CC BY
54
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ ВАЗОДИЛАТАТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ЖЕЛЕЗО-НИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ - ДОНОРОВ NO НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Чудинова Е.С., Сырцова Л.А., Санина Н.А., Шкондина Н.И.,
Котельников А.И., Алдошин С.М.
Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка Московской области 142432 . E-mail: [email protected]
Лечебный эффект наиболее известных нитровазодилататоров - нитроэфиров тринитроглицерина и нитросорбита обусловлен оксидом азота (NO), образующимся в результате их биотрансформации.
Исследованные в данной работе нитрозильные комплексы железа с серосодержащими лигандами, в отличие от нитроэфиров и других синтетических (органических и неорганических) NO-доноров, генерируют NO безактивационно: в результате гидролиза в протонной среде. Эти соединения, впервые синтезированные в ИПХФ РАН, являются структурными и спектроскопическими аналогами активных центров негеминовых [2Fe-2S]-белков - природных “депо” оксида азота. Их NO-донирующая способность ранее не была изучена.
Для исследования кинетики образования NO, генерируемого железо-нитрозильными комплексами, использовали дезоксигемоглобин (Hb), который является «ловушкой» NO (константа связывания NO с гемом белка равна 3 • 1010 М-1, скорость связывания близка к диффузионной) и имеет характерный спектр поглощения, меняющийся в процессе присоединения NO. В эксперименте регистрировали изменение спектров поглощения реакционных систем, содержащих Hb и изучаемый комплекс в атмосфере азота. Раскладывая спектры поглощения на составляющие с помощью компьютерного анализа, измеряли кинетику образования NO и рассчитывали константы скорости реакции. Этот подход имеет ряд преимуществ перед всеми другими методами анализа образования NO в растворе. Разработанная методика позволила сравнить синтезированные соединения по NO-донорной активности, а также провести исследования in vitro возможных стадий метаболизма железо-нитрозильных комплексов с участием разных форм гемоглобина и нитрозотиолов.
Известно, что монооксид азота (NO) является уникальным биологическим регулятором, в частности, стимулирует расширение кровеносных сосудов, выполняет функции посредника в межклеточных взаимодействиях, цитотоксического эффектора иммунологической защиты организма, регулятора нейротрансмиссии, иммунитета, ингибитора агрегации тромбоцитов и их адгезии на стенках кровеносных сосудов [1]. Данные о многофункциональной биологической активности NO in vivo используются при разработке фундаментальных основ создания нового поколения лекарственных препаратов, применяемых в терапии сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Основным механизмом действия NO в регуляции тонуса кровеносных сосудов является координация NO гемом гуанилатциклазы (КФ 4.6.1.2) [2,3].
Лечебный эффект наиболее известных вазодилататоров -тринитроглицерина и нитросорбита - органических доноров NO, обусловлен действием NO, образующимся в результате их биотрансформации через промежуточно образующийся нитрит-ион.
Исследованные в данной работе нитрозильные комплексы железа с серосодержащими лигандами, в отличие от нитроэфиров и других синтетических (органических и неорганических) NO-доноров, генерируют NO безактивационно: в результате гидролиза в протонной среде. Эти соединения, впервые синтезированные в ИПХФ РАН [4-7], являются структурными и спектроскопическими аналогами активных центров негеминовых [2Бе-28]-белков -природных “депо” монооксида азота. Их NO-донирующая способность ранее не была изучена. Для её исследования разработали спектрофотометрический метод, основанный на регистрации образования комплекса NO с дезоксигемоглобином (Hb). При этом образующийся продукт имеет характерный спектр поглощения (рис.
1). Пик поглощения Hb (Xmax = 556 нм; 8 = 12.5 ммоль'^л-см"1) при образовании
№N0 расщепляется на два: Хтах = 545 нм (в = 12.6 ммоль-1-л-см-1) и Хтах = 575 нм (в = 13.0 ммоль-1-л-см-1), в расчете на один гем для НЬ человека. Поэтому НЬ в данной работе был использован для регистрации кинетики образования N0 по накоплению №N0. Известно, что константа равновесия реакции
комплексообразования N0 с гемами НЬ имеет величину 3-1010 моль-1-л. Скорость
реакции близка к диффузионной. Это позволяет использовать НЬ в качестве «ловушки» N0.
Как видно из рисунка 1, в процессе преобразования НЬ в №N0 происходит
перекрывание спектров поглощения. В связи с этим концентрацию №N0 оценивали путем компьютерной декомпозиции экспериментальных спектров поглощения на составляющие (НЬ и №N0), используя
метод наименьших квадратов [8]. Расчет
проводился в диапазоне длин волн 450-650 нм по двумстам экспериментальным точкам. Спектрофотометрический метод с использованием гемоглобина для
определения N0 является более универсальным по сравнению с другими (электрохимический, метод электронного парамагнитного резонанса, хемилюминесцентный) методами, применяемыми для этой цели. Достоинствами спектрофотометрического метода являются высокая селективность и чувствительность; возможность проведения длительных кинетических измерений.
Помимо всего перечисленного, выбор НЬ для анализа эффективности доноров N0 представляет также и научный интерес, поскольку метаболизм N0 в организме в значительной мере связан с образованием нитрозилированного по железу комплекса НЬ в эритроцитах.
Использование гемоглобина в качестве индикатора NO-донорной способности железонитрозильных комплексов в протонных средах.
Разработанная методика была испытана в исследованиях с нитрозильными комплексами железа (1-7) (Таблица), которые самостоятельно выделяют N0 без использования дополнительных активаторов. Поскольку все сера-нитрозильные комплексы железа поглощают в видимой области, регистрировали разностные спектры поглощения буфера и опытной системы с гемоглобином, содержащих соответствующий комплекс в одинаковой концентрации.
Таблица. Эффективные константы скорости первого порядка (£) выделения N0 в раствор комплексами 1-7.
Обозначение Формула комплекса Ы03, с-1
1 №2^е^20з)2^0)2]-4Н20 4.5 ± 0.45
2 ^е^2С4Н5^)^0)2> 1/2Н20 1.84 ± 0.18
3 ^2^С2Нз^)2^0)4]-2Н20 1.72 ± 0.17
4 ^е2^С2Нз^)2(Ш)4] 6.6 ± 0.66
5 [Fe2(СзНзN2S)2(N0)4] 8.85 ± 0.9
6 ^е2^С4Н5^)2(Ш)4] з.46 ± 0.з5
7 ^е2^С4Нз^)2(Ш)4] 5.8 ± 0.5
А (отн. ед)
Рис. 1. Вид спектров НЬ и №N0, полученных экспериментально. [НЬ] = [№N0] = 4.7-10-6 моль-л-1.
*Экспериментальные условия как в подписи к рисунку 2. Концентрация комплексов 1-7 равна 2-10"4 моль-л"1, концентрация НЬ (6-7.5)-10-6 моль-л-1 (1-6), 2-10"5 моль-л"1 (7).
На рисунке 2 приведены изменения разностных спектров поглощения во времени при взаимодействии НЬ с комплексом 4. В аналогичных условиях было исследовано взаимодействие комплексов 1-3, 5-7 с НЬ. При этом во всех случаях наблюдалось уменьшение оптической плотности в области максимума спектра поглощения НЬ при 556 нм и нарастание при 545 и 575 нм, что свидетельствует об образовании комплекса №N0. Регистрацию заканчивали после того, как спектр переставал меняться. Обработку полученных данных проводили, как описано выше. Данные по кинетике образования №N0 для комплекса 4 приведены на рисунке 3. Оказалось, что все кинетические зависимости, полученные для 1-7, хорошо описываются в рамках формализма реакций первого порядка. №N0 образуется с такой же скоростью, с какой N0 выделяется в раствор [8]. Используя уравнение у^ ) = а(1 - e~kt) (1), получили эффективные константы скорости первого порядка (£) изученных реакций для комплексов 1-7.
А (отн. ед)
Рис. 2. Изменение разност-ных спектров поглощения во времени при взаимодействии комплекса 4 (2 10-4 моль-л-1) с НЬ (7.510-6 моль-л-1). Время регистрации в минутах. Кружками отмечены изобестические точки. Условия -растворитель 0.05 М фосфатный буфер рН 7.0, содержащий 3.3 % DMS0, температура 25°С.
Рис. 3. Кинетика образования №N0 при взаимодействии комплекса 4 (2- 10-4 моль-л-1) с НЬ (7.5-10-6 моль-л-1) по данным опыта, приведённого на
рисунке 2. Сплошная линия -
теоретическая кривая - описывается уравнением (1) и соответствует указанным экспериментальным точкам; k = (6.6± 0.7)-10-3 с-1.
Исследование in vitro возможных стадий метаболизма нитрозильных комплексов железа с участием разных форм гемоглобина и нитрозотиолов.
Эти исследования были проведены с тетранитрозильным комплексом железа “^2-S типа” с пиримидин-2-илом (7, Таблица). Для регистрации донирования им NO использовали описанный выше метод, который также позволяет регистрировать кроме HbNO разные формы гемоглобина: Hb , оксигенированный Hb (HbO2),
[HbNO], мкмольл-
метгемоглобин (метНЬ), метНЬ-NO. Для определения количества образовавшегося нитрозотиола использовали реакцию Савилла [9].
В живом организме Hb присутствует преимущественно в форме HbO2, содержание которого зависит от насыщения крови кислородом. В процессе метаболизма может также образовываться метНЬ, который переходит снова в Hb с помощью NADH-метгемоглобин редуктазы. Что касается нитрозотиолов, то они могут образовываться при нитрозилировании свободной SH-группы ß-93-цистеина в Hb. Поскольку в Hb две ß-субъединицы, то Hb человека и бычий, а также метНЬ имеют две свободные SH-группы. Однако Hb находится в таком конформационном состоянии, в котором SH-группы недоступны и не реагируют с NO. C HbO2 в другой конформации NO реагирует с образованием нитрозотиола по SH-группе ß-93-цистеина. Нитрозотиол может поставлять NO в реакции с тиолами и другими соединениями и является одной из основных форм хранения NO. В связи с этим представлялось важным исследовать, как реагируют нитрозильные комплексы железа с SH-группой ß-93-цистеина в HbO2 и мет№ и с этими формами Hb. Оказалось, что той концентрации и скорости, с которой комплекс (7) выделяет NO в раствор, достаточно, чтобы в этих формах Hb образовывался нитрозотиол. Кроме того, был установлен очень интересный факт: комплекс 7 действует как NADH-метгемоглобин редуктаза и восстанавливает метИЪ с большой скоростью в Hb.
Авторы выражают благодарность Емельяновой Н.С. за синтез и предоставление комплекса (7) и РФФИ (грант № 06-03-32381) за финансовую поддержку.
1) Butler A.R, Megson I. L. // Chem. Rev. 2002. 102, 1155.
2) Граник В. Г., Григорьев Н. Б. // Известия АН Сер. хим.. 2002. № 8, 1268.
3) Gladwin M.T., Schechter A.N., Kim-Shapiro D.B., et al. // Nat. Chem. Biol. 2005. 1, 308.
4) Санина Н.А., Алдошин С.М. // Изв. АН Сер. хим. 2004. 11, 2326.
5) Sanina N.A., Rakova О.А., Aldoshin S.M., et. al. //Mend. Communication. 2004. 1, 9.
6) Sanina N.A., Aldoshin S.M., Rudneva T.N., et. al. // J. Mol. Structure. 2005. 752, 1, 110.
7) Sanina N.A., Rudneva T.N., Aldoshin S.M., et. al. // Inorganica Chimica Acta, 2006. 359, 570.
8) Sanina N.A., Syrtsova L.A., Shkondina N.I., et. al. // Nitric Oxide: Biology and Chemistry, 2007. 16, No. 2, 181.
9) Moore K.P., Mani A.R. //Methods in Enzymol. 2002. 359, 256.
