диапазона (2765 Гц), продолжительности акустического воздействия (30 мин), амплитуды (100 % при мощности источника 2 Вт) и расстояния от источника до обрабатываемого объекта (5 см). Предварительная акустическая обработка сухих засевных дрожжей, проведенная в таких условиях, позволила при развитии дрожжевой популяции в модельной питательной среде повысить степень утилизации сухих веществ (увеличение убыли веса питательной среды до 2,3 раз) по сравнению с контролем, снизить долю нежизнеспособных клеток на 5 % и более, сохранив общий титр дрожжевых клеток на уровне контроля или незначительно ниже. Это создало предпосылки для апробации разрабатываемого способа активации пивных дрожжей в условиях, приближенных к производственным, то есть, в пивном сусле с концентрацией сухих веществ более 10 %, при температурах, характерных для низового брожения (менее 10°С ), в течение 5-7 суток.
Литература
Бодрова, О. Ю., & Кречетникова, А. Н. (2007) Ультразвуковая обработка засевных дрожжей в технологии спирта. Производство спирта и ли-кероводочных изделий, 3, 26-29. Карпенко, Д. В., & Беркетова, М. А. (2012). Изучение влияния акустических колебаний на качество пивоваренного ячменного солода. Пиво и напитки: безалкогольные, алкогольные, соки, вино, 5, 14-16.
Карпенко, Д. В., Тихонова, Т. А., Ходарев, К. К., Овчинников, Ю. Б., & Безгубов, В. В. (2015). Способ активации амилолитического ферментного препарата. Пиво и напитки: безалкогольные, алкогольные, соки, вино, 4, 42-44. Кошова, В., Яжло, В., Каплуненко, В., & Огородник, Ю. (2015). Increase of fermentative activity of brewing yeast using zinc nanoaquachelate. Eastern-European Journal of Enterprise Technologies, 4, 10 (76), 40-44. https://doi. org/10.15587/1729-4061.2015.47888.
Alexander, W. G., Peris, D., Pfannenstiel, B. T., Opulente, D. A., Kuang, M., & Hittinger, C. T. (2016). Efficient engineering of marker-free synthetic allotetraploids of Saccharomyces. Fungal genetics and biology, 89, 10-17. https://doi.org/10.10Wj. fgb.2015.11.002 Anghel, N. (2019). Spruce bark polyphenols as metabolic booster for yeast development. Cellulose Chemistry and Technology, 53 (9-10), 925-928. https://doi.org/10.35812/CelluloseChemTechn ol.2019.53.89. Belenikina, N., Strakhovskaya, M., & GYa, F. (1991). Near-UV activation of yeast growth. Journal of photochemistry and photobiology B: Biology, 10 (1-2), 51-55. https://doi. org/10.1016/1011-1344(91)80211-Y. Bleoanca, I., & Bahrim, G. E. (2013). Overview on Brewing Yeast Stress Factors. Romanian BiotechnologicalLetters, 18 (5), 8559-8572. Bryant, N. (2019). The effect of alcohol and bitterness levels on brewing yeast viability. Master's Theses. California Polytechnic State University, San Luis Obispo. Retrieved from https://digitalcommons. calpoly.edu/theses/1995 Cheeke, J., & David, N. (2002). Fundamentals and Applications of Ultrasonic Waves. Boca Raton, Fla., USA: CRC Press, 462 p. De Nicola, R., & Walker, G. M. (2009). Accumulation and cellular distribution of zinc by brewing yeast. Enzyme and Microbial Technology, 44 (4), 210-216. https://doi.org/10.10Wj.enzmictec.2008.11.008. De Nicola, R., & Walker, G. M. (2011) Zinc Interactions with Brewing Yeast: Impact on Fermentation Performance. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 69 (4), 214-219. https://doi. org/10.1094/ASBCJ-2011-0909-01. Gibson, B., Geertman, J.-M., Hittinger, C., Krogerus, K., Libkind, D., Louis, E., Magalhaes, F., & Sampaio, J. (2017). New yeasts-new brews: Modern approaches to brewing yeast design and development. FEMS Yeast Research, 17 (4), fox038. https://doi. org/10.1093/femsyr/fox038. Gorter de Vries, A. R., Pronk, J. N., & Daran, J.-M. (2019). Lager brewing yeasts in the era of modern genetics. FEMS Yeast Research, 19 (7). https://doi. org/10.1093/femsyr/foz063. Heard, G. M., & Fleet, G. H. (1988). The effects of temperature and pH on the growth of yeast species during the fermentation of grape juice. Journal of Applied Bacteriology. 65 (1). 23-28. https://doi. org/10.1111/j.1365-2672.1988.tb04312.x Hinchliffe, E. (1989). The genetic improvement of brewing yeast. Biochemical Society transactions, 16 (6), 1077-1079. https://doi.org/10.1042/bst0161077. Iattici, F., Catallo, M., & Solieri, L. (2020). Designing New Yeasts for Craft Brewing: When Natural
Biodiversity Meets Biotechnology. Beverages. 6 (1), 3-23. https://doi.org/10.3390/beverages6010003.
Jenkins, C. L., Kennedy, A. I., Hodgson, J. A., Thurston, P., & Smart, K. (2003). Impact of serial repitching on lager brewing yeast quality. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 61 (1), 1-9. https://doi.org/10.1094/ASBCJ-61-0001
Karabin, M., Jelinek, L., Kotrba, P., Cejnar, R., & Dostalek, P. (2017). Enhancing the performance of brewing yeasts. Biotechnology Advances, 36 (3), 691-706. https://doi.org/10.10Wj. biotechadv.2017.12.014
Karpenko, D. V., Gernet, M. V., Krjukova, E. V., Gribkova, I. N., Nurmukhanbetova, D. E., & Assembayeva, E. K. (2019). Acoustic vibration effect on genus Saccaromyces yeast population development. News of the Academy of Sciences of the Republic of Kazakhstan. Series of geology and technical sciences, 4 (436), 103-112. https://doi. org/10.32014/2019.2518-170X.103
Kopecka, J., Nemec, M., Matoulkova, D., Cejka, P., Jelinkova, M., Felsberg, J., & Sigler, K. (2015). Effect of Growth Conditions on Flocculation and Cell Surface Hydrophobicity of Brewing Yeast. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 73 (2), 143-150. https://doi.org/10.1094/ ASBCJ-2015-0324-01.
Krogerus, K., Magalhäes, F., Vidgren, V., & Gibson,
B. R. (2017). Novel brewing yeast hybrids: creation and application. Applied Microbiology and Biotechnology, 101 (1), 65-78. https://doi. org/10.1007/s00253-016-8007-5.
Libkind, D., Hittinger, C., Valerio, E., Gon^alves,
C., Dover, J., Johnston, M., Gon^alves, P., & Sampaio, J. (2011). Microbe domestication and the identification of the wild genetic stock of lager-brewing yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108 (35), 14539-14544. https://doi.org/10.1073/ pnas.1105430108.
Liu, C., Li, 0., Niu, C., Tian, Y., Zhao, Y., & Yin, X. (2018). The use of atmospheric and room temperature plasma mutagenesis to create a brewing yeast with reduced acetaldehyde production: A brewing yeast with low acetaldehyde from ARTP technology. Journal of the Institute of Brewing, 124 (3), 236-243. https://doi.org/10.1002/jib.498.
Liu, Z., Zhang, G., & Sun, Y. (2008). Mutagenizing brewing yeast strain for improving fermentation property of beer. Journal of bioscience and bioengineering, 106 (1), 33-8. https://doi. org/10.1263/jbb.106.33.
Michel, M., Kopecka, J., Meier-Dörnberg, T., Zarnkow, M., Jacob, F., & Hutzler, M. (2015). Screening for new brewing yeasts in the non-Saccharomyces sector with Torulaspora delbrueckii as model. Yeast,
33 (4), 129-144. https://doi.org/10.1002/yea.3146. Muthu, M., Gopal, J., Chun, S., Vimala, A., Jeevanandam, M., & Paul, D. (2018). Pertinency of Pulsed Sonication for Activating Commercial Yeast Clusters. Journal of Cluster Science, 29 (10), 641648. https://doi.org/10.1007/s10876-018-1376-4. №e Arroyo-Lopez, F., Orlic, S., Ouerol, A., & Barrio, E. (2009). Effects of temperature, pH and sugar concentration on the growth parameters of Saccharomyces cerevisiae, S. kudriavzevii and their interspecific hybrid. International Journal of Food Microbiology, 131 (2-3), 120-127. https://doi. org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.01.035 Powell, C. D., Ouain, D. E., & Smart, K. A. (2003). The impact of brewing yeast cell age on fermentation performance, attenuation and flocculation. FEMS Yeast Research, 3 (2), 149-157. https://doi. org/10.1016/S1567-1356(03)00002-3 Selecky, R., Smogrovicova, D., & Sulak, M. (2005). Low-Alcoholic Beer Production Using Mutant Brewing Yeast. Kvasny Prumysl, 51 (7-8), 235-239. https://doi.org/10.18832/kp2005012.
Smart, K. (2017). Yeast Stress and Brewing Fermentations. In N. A. Bokulich, & Ch. W. Bamforth (Eds.), Brewing Microbiology: Current Research, Omics and Microbial Ecology (pp. 29-52). Poole, UK: Caister Academic Press. https://doi. org/10.21775/9781910190616.02. Somani, Bealin-Kelly, F., Axcell, B., & Smart, K. (2013). Impact of Storage Temperature on Lager Brewing Yeast Viability, Glycogen, Trehalose, and Fatty Acid Content. Cerevisia, 38 (2), 55. https://doi. org/10.1016/j.cervis.2013.09.017. Vukosavljevic, V. D., Pajovic-Scepanovic, R., Matijasevic, S. M., & Maletic, R. O. (2016). Fermentation activity of yeast in pinot noir must. Romanian Biotechnological Letters, 21 (2), 11337-11345.
Zhuang, S., Smart, K., & Powell, C. (2017). Impact of Extracellular Osmolality on Saccharomyces Yeast Populations during Brewing Fermentations. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 75 (3), 244-254, https://doi.org/10.1094/ ASBCJ-2017-3505-01.
BIOTECHNOLOGY
Determination of Rational Parameters of Acoustic Processing in order to Activate Brewer's Yeast
Dmitriy V. Karpenko Moscow State University of Food Production
Correspondence concerning this article should be addressed to Dmitriy V. Karpenko, Moscow State University of Food Production, 11 Volokolamskoe highway, Moscow, 125080, Russian Federation. E-mail: doka.65@mail.ru
In fermentation industries, including brewing, the actual tasks are to increase the fermentation activity of yeast and/or to intensify the accumulation of their biomass. To solve them, various methods are currently being proposed, one of which may be pre-treatment with wave or field effects. Earlier in our studies, the principal possibility of intensifying of yeast populations development by sound in the audible range pre-processing was shown. This article is devoted to the study of the influence of acoustic treatment parameters on the characteristics of the yeast cultivation process: the increase in the total cell titer, the proportion of non-viable cells, and the decrease in the weight of the culture medium. The efficiency of treatment of pitching Saccharomyces cerevisiae yeast (Saflager W34/70) with audible range sound was determined by varying the parameters of acoustic treatment: the frequency of sound, the duration of the processing, amplitude, distance from the sound source to the processed object (sample of dry yeast). Model media (sterilized 5 % sucrose solutions) were inoculated with treated and untreated yeast and cultured at a temperature of 21-26° C without forced stirring for 4 days. Immediately after inoculating and daily in the process of cultivation, controlled indicators were determined. Rational parameters of pre-acoustic treatment of pitching yeast were recognized: the sound frequency of 2765 Hz, duration of 30 minutes, amplitude of 100 % at 2 W, the distance between the sound source and the yeast sample 5 cm. In experimental conditions, the weight loss of the nutrient medium was 1.5-2.3 times greater, and the percentage of non - viable cells was 5-30 % less compared to the control. The total cell titer in the experimental samples was equal to the control one or 5-10 % lower. Based on the results obtained, it was concluded that preliminary acoustic treatment carried out under rational conditions makes it possible to intensify the utilization of nutrient medium components by cells of the brewer's yeast population. This created the prerequisites for testing the proposed method of brewer's yeast activation in conditions close to industrial ones.
Keywords: brewer's yeast, sound of the audible range, acoustic treatment, total titer of yeast cells, utilization of dry substances, percentage of non-viable cells
References
Bodrova, O. Ju., & Krechetnikova, A. N. (2007) Ultrasonic treatment of pitching yeast in the technology of ethanol. Proizvodstvo spirta i likerovodochnyh izdelij [Production of alcohol and alcoholic beverages], 3, 26-29.
Karpenko, D. V., & Berketova, M. A. (2012). Studying the effect of acoustic oscillations on the quality of brewing barley malt. Pivo i napitki: bezalkogol'nye, alkogol'nye, soki, vino [Beer and drinks: nonalcoholic, alcoholic, juices, wine], 5, 14-16.
Karpenko, D. V., Tihonova, T. A., Hodarev, K. K., Ovchinnikov, Ju. B., & Bezgubov, V. V. (2015). Sposob aktivacii amiloliticheskogo fermentnogo preparata [The method of activation of the amylolytic enzyme preparation]. Pivo i napitki:
bezalkogol'nye, alkogol'nye, soki, vino [Beer and drinks: non-alcoholic, alcoholic, juices, wine], 4, 42-44.
Koshova, V., Jazhlo, V., Kaplunenko, V., & Ogorodnik, Ju. Increase of fermentative activity of brewing yeast using zinc nanoaquachelate. Eastern-European Journal of Enterprise Technologies, 4, 10 (76), 40-44. https://doi.org/10.15587/1729-4061.2015.47888.
Alexander, W. G., Peris, D., Pfannenstiel, B. T., Opulente, D. A., Kuang, M., & Hittinger, C. T. (2016). Efficient engineering of marker-free synthetic allotetraploids of Saccharomyces. Fungal genetics and biology, 89, 10-17. https://doi.org/10.10Wj. fgb.2015.11.002
Anghel, N. (2019). Spruce bark polyphenols as metabolic booster for yeast development. Cellulose Chemistry and Technology, 53 (9-10), 925-928.
_ How to Cite _
This article is published under the Creative 150 Karpenko, D. V. (2020). Determination of Rational Parameters of Acoustic
Comm°ns Attribution 4.° Internati°nal License. Processing in order to Activate Brewer's Yeast. Health, Food & Biotechnology,
2(1). https://doi.org/10.36107/hfb.2020.i1.s290
https://doi.org/10.35812/CelluloseChemTechn ol.2019.53.89.
Belenikina, N., Strakhovskaya, M., & GYa, F. (1991). Near-UV activation of yeast growth. Journal of photochemistry and photobiology B: Biology, 10 (1-2), 51-55. https://doi. org/10.1016/1011-1344(91)80211-Y.
Bleoanca, I., & Bahrim, G. E. (2013). Overview on Brewing Yeast Stress Factors. Romanian BiotechnologicalLetters, 18 (5), 8559-8572.
Bryant, N. (2019). The effect of alcohol and bitterness levels on brewing yeast viability. Master's Theses. California Polytechnic State University, San Luis Obispo. Retrieved from https://digitalcommons. calpoly.edu/theses/1995
Cheeke, J., & David, N. (2002). Fundamentals and Applications of Ultrasonic Waves. Boca Raton, Fla., USA: CRC Press, 462 p.
De Nicola, R., & Walker, G. M. (2009). Accumulation and cellular distribution of zinc by brewing yeast. Enzyme and Microbial Technology, 44 (4), 210-216. https://doi.org/10.1016Zj.enzmictec.2008.11.008.
De Nicola, R., & Walker, G. M. (2011) Zinc Interactions with Brewing Yeast: Impact on Fermentation Performance. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 69 (4), 214-219. https://doi. org/10.1094/ASBCJ-2011-0909-01.
Gibson, B., Geertman, J.-M., Hittinger, C., Krogerus, K., Libkind, D., Louis, E., Magalhaes, F., & Sampaio, J. (2017). New yeasts-new brews: Modern approaches to brewing yeast design and development. FEMS Yeast Research, 17 (4), fox038. https://doi. org/10.1093/femsyr/fox038.
Gorter de Vries, A. R., Pronk, J. N., & Daran, J.-M. (2019). Lager brewing yeasts in the era of modern genetics. FEMS Yeast Research, 19 (7). https://doi. org/10.1093/femsyr/foz063.
Heard, G. M., & Fleet, G. H. (1988). The effects of temperature and pH on the growth of yeast species during the fermentation of grape juice. Journal of Applied Bacteriology. 65 (1). 23-28. https://doi. org/10.1111/j.1365-2672.1988.tb04312.x
Hinchliffe, E. (1989). The genetic improvement of brewing yeast. Biochemical Society transactions, 16 (6), 1077-1079. https://doi.org/10.1042/bst0161077.
Iattici, F., Catallo, M., & Solieri, L. (2020). Designing New Yeasts for Craft Brewing: When Natural Biodiversity Meets Biotechnology. Beverages. 6 (1), 3-23. https://doi.org/10.3390/beverages6010003.
Jenkins, C. L., Kennedy, A. I., Hodgson, J. A., Thurston, P., & Smart, K. (2003). Impact of serial repitching on lager brewing yeast quality. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 61 (1), 1-9. https://doi.org/10.1094/ASBCJ-61-0001
Karabin, M., Jelinek, L., Kotrba, P., Cejnar, R., & Dostalek, P. (2017). Enhancing the performance
of brewing yeasts. Biotechnology Advances, 36 (3), 691-706. https://doi.org/10.10Wj. biotechadv.2017.12.014
Karpenko, D. V., Gernet, M. V., Krjukova, E. V., Gribkova, I. N., Nurmukhanbetova, D. E., & Assembayeva, E. K. (2019). Acoustic vibration effect on genus Saccaromyces yeast population development. News of the Academy of Sciences of the Republic of Kazakhstan. Series of geology and technical sciences, 4 (436), 103-112. https://doi. org/10.32014/2019.2518-170X.103
Kopecka, J., Nemec, M., Matoulkova, D., Cejka, P., Jelinkova, M., Felsberg, J., & Sigler, K. (2015). Effect of Growth Conditions on Flocculation and Cell Surface Hydrophobicity of Brewing Yeast. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 73 (2), 143-150. https://doi.org/10.1094/ ASBCJ-2015-0324-01.
Krogerus, K., Magalhäes, F., Vidgren, V., & Gibson,
B. R. (2017). Novel brewing yeast hybrids: creation and application. Applied Microbiology and Biotechnology, 101 (1), 65-78. https://doi. org/10.1007/s00253-016-8007-5.
Libkind, D., Hittinger, C., Valerio, E., Gon^alves,
C., Dover, J., Johnston, M., Gon^alves, P., & Sampaio, J. (2011). Microbe domestication and the identification of the wild genetic stock of lager-brewing yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 108 (35), 14539-14544. https://doi.org/10.1073/ pnas.1105430108.
Liu, C., Li, 0., Niu, C., Tian, Y., Zhao, Y., & Yin, X. (2018). The use of atmospheric and room temperature plasma mutagenesis to create a brewing yeast with reduced acetaldehyde production: A brewing yeast with low acetaldehyde from ARTP technology. Journal of the Institute of Brewing, 124 (3), 236-243. https://doi.org/10.1002/jib.498.
Liu, Z., Zhang, G., & Sun, Y. (2008). Mutagenizing brewing yeast strain for improving fermentation property of beer. Journal of bioscience and bioengineering, 106 (1), 33-8. https://doi. org/10.1263/jbb.106.33.
Michel, M., Kopecka, J., Meier-Dörnberg, T., Zarnkow, M., Jacob, F., & Hutzler, M. (2015). Screening for new brewing yeasts in the non-Saccharomyces sector with Torulaspora delbrueckii as model. Yeast, 33 (4), 129-144. https://doi.org/10.1002/yea.3146.
Muthu, M., Gopal, J., Chun, S., Vimala, A., Jeevanandam, M., & Paul, D. (2018). Pertinency of Pulsed Sonication for Activating Commercial Yeast Clusters. Journal of Cluster Science, 29 (10), 641648. https://doi.org/10.1007/s10876-018-1376-4.
№e Arroyo-Lopez, F., Orlic, S., Ouerol, A., & Barrio, E. (2009). Effects of temperature, pH and sugar concentration on the growth parameters
of Saccharomyces cerevisiae, S. kudriavzevii and their interspecific hybrid. International Journal of Food Microbiology, 131 (2-3), 120-127. https://doi. org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.01.035 Powell, C. D., Ouain, D. E., & Smart, K. A. (2003). The impact of brewing yeast cell age on fermentation performance, attenuation and flocculation. FEMS Yeast Research, 3 (2), 149-157. https://doi. org/10.1016/S1567-1356(03)00002-3 Selecky, R., Smogrovicova, D., & Sulak, M. (2005). Low-Alcoholic Beer Production Using Mutant Brewing Yeast. KvasnyPrumysl, 51 (7-8), 235-239. https://doi. org/10.18832/kp2005012. Smart, K. (2017). Yeast Stress and Brewing Fermentations. In N. A. Bokulich, & Ch. W. Bamforth (Eds.), Brewing Microbiology: Current Research, Omics and Microbial Ecology (pp. 29-52).
Poole, UK: Caister Academic Press. https://doi. org/10.21775/9781910190616.02.
Somani, Bealin-Kelly, F., Axcell, B., & Smart, K. (2013). Impact of Storage Temperature on Lager Brewing Yeast Viability, Glycogen, Trehalose, and Fatty Acid Content. Cerevisia, 38 (2), 55. https://doi. org/10.1016/j.cervis.2013.09.017.
Vukosavljevic, V. D., Pajovic-Scepanovic, R., Matijasevic, S. M., & Maletic, R. O. (2016). Fermentation activity of yeast in pinot noir must. Romanian Biotechnological Letters, 21 (2), 11337-11345.
Zhuang, S., Smart, K., & Powell, C. (2017). Impact of Extracellular Osmolality on Saccharomyces Yeast Populations during Brewing Fermentations. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 75 (3), 244-254, https://doi.org/10.1094/ ASBCJ-2017-3505-01.
