CC BY
8УДК 575.174.015.3
М.Е. Михайлова, Е.Л. Романишко
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ЭСТРОГЕНОВОГО РЕЦЕПТОРА ESR1-PVUII, МАРКЕРА ПЛОДОВИТОСТИ СВИНЕЙ,
С ПОМОЩЬЮ HRM-АНАЛИЗА
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Различия в уровне продуктивности между отдельными животными, линиями и породами обусловлены, с одной стороны, средовыми, а с другой - генетическими факторами. Большинство хозяйственно полезных признаков сельскохозяйственных животных относится к полигенным признакам, т.е. их количественный уровень генетически определяется целым рядом генов (локусов), разбросанных по всему геному. Такие локусы получили название локусов количественных признаков (QTLs, Quntitative Trait Loci) [1]. Одним из перспективных направлений использования QTLs в животноводстве является молекулярно-генетический анализ генов-кандидатов, которые кодируют ключевые белки, ответственные за проявления признака.
Важным фактором, влияющим на эффективность производства свинины, является репродуктивный выход. Выявление молекулярных маркеров, влияющих на показатели воспроизводства - на первом плане у многих молекулярных генетиков и селекционеров. Для управления селекционным процессом и ведения генетического мониторинга в свиноводстве значительный интерес представляет ген эстрогенового рецептора ESR1, являющийся ДНК-маркером плодовитости свиней [2].
Эстрогены - стероидные половые гормоны, способные регулировать рост, диффе-ренцировку и функции в различных клетках и тканях млекопитающих, играющие центральную роль в регуляции процессов размножения. Проводниками гормональных сигналов являются эстрогеновые рецепторы (ESR), представленные в клетках-мишенях органов животных. В настоящее время широко известны два типа эстрогеновых рецепторов - ESR1 и ESR2, которые являются
транскрипционными факторами, имеющими центры связывания с регуляторными участками ДНК (промоторами, энхансерами). Гены ESR у свиньи локализованы на коротком плече 1 хромосомы (SSC1) в регионе p.2.5-p.2.4 [3]. Ген ESR1 получил наиболее широкое распространение в качестве генетического маркера плодовитости свиней.
Для ESR1-PvuII полиморфизма характерна взаимосвязь с репродуктивными признаками свиней породы крупная белая (масса гнезда при рождении, процент мертворожденных поросят и т.д.) [4]. Свиноматки с различными генотипами отличаются по воспроизводительным качествам. Установлено положительное влияние аллеля В на воспроизводительную функцию свиней, в частности, на многоплодие свиней английской крупной белой породы. Свиньи этой породы получили данный аллель от китайской многоплодной породы мэйшан в процессе ее создания в XIX в. с последующей передачей аллеля породам, созданным с участием крупной белой свиньи. В результате исследований установлено, что предпочтительным с точки зрения селекции является генотип ВВ. Превосходство по многоплодию маток составило 0,9 поросенка по сравнению с генотипом АА, а по размерам гнезда на 0,71,4 поросенка [5, 6].
В настоящее время для определения полиморфизма ESR1-PvuII используется традиционный метод анализа ПЦР-ПДРФ, который является достаточно длительным по времени и затратным. Цель работы заключалась в разработке достоверного и недорогого экспресс-метода для определения полиморфизма ESR1-PvuII с использованием технологии HRM для массового скрининга животных, а также оценка его эффективности в сравнении с методом ПЦР-ПДРФ.
Материалы и методы
В качестве объекта исследования в работе были использованы свиньи белорусской крупной белой породы. Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из биологического материала - проб ткани (ушной выщип) и цельной крови. Для выделения ДНК использовали набор реагентов для выделения ДНК «Нуклеосорб» (Праймтех, Беларусь). Была проанализирована выборка животных (n = 125) по полиморфизму ESR1-PvuII гена эстрогенового рецептора. Количество выделенной ДНК определяли с помощью Qubit® 2.0 Fluorom-eter с использованием набора Molecular probes Qubit®ds DNA BR Assay kit (Life technologies, США). Для постановки ПЦР-РВ и проведения HRM-анализа геномная ДНК образцов была нормализована (концентрация 4 нг/мкл).
ПЦР-ПДРФ метод. Для амплификации фрагмента гена ESR1 длиной 120 п.н. использованы прямой праймер 5'-CCTGTT TTTACAGTGACTTTTACAGAG-3 ' и обратный праймер 5 '-CACTTCGAGGGTCAGTC-CAATTAG-3' (Short, 1997) [7]. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала деионизированную воду, 1x ПЦР буфер, 1,5 mM MgCl2, 200 мШ смеси dNTP, 300 hM каждого праймера, 1,5 U Taq-полимеразы (Thermo scientific, Литва) и 50 нг геномной ДНК. Амплификацию проводили на приборе С1000™ Thermal Cycler (Bio-Rad, США) при следующих условиях: 94 °С - 4 мин; 35 циклов: 94 °С - 30 с, 58 °С - 40 с, 72 °С -40 с; 72 °С - 5 мин. Рестрикция продуктов амплификации длилась в течение ночи при 37 °C с использованием рестриктазы PvuII ("Thermo scientific", Литва). Идентификацию фрагментов после рестрикционного анализа проводили в 4%-ном агарозном геле (SeaKem® Le Agarose, Lonsa) с использованием интеркалирующего красителя ZUBR Green-1 (Праймтех, Беларусь) относительно маркера молекулярных масс DNA Ladder (Thermo scientific, Литва).
Секвенирование ДНК. Специфичные ПЦР-продукты изучаемого локуса гена ESR1 вырезали из геля и очищали с помощью набора реагентов
Silica Bead DNA Gel Extraction Kit (Thermo scientific, Литва) согласно прилагаемой производителем инструкции по применению. Для постановки секвенирующей ПЦР использовали Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Секвенирующую ПЦР проводили согласно следующим условиям: 96 °С - 1 мин; 25 циклов: 96 °С - 10 с, 50 °С -5 с, 60 °С - 4 мин; 16 °С - 5 мин. ПЦР-продукты после секвенирующей ПЦР очищали от непрореагировавших флуоресцентно меченых терминаторных нуклеотидов переосаждением этанолом/ №2ЭДТА. Определение нуклеотидной последовательности проводили на 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).
HRMA (High Resolution Melting Analysis). Образцы геномной ДНК животных (n = 51) анализировали с использованием технологии HRM-анализа на приборе CFX96 (BioRad, США). Для амплификации фрагмента гена длиной 120 п.н. использованы праймеры, описанные ранее (Short, 1997). Реакционная смесь в общем объеме 25 мкл содержала 1х ПЦР мастер-микс (Синтол, Россия) с интеркалирующим красителем EvaGreen, 500 нМ каждого праймера и по 20 нг ДНК каждого образца. Условия проведения амплификации и HRM-анализа были следующими: 95 °C - 5 мин.; 35 циклов: 95 °C - 10 с, 63 °C - 30 с, 72 °C - 15 с; 94 °C -1 мин., 72 °C - 30 с; Melt Curve 72 °C-85 °C: Increment 0,2°c - 5 с. Анализ результатов проводили с помощью программного обеспечения для HRM-анализа Precision Melt Analysis™ software.
Пост-HRMсеквенирование. После определения генотипов методом HRM по 4 образца из каждого кластера с генотипами АА, ВВ, АВ были секвенированы. Полученные ПЦР-продукты после HRM-анализа очищали с помощью набора реагентов Silica Bead DNA Gel Extraction Kit (Thermo scientific, Литва). Секвенирующию ПЦР ставили с ипользованием BigDye® Terminator v3. 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Определение нуклеотидной последовательности проводили на генетическом анализаторе 3500 (Applied Biosystems, США).
Результаты и обсуждение
Выборка свиней (п = 125) белорусской крупной белой породы исследована для определения полиморфизма ESR1-PvuII методом ПЦР-ПДРФ. Выявлено 58 особей с гомозигот-
ным генотипом АА, 16 особей с гомозиготным генотипом ВВ и 51 особь с гетерозиготным генотипом АВ. Частоты встречаемости аллелей и генотипов представлены в табл. 1.
Таблица 1
Генетическая структура выборок из популяций разных пород и помесей свиней
Генотипы Породы и помеси свиней
Белорусская крупная белая Белорусская черно-пестрая БЧПхД Дюрок ГОхЛ КБхЙ
Ф Т Х2 Ф Т Х2 Ф Т Х2 Ф Т Х2 Ф Т Х2 Ф Т Х2
АА 14 15,75 0,81 14 15,2 1,99 6 5,4 1,15 19 19 0,01 3 2,45 1,37 2 1,8 0,14
АВ 34 30,5 11 8,6 2 3,1 1 0,99 1 2,1 2 2,4
ВВ 13 14,75 0 1,2 1 0,4 0 0,01 1 0,45 1 0,8
Аллели Частоты аллелей ± Sp
А 0,508±0,064 0,780±0,083 0,778±0,138 0,975±0,035 0,700±0,205 0,600±0,219
В 0,492±0,064 0,220±0,083 0,222±0,138 0,025±0,035 0,300±0,205 0,400±0,219
Примечание: БЧП х Д - белорусская черно-пестрая х дюрок, КБ х Л - крупная белая х ландрас, КБ х Й -крупная белая х йоркшир, Ф - фактическое число особей, Т - теоретическое число особей, х2 - критерий хи квадрат.
Частота предпочтительного по признаку многоплодия аллеля В составила 0,332. Все изученные популяции находились в состоянии генетического равновесия по закону Харди-Вайнберга. У свиней породы белорусская крупная белая выявлена наибольшая частота предпочтительного аллеля
В (0,492) в сравнении с особями породы дюрок, где частота предпочтительного генотипа составила (0,025). Результаты ПЦР-ПДРФ анализа, полученные с помощью системы гель-документирования Quantum ST4 («Vil-ber lourman», Франция), представлены на рис. 1.
М 10 11 12 13 14 15 16 17
Рис. 1. Определение полиморфизма ESR1-PvuII методом ПЦР-ПДРФ М - маркер FastRulerUltra Low Range DNA Ladder, дорожки 8, 16 - гомозиготный генотип АА (120 п.н.); дорожки 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 13, 14, 15, 17 - гетерозиготный генотип АВ (120 п.н., 65 п.н., 55 п.н.); дорожки 3, 10, 12 - гомозиготный генотип ВВ (65 п.н., 55 п.н.).
После ПЦР-ПДРФ анализа были отобраны 3 образца с различными генотипами: гомозиготным генотипом АА, гетерозиготным генотипом АВ и гомозиготным генотипом ВВ. Данные образцы были секвенированы с
целью их дальнейшего использования в качестве контрольных образцов для HRM-анализа. Оценка и обработка результатов проводились с использованием программного обеспечения Sequencing Analysis версия 5.4 (рис. 2).
Рис. 2. Секвенирование образцов для выявления полиморфизма ESR1-PvuII и определения генотипов АА, ВВ, АВ
По результатам секвенирования было выявлено, что полиморфизм ESR1-PvuII включает две однонуклеотидные замены ^ЫР) 65А^О, в гене ESR1 интрон 3 ^епВапк ОТ947272). Только наличие двух дает сайт рестрикции для эндонуклеазы PvuII, что позволяет выявлять особей с генотипом ВВ.
Из общей выборки исследованных жи -вотных были отобраны свиньи белорусской крупной белой породы (п = 51) для определе-
ния полиморфизма ESR1-PvuII методом ПЦР в реальном времени с использованием НЯМ-анализа. Анализ НЯМ был выполнен с помощью программного обеспечения после амплификации специфичного продукта в режиме реального времени. Этот анализ состоял из одного цикла с повышением температуры от 72 °С до 85 °С, где изменения флуоресценции измеряли при каждом подъеме температуры на 0,2 °С в течение 5 с.
Первая реакция амплификации на CFX96 была также проверена на наличие неспецифических продуктов на 4%-ном агарозном геле (рис. 3).
Для определения генотипов в исследуемых образцах использовали кривые плавления (рис. 4). В результате исследуемые образцы
12 3 4 5 6 7|
-
_200 п.н.
100 п.н. 50 п.н.
образовывали три четких кластера, соответствующие генотипам АА, ВВ, АВ.
Деление на кластеры по результатам НЯМ анализа было подтверждено пост-НЯМ-секвенированием, результаты которого представлены на рис. 5 (справа).
Рис. 3. ПЦР-продукт после HRM-анализа Рис. 4. Результаты HRM-анализа в программе
на 4%-ном агарозном геле. Precision Melt Analysis™ software М - маркер FastRulerUltra Low Range DNA Ladder #SM1233, дорожки 1-9 - амплификат (120 п.н.).
Рис. 5. Результаты пост-НКМ-секвенирования
Плавление с высоким разрешением (High Resolution Melts, HRM) - это технология, используемая после проведения ПЦР в реальном времени, основана на определении различий в кривых плавления (диссоциации ДНК) с помощью специального программного обеспечения. HRM начинается с ПЦР-амплификации интересующей области в присутствии интерка-
лирующего красителя (SYTO® 9, EvaGreen®, SYBR Green I), который имеет высокую флуоресценцию при связывании с дцДНК и низкую флуоресценцию в свободном состоянии. Далее осуществляется плавление продукта: двойная спираль ДНК диссоциирует с высвобождением интеркалирующего красителя и снижением уровня флуоресценции. Процесс измене-
ния уровня флуоресценции в зависимости от температуры отслеживается с помощью специального программного обеспечения и преобразует полученные данные в виде графика кривой плавления. При изменениях в структуре ДНК кривая плавления меняется. Эта разница может быть очень небольшой, в доли градуса, однако даже с помощью этой разницы можно выявлять однонуклеотидные замены ^ЫР), маленькие ин-
серции, делеции и метилирование ДНК.
Эффективность НЯМ-анализа в сравнении с ПЦР-ПДРФ методом для определения полиморфизма ESR1-PvuII: высокая чувствительность, низкий риск контаминации (ПЦР и плавление продукта амплификации проводится в 1 закрытой пробирке), воспроизводимые и точные результаты, быстрый по времени (исключается этап электрофореза), недорогой по стоимости.
Заключение
Технология HRM-анализа характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, является быстрой по времени и недорогой по стоимости, что позволяет использовать ее как экспресс-метод для выявления полиморфизма ESR1-PvuII для массового скрининга животных в селекционно-племенной работе в свиноводстве.
Развитие молекулярно-генетических исследований и ДНК-технологий позволяет выявлять предпочтительные аллели и генотипы, что даст возможность прогнозировать развитие хозяйственно полезных признаков у животных для быстрого введения в популяцию особей желаемого генотипа с целью повышения рентабельности производства свинины.
Список использованных источников
1. Эрнст, Л.К. Биотехнология в животноводстве / Л.К. Эрнст, Н.А. Зиновьева. - М.: ВИЖ, 2008. - 510 с.
2. Terman, A. Estrogen receptor gene (ESR) and semen characteristics of boars / A. Terman, M. Kmiec, D. Polasik // Arch. Tierz., Dummerstorf. - № 49. - 2006. -С. 71-76.
3. Сметник, А.А. Эстрогеновые рецепторы и их функции (обзор литературы) / А.А. Сметник // Проблемы репродукции. -№ 3. - 2011. - С 31-37.
4. Association with litter size of new polymorphisms on ESR1 and ESR2 genes in a Chinese-European pig line / G. Munoz [et al.] // Genet. Sel. - Vol. 39. - 2007. - C. 195-206.
5. Зиновьева, Н.А. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных/Н.А. Зиновьева,Е.А. Гла-дырь, Л.К. Эрнст, Г. Брем // ВИЖ. - 2002. -С. 68-70.
6. Шейко, И.П. Селекция на повышение многоплодия свиноматок крупной белой породы методом молекулярной генной диагностики / И.П. Шейко, Н.А. Лобан, О.Я. Василюк, Д.С. Драбинович // Весщ нацыянальнай акадэми навук Беларусь - № 3. - 2006. - С. 77-81.
7. Effect of the estrogen receptor locus on reproduction and production traits in four commercial pig lines / T.H. Short [et al.] // Journal Animal Science. - № 75. - 1997. -С.3138-3142.
Дата поступления статьи 2 мая 2014 г.
