CC BY
254
DOI: 10.24411/2074-5036-2019-10041 УДК 615.91.63:632/638.158.2
Ключевые слова: медоносные пчёлы, пестициды, инсектициды, интоксикация пчел, газовая хроматография, пробоподготовка QuEChERS, подмор пчелиный
Keywords: honey bees, pesticides, insecticides, intoxication of bees, gas chromatography, sample preparation QuEChERS, the corpses of bees
Роик Б. О., Ермилов И. В.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕСТИЦИДОВ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ПОДМОРЕ МЕДОНОСНЫХ ПЧЕЛ ПОСЛЕ ЛЕТАЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
DETERMINATION OF PESTICIDES BY GAS CHROMATOGRAPHY IN THE CORPSES OF HONEY BEES AFTER LETHAL INTOXICATIONS
ОБУ «Курская областная ветеринарная лаборатория» Адрес: 305003, Россия, Курск, Верхнеказацкий пер., д. 9 RBI «Kursk regional veterinary laboratory» Âdress: 305003, Russia, Kursk, Verhniykazatsky st. h. 9
Роик Богдан Олегович, ведущий инженер химико-токсикологического отдела,
E-mail: bogdan.bioCHEM.roik@mail.ru. Тел.: 8-910-216-8238. Roik Bogdan Olegovich, leading engineer of chemical and toxicological department. E-mail: bogdan.bioCHEM.roik@mail.ru. Tel.: 8-910-216-8238. Ермилов Иван Валерьевич, руководитель учреждения, кандидат ветеринарных наук.
Тел.: 8-909-238-6260.
Ermilov Ivan Valer 'evich, Director of the head of the institution, PhD of Veterinary Scienses.
Tel.: 8-909-238-6260.
Аннотация. Определение пестицидов в пчелином подморе является весьма актуальной, и в то же время трудной для практической реализации задачей. Трудность, в основном, заключается в отсутствии утвержденных методических указаниях или ГОСТов по проведению соответствующей пробоподготовки биоматериала и газо-хроматографического анализа. Таким образом, в работе представлена разработка методики определения хлор-и фосфорорганических пестицидов в подморе пчел методом газовой хроматографии. Проведена валидация процесса подготовки патматериала пчел по современному и эффективному методу QuEChERS. Разработанный и прошедший валидацию метод определения пестицидов в трупах пчел носит рекомендательный характер и может быть использован ветеринарными лабораториями при возникновении вспышек массовой гибели медоносных пчел.
Summary. Determination of pesticides in bee corpses is a very important, but at the same time difficult for practical implementation task. The difficulty mainly lies in the absence of approved guidelines for the appropriate sample preparation of biomaterial and gas chromatographic analysis. Thus, the paper presents the development of methods for determining pesticides in bee subpestilence by gas chromatography. Validation of the process ofpreparation of bee pathological material for a modern and efficient QuEChERS method was conducted. Developed and validated mathod for determination of pesticides in the corpses of bees is advisory and can be used by veterinary laboratories in the event of outbreaks of mass death of honey bees.
Введение
Влияние пестицидов на организм пчел. Садоводам и фермерам довольно часто приходится сталкиваться с проблемами, связанными с порчей растений и плодов по причине образования насекомых-вредителей, грибковых и прочих неблагоприятных образований. Защитить свой урожай от наплыва таких вредителей и различных случаев, возможно только с применением специальных агрохимических препаратов - инсектици-
дов, которые обладают уничтожающим действием на вредных насекомых, включая их потомство. Но если для борьбы с насекомыми-вредителями, их личинками и яйцами, эффективными препаратами являются ядохимикаты из класса инсектицидов, то для полезных насекомых они оказывают вредное и губительное действие, в большинстве случаев летальное. К тому же, у многих вредных насекомых уже выработана генетическая устойчивость к большинству препа-
69
ратов идентичного действия и состава, что не сказать, например, о пчелах.
Причинами возникновения летальной интоксикации пчел может стать неправильная организация трудовой деятельности агрохимических компаний при обработке сельскохозяйственных угодий и полей. Так же, известно длительные токсикозы пчел, протекающие практические без симптомов, которые возникают вследствие поедания пчелами меда, с занесенным в улей вместе с пыльцой летальным количеством инсектицидов [8, 9, 11]. Причинами отравления пчел пестицидами могут быть различные факторы, чаще всего обусловленные некомпетентностью персонала агрофирм, проводящих обработку полей [8]. Пчелы являются весьма чувствительными насекомыми даже для незначительных микроколичеств пестицидов, а именно инсектицидного ряда. В итоге, после того, как ядохимикаты попадают на цветочные растения, пчелы заносят собранную отравленную пыльцу и нектар в улей. Поэтому пчелы все чаще подвержены неумышленной летальной интоксикации различными пестицидами даже и в зимний период. Агро-химикаты, попавшие в мёд, которым пчелы кормятся, убивают их спустя некоторое время. Выжившие после интоксикации пчелы способны рождать трутней с мутациями или иными генными дефектами. Основным признаком токсикоза является массовая гибель летных пчел, причем основная часть погибает сразу же в поле, другие особи, долетев до улья, погибают возле него [8, 11].
В основном, сельское хозяйство при обработке полей использует ядохимикаты контактного и системного действия (пи-ретроидные, хлор- и фосфорорганические пестициды), которые проникают через наружные защитные покровы пчел [12]. Фос-форорганические ядохимикаты, по числу соединений, применяемых в сельском хозяйстве, занимают первое место наряду с другими классами органических химикатов. Отдельные группы данного класса пестицидов, являются частыми виновниками отравления медоносных пчел при обработке сельхозкультур [6]. Даже при незначительном отравлении симптомы выражаются в большинстве
70
случаев в возбуждении центральной нервной системы, в параличе и судорогах конечностей, в потере координации движений насекомого, и почти всегда приводит к интоксикации и гибели пчелы.
В составе пчелиного подмора чаще всего содержатся компоненты пыльцы, воск, маточное молочко, прополис, остатки меда, аминокислоты, ферменты, гормоноподоб-ные вещества, хитин, жир, пищевые волокна и другие составляющие. При этом известно, что наружный покров насекомых состоит из кутикулы и гиподермы. Кутикула представляет собой прозрачную влажную оболочку, которая помогает насекомым сохранить водный баланс при помощи секреторных выделений, распределенных по всей поверхности организма насекомого. Состоит кутикула из эпикутикулы, экзокутикулы и эндокутикулы. Все три слоя кутикулы являются своего рода барьерами, выполняющими защитную функцию. Проникновение ядовитых веществ в тельце пчелы происходит через верхние покровы и зависит от степени проницаемости самой кутикулярной оболочки. В основном, проницаемость покровов кутикулы обуславливается толщиной и органическим составом, в который обычно входят такие компоненты, как липоиды, хитин и протеин. Экзокутикула и эндокутикула выполняют защитную функцию от механических частиц, попадающих в насекомое. Эпикутикулу следует считать первым барьером, стоящим на пути проникновения контактных инсектицидов в организм пчелы. Гиподерма является внутренней оболочкой и имеет всего один слой, образованный подкутикулярными клетками [5].
Проникновение инсектицидов через покровы тельца пчелы связано в основном с явлением проницаемости живых мембран, а не с эффектом обычной диффузии [2, 3, 5]. К тому же, задержка инсектицидной пыли на лапках, крылышках и ворсинках тельцев медоносных пчел способна попадать в мед вместе с пыльцой, а также заражать других особей. Считается, что в местах расположения щетинок и волосков тела насекомого, кутикула имеет тонкий слой, через который проникновение инсектицидов происходит
гораздо быстрее. На рисунке 1 представлен вид ворсинок, расположенных на крылышках пчел.
У пчел также весьма уязвимыми и чувствительными являются лапки, так как они покрыты щетинками, которые удерживают частицы пестицидов, а также тонким слоем кутикулярной оболочки, через которые происходит интоксикация контактным инсектицидом. На рисунке 2 представлены щетинки, покрывающие лапки пчел.
Многие исследователи ссылаются на то, что пестициды из класса хлорорганических препаратов являются весьма губительными для насекомых. Интоксикации чаще всего подвергаются и полезные насекомые - медоносные пчелы [5, 11, 14, 16,17].
В настоящее время существует и применяется в сельском хозяйстве достаточно много пестицидов, относящихся к различным группам и классам опасности. В основном, широкое применение в сельском хозяйстве приобрели хлор-, фосфор-, ртутьорганиче-ские соединения, а также в последнее время активное применение отводится пиретроид-ным инсектицидам. Последние, в свою очередь, обладают широким спектром губительного действия для насекомых-вредителей, но являются весьма токсичными для пчел и других полезных насекомых.
Значительный ущерб пчеловодству и резкий упадок численности насекомых-опылителей приносят неправильное и некорректное применение инсектицидов. Профилактика отравлений пчел может быть достигнута только при правильном использовании пестицидов, хранении их на складе по соответствующим нормам и технологиям, а также в утилизации отработанных контейнеров и пакетов полным сжиганием [8].
В периоды массовых обработок агрофирмам следует проводить специальные мероприятия, которые подразумевают извещение пчеловодов о предстоящей химической обработке, вследствие которого пасеки должны быть перенесены на безопасное расстояние (5-7 км) от места использования ядохимикатов. В свою очередь, пчеловоды обязаны обеспечить соответствующие меры по защите ульев и изоляции медоносных пчел. При
Рис. 1. Ворсинки, расположенные на крылышках пчел, на которых происходит удерживание мелких частиц контактных инсектицидов
этом каждая пасека должна иметь ветеринар-но-санитарный паспорт, подписанный и заверенный главным ветеринарным врачом [1, 4, 6, 7]. Изолирование пчелиных семей осуществляется по специально разработанным пчеловодческим приемам (перевозка пасек, изоляция пчел в гнезде, изоляция при помощи сетки и др.), а контроль за данной операцией осуществляется ветеринарной службой и службой по защите растений [1, 8].
Определение пестицидов в пчелином подморе является весьма актуальной, но в то же время трудной для практической реализации задачей. Трудность, в основном, заключается в отсутствии утвержденных методических указаний и ГОСТов по проведению соответствующей пробоподготовки биоматериала и газохроматографического анализа. Данную проблему, вызванную отсутствием конкретной методики пробоподготовки, возможно
Рис. 2. Щетинки, покрывающие лапки пчел
71
решить только при точном определении принадлежности патматериала подмора пчел и классификацию самого биоматериала. Таким образом, классифицированный биоматериал подмора, логически, можно будет подготавливать и анализировать по аналогии с образцами схожей формы и консистенции, осуществив перенос методики исследования с соответствующим валидационным подтверждением. Большинство применяемых пестицидов для сельского хозяйства подвержены детоксикации через 1-7 дней, в зависимости от класса опасности пестицидов, после чего они становятся безвредными для пчел [1].
Отравление пчел пестицидами, пусть даже неумышленное, влечет за собой уголовную ответственность аграриев, обрабатывающих поля без предварительного предупреждения пасечников. В основу разработки и тестирования любого агрохимиката должна быть положена концепция определения токсикологического влияния на организм пчел. Следует отметить, что многие производители инсектицидных препаратов все же указывают на этикетке класс опасности и влияние активного вещества на пчёл. Однако, трудность, с которой предстоит столкнуться как пасечнику, так и исследователю, состоит в сложности подсчета ущерба, вызванного протравкой полей ядохимикатами, пагубно влияющими на пчёл. К тому же, во-первых, гибель пчел должны подтвердить соответствующие органы власти и ветеринарная служба. Во вторых, доказать гибель пчел при судебном разбирательстве, будет весьма трудно из-за отсутствия все тех же утвержденных государственных химико-аналитических методик, чем должен руководствоваться исследователь при определении пестицидов в биоматериале подмора пчел. При явных признаках отравления пчел, когда лабораторная диагностика не может быть проведена из-за отсутствия соответствующей методики определения пестицидов в подморе пчел, решение ветеринарной комиссии о предполагаемой причине гибели пчел является окончательным результатом [7]. Несмотря на то, что Федеральный закон «О пчеловодстве» был принят в РФ, районы и областные
72
центры по-прежнему испытывают нехватку экспертов и ветеринарных врачей, специализирующихся на отрасли пчеловодства, особенно связанной с интоксикацией и гибелью пчел. В основном отсутствуют специалисты по хроматографическим исследованиям, область которых направлена на определение остаточного количества пестицидов в трупах медоносных пчел.
Методические рекомендации, представленные НИИ Пчеловодства, описывают определение пестицидов в трупах пчел, основанные на качественных исследованиях и фотометрическом и химическом анализах, при этом достаточно хорошо продемонстрирована подготовка патматериала пчел к исследованиям различными методами экстракции органическими растворителями [6].
Цель работы состояла в адаптации и оптимизации метода QuEChERS в пробоподго-товке биоматериала к исследованию, а также в получении валидационных характеристик для газохроматографического анализа пестицидов в пчелином подморе.
Материалы и методы
Работа была выполнена в химико-токсикологическом отделе ОБУ «Курская областная ветеринарная лаборатория». Разработку и валидацию методики определения пестицидов в пчелином подморе проводили с применением современного оборудования и метода пробоподготовки. Таким образом, патологический материал пчел подготавливали к анализу на пестициды в соответствии с методическими рекомендациями метода QuEChERS (КУЭЧЕРС, Интерлаб, IL-5650-Экстракционный набор VetExQ, или другой стандартизованный QuEChERS). Определение пестицидов осуществлялось методом высокоэффективной газовой хроматографии на приборе «Хромос ГХ-1000» (Россия, ООО «Хромос»), с детектором по захвату электронов (ЭЗД) и капиллярной колонкой «VF-1701» for Pesticides (30мх0.32ммх0.25мкм).
Отбор патматериала пчел для анализа. Для подтверждения токсикоза и отравления медоносных пчел пестицидами в ветеринарную лабораторию следует направлять пробы трупов пчел, меда, пыльцы или перги,
а также растения с обработанного участка для одновременного и сравнительного анализа. Соответственно, отбор проб и пересылка материалов осуществляется по установленной методике под контролем ветеринарного специалиста. Вместе с пробами в ветеринарную лабораторию направляется сопроводительный документ, в котором следует указать опись содержимого и предполагаемый пестицид или препарат, на который необходимо провести исследование. К сопроводительному письму должен быть прикреплен комиссионный акт о предположительном отравлении пчел. По установленным нормам, срок предоставления проб для исследования на пестициды не должен превышать 5-7 суток с момента отбора материала [8]. Для фосфорных пестицидов не более 3 суток.
Установлено, что для анализа на пестициды следует предоставлять в лабораторию среднее количество одной пробы до 300-500 пчел (около 25 г) от одной пчелиной семьи, около 300 г свежесобранного меда, сразу же после обнаружения токсикоза пчел, до 200 г перги в соте и около 500 г собранной зеленой массы с обработанного ядохимикатами участка. Каждый образец пробы должен быть упакован и предоставлен в соответствующем виде, то есть быть опечатанным, пронумерованным и с указанным номером пчелиной семьи. Также упаковка подразумевает исключение возможного соприкосновения и перемешивания проб в процессе доставки.
Методика пробоподготовки QuEChERS (рекомендации). Основной проблемой при анализе пестицидов в подморе пчел является отсутствие утвержденной методики про-боподготовки или методических рекомендаций, с описанием газохроматографических условий, приемлемых для определения ядохимикатов. Ко всему прочему, стоит отметить и то, что патологический материал подмора пчел трудно соотнести с конкретным биоматериалом, матрица которого имеет аналогичный компонентный состав, структуру и тип волокон, а также консистенцию, что позволило бы без труда определить подходящую методику пробоподготовки и условия хроматографического анализа при помощи переноса и верификации.
В данной работе была использована методика пробоподготовки QuEChERS, основанная на быстрой экстракции искомых компонентов при помощи растворителей и специально подобранных по составу и соотношению солей, а также качественной очистке аликвоты от мешающих анализу примесей (жиров, восков, пигментов и т.д.), что обеспечивается наличием надлежащего сорбента, после чего проба готова к измерению. Само слово QuEChERS является аббревиатурой, образованной от слов (quick, easy, cheap, effective, rugged, safe), характеризующих достоинства данного метода по его эффективности и точности. В силу того, что утвержденные методические указания на подготовку патматериала пчел к хроматогра-фическому анализу пестицидов практически отсутствуют, то данный метод QuEChERS является актуальным и вполне реализуемым вариантом, который может быть использован для осуществления поставленной цели. Методические рекомендации по выделению пестицидов из биологической матрицы пчелиного подмора представлены ниже.
Для анализа следует тщательно перемешать и отобрать среднюю часть пробы пчелиного подмора. Из общей массы отмерить около 1 г (±0.1 г) биологического образца и максимально гомогенизировать в пластиковой пробирке. При необходимости проверки процента извлечения, к содержимому пробирки добавить 1 мл смеси стандартных образцов пестицидов с концентрацией, равной средней точке градуировки.
Экстракцию проводить внесением в пробирку от 5 до 10 мл ацетонитрила, после чего, в течение 1 минуты интенсивно встряхивать. Добавить 0.5 мл концентрированной соляной кислоты и перемешать. После экстракции растворителем добавить одну упаковку буферных солей из набора QuEChERS для усиленной экстракции компонентов. Центрифугировать в течение 10 минут при скорости 3500 об/ мин. Аликвоту верхнего слоя перенести в пробирку из набора объемом 15 мл, которая содержит сорбент для очистки экстракта. Провести повторную экстракцию 3-5 мл ацетонитрилом, центрифугировать
73
Таблица 1
Условия хроматографирования пестицидов
Прибор Газовый хроматограф Хромос «ГХ-1000»
Инжектор/испаритель Капиллярный лайнер, температура инжектора 280°С
Септа на инжекторе Высокотемпературная красная
Детектор Детектор электронного захвата (ЭЗД), температура детектора 300°С
Газ-носитель Газ азот, режим постоянного давления 2 кгс/см2
Деление потока (сброс) 31 мл/мин, 4:1
Поддув газа в детектор 40 мл/мин
Колонка Кварцевая, капиллярная VF-1701 for Pesticides, 30 мх0.32 ммх0.25 мкм
Температура колонки Начальная температура 100°С, задержка 1.5 минуты, конечная температура 300°С, задержка 1.5 минуты, скорость подъема температуры 10°/мин Время анализа 23 минуты
Объем пробы 1.0 мкл аликвоты инжектируется в систему
Дозирование Ручное, микрошприц 10 мкл
и объединить слои в пробирке с сорбентом. Далее эту пробирку следует интенсивно встряхивать, а затем при тех же условиях центрифугировать. Верхнюю часть аликвоты упарить досуха в токе воздуха при 40-50°С. Сухой остаток восстановить в 1 мл н-гексана, пропустить через одноразовый шприцевой фильтр с порами 0.45 мкм в виалу для последующего хро-матографического анализа.
Условия хроматографирования (рекомендации). Условия для хроматографического анализа пестицидов в биологическом материале указаны в таблице 1.
Выход анализируемых пестицидов: Гек-сахлорбензол (ГХБ), альфа-ГХЦГ, гамма-ГХЦГ, метафос, фосфамид, карбофос, 4.4-ДДЭ, 4.4-ДДД, 4.4-ДДТ.
При анализе патматериала необходимо проводить исследование холостого образца, а затем образца реальной пробы. На рисунке 3 представлена хроматограмма контрольного «холостого» образца пчелиного подмора, не содержащая пиков определяемых пестицидов.
На риснуке 4 представлена хроматограмма с расшифровкой пиков намеренно внесенных в пробу хлорорганических и фосфороргани-ческих пестицидов на фоне неопределяемых пиков биологической матрицы пчелиного подмора.
74
Результаты исследований
Валидация методики. Валидация адаптированного и оптимизированного метода определения пестицидов в пчелином патматериале проводилась по основным валидационным характеристикам - селективность, линейность, воспроизводимость, предел количественного определения и степень извлечения [15].
Название метода: Определение пестицидов методом газовой хроматографии в подморе медоносных пчел после летальной интоксикации.
Аналит. Хлорные и фосфорные пестициды: гексахлорбензол; альфа-, гамма-гек-сахлорциклогексан; 4.4-ДДД; 4.4-ДДЭ; 4.4-ДДТ; метафос; карбофос; фосфамид.
Матрица. Биоорганический патологический материал пчелиного подмора.
Тип валидации. Внутренняя валидация.
; «юрт-
5 £70 .
Е МО .
; ыо .
Рис. 3. Хроматограмма контрольного образца пчелиного подмора
Селективность. Для определения специфичности хроматографической системы был проведен анализ 5 подготовленных по методу QuEChERS чистых образцов пчелиного подмора и образца чистого подмора с прибавлением стандартного раствора смеси хлорных и фосфорных пестицидов с концентрацией 0.500 мкг/мл. На хроматограммах чистых образцов подмора не наблюдалось характерных пиков с временами удерживания, соответствующих временам удерживания хлор- и фосфорорганических пестицидов. Хромато-грамма с добавкой хлорных и фосфорных пестицидов содержала пики интересующих веществ, соответствующие временам выхода перечисленных пестицидов.
Линейность. Для определения линейности всех определяемых в работе пестицидов проводился анализ 4 чистых образцов пчелиного подмора, в каждый из которых прибавлялся стандартный раствор смеси 9 пестицидов до получения концентраций: 0 мкг/мл, 0.2 мкг/мл, 0.5 мкг/мл, 1 мкг/мл. По полученным значениям были построены калибровочные графики, которые охватывали диапазон от 0 до 1000 нг/ мл (0, 200, 500, 1000 нг/мл). График строили методом линейного регрессионного анализа. Калибровочный график отображает зависимость относительного отклика на искомые вещества от концентрации этих веществ.
Так как градуировочный раствор содержал смесь 9 пестицидов, то таблица 2 содержит формулы регрессионных уравнений линейности с поправками и коэффициенты корреляции (К2) для каждого анализируемого пестицида.
Рис. 4. Хроматограмма хлорорганических и фосфо-рорганических пестицидов в биологической матрице пчелиного подмора
Степень извлечения и точность воспроизводимости. Для оценки степени извлечения и воспроизводимости результатов определения пестицидов в пчелином подморе проводился анализ 2 контрольных образцов пчелиного подмора с прибавлением стандартного раствора смеси пестицидов до получения концентраций 200 нг/мл и 500 нг/мл. Для получения более точной оценки каждый образец хроматографиро-вался по 3 раза. Количественное определение проводили по калибровочной кривой. Данные по воспроизводимости результатов и степени извлечения оценивались по относительному стандартному отклонению (ОСОп=5). Результаты, полученные по степени извлечения и воспроизводимости, представлены в таблице 3. Таким образом, из таблицы видно, что для всех 9 пестицидов отмечаются достаточно высокие степени извлечения и точность воспроизведения
Таблица 2
Регрессионные уравнения и коэффициенты корреляции пестицидов
№ Название пестицида Регрессионное уравнение Коэфф. корр., К2
1 Гексахлорбензол + 0.0364 * X - 0.0264 0.997
2 Альфа-ГХЦГ + 0.0250 * X - 0.0948 0.998
3 Гамма-ГХЦГ + 0.0347 * X - 0.0570 0.999
4 Метафос + 0.1993 * X - 0.8330 0.986
5 Фосфамид + 0.1063 * X +0.4649 0.989
6 Карбофос + 1.0484 * X - 0.6070 0.992
7 ДДЭ + 0.0387 * X - 0.0366 0.998
8 ДДД + 0.0685 * X - 0.0309 0.997
9 ДДТ + 0.0518 * X +0.0030 0.999
данных. Полученные величины ОСО соответствуют норме не более 20%.
Предел количественного определения. Хроматограмма предела количественного определения 9 пестицидов в пчелином подморе представлена на рисунке 5.
Предел количественного определения разработанного метода определялся на основании данных линейности и точности воспроизводимости. Таким образом, предел количественного определения для всех пестицидов составил 200 нг/мл. Очередность выхода пиков пестицидов соответствующая.
Обсуждение результатов
Химический токсикоз пчел или отравление медоносных пчел инсектицидами в большинстве случаев проявляется внезапно, вследствие чего насекомые без явных клинических признаков погибают. В некоторых случаях пчелы успевают долететь до улья, но погибают возле него.
Определено, что интоксикация пчелосемей пестицидами чаще всего происходит в результате грубых нарушений установленных правил проведения агрохимизации сельскохозяйственных культур, а также в отсутствие информации и своевременного оповещения
Таблица 3
Степени извлечения пестицидов и воспроизводимость результатов
Внесено 200 нг/мл ОСО, % 500 нг/мл ОСО, %
Аналит Найдено, % Среднее найденное Для п=3 Найдено, % Среднее найденное Для п=3
Гексахлорбензол 85.6 85.4% 0.29 82.1 82.2% 0.19
85.1 82.4
85.4 82.2
Альфа-ГХЦГ 90.2 90.1% 0.50 90.4 90.1% 0.36
89.6 90.3
90.5 89.8
Гамма-ГХЦГ 93.2 92.9% 0.32 95.2 95.3% 0.28
92.9 95.6
92.6 95.1
Метафос 81.5 81.1% 0.43 83.1 83.1% 0.30
80.8 83.3
81.1 82.8
Фосфамид 86.3 86.0% 0.30 84.1 83.7% 0.42
85.8 83.4
85.9 83.7
Карбофос 90.2 90.2% 0.33 92.6 92.4% 0.22
90.5 92.2
89.9 92.4
ДДЭ 93.2 92.8% 0.38 95.2 95.3% 0.10
92.8 95.4
92.5 95.3
ДДД 97.4 97.1% 0.31 95.2 95.0% 0.21
96.8 94.9
97.1 94.8
ДДТ 98.2 98.5% 0.26 97.9 98.2% 0.26
98.5 98.4
98.7 98.2
76
пчеловодов о месте и времени обработок полей в момент массового лёта пчел. И если в случае пищевых продуктов существуют нормы содержания остаточных микроколичеств для большинства пестицидов, то патологический материал, в нашем случае пчелиный подмор, этих норм лишен. На данный момент информация по нормам на патологический материал, особенно на отравление пчел пестицидами, отсутствует.
В работе использовался газовый хроматограф «Хромос ГХ-1000» с детектором по захвату электронов (ЭЗД). Данный детектор является селективным по отношению к хлор-содержащим пестицидам. Было определено, что ЭЗД так же способен определять и фосфорсодержащие пестициды, причем обеспечивая отличный сигнал при определении веществ этого класса. Условия хроматогра-фического анализа подобраны на основании многочисленных опытов.
Для калибровки системы хроматографа готовили смесь стандартных градуировоч-ных растворов с концентрациями 0,2; 0,5 и 1 мкг/мл для хлор- и фосфорорганических пестицидов. В результате измерений были получены калибровочные графики для каждого пестицида с диапазоном концентраций 0 нг/мл, 200 нг/мл, 500 нг/мл и 1000 нг/мл. Хроматографические пики определены по временам удерживания пестицидов согласно установкам прибора. Пробоподготовка -оптимизированная процедура по эффективному методу пробоподготовки QuEChERS, прошедшая внутрилабораторную валида-цию. В исследованиях пробы с добавкой пестицидов использовался совершенно чистый биоматериал пчелиного подмора, в котором ранее не обнаружились остатки определяемых пестицидов.
Ввиду отсутствия конкретных методик пробоподготовки пчелиного патматериала, с последующим газохроматографическим методом определения пестицидов, была разработана методика, в которой важной деталью являлась пробоподготовка по совершенно современному, быстрому и эффективному методу QuEChERS [13], вследствие чего была проведена валидация данного метода в совокупности с газохроматографическим анали-
мВ
го
70
60
0 2 И 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Время, мня
Рис. 5. Хроматограмма чистого образца пчелиного подмора с содержанием пестицидов на уровне предела количественного определения
зом, что характеризует пригодность данного способа для анализа пестицидов разного класса в одной биологической матрице.
Проведенная валидация и адаптация метода определения хлор- и фосфорорганиче-ских пестицидов методом газовой хроматографии в биоматериале пчелиного подмора является внутрилабораторной научно-исследовательской работой. Представленные данные отражают характерные результаты исследований, а приведенные рекомендации по хроматографическому анализу могут быть использованы другими лабораториями в качестве вспомогательного информационного материала. Таким образом, данный материал может быть дополнен анализом других хлор- и фосфорорганических пестицидов с соответствующими расчетами и валидацией методики определения.
Заключение
В результате работы была проведена ва-лидация и приработка метода QuEChERS на возможность определения хлороргани-ческих и фосфорорганических пестицидов в пчелином подморе методом газовой хроматографии с применением детектора по захвату электронов (ЭЗД). Получены соответствующие валидационные показатели по специфичности, линейности, правильности и прецизионности, а также по пределу количественного определения и степени извлечения определяемых компонентов при вы-
77
полнении всех операций пробоподготовки материала, характеризующие пригодность данного способа для анализа пестицидов разного класса в одной биологической матрице - пчелиного подмора.
Представленные в работе данные по определению пестицидов в пробе пчелиного подмора методом QuEChERS отражают характерные результаты. Работа подготовлена на основании материалов, полученных в ходе внутренней валидации разработанного метода определения пестицидов.
Список литературы
1. Буренин Н. Л. Охрана пчел от отравления пестицидами. / Н. Л. Буренин, Г. Н. Котова. // Справочник по пчеловодству. М.: Агропромиздат, 1985. С. 158-161.
2. Вашков В. И. ДДТ и его применение. / В. И. Ваш-ков, Л. Н. Погодина, Н. А. Сазонова. М.: Медгиз, 1955.
3. Вашков В. И. Содержание ДДТ в организме животных и методы его определения. / В. И. Вашков, Н. А. Сазонова. // Труды центрального научно-исследовательского дезинфекционного института. Вып. 7, 1951.
4. Ветеринарно-санитарный паспорт пасеки. Утв. ДВ МСХ и продовольствия РФ 30.08.98 г.
5. Назаров Г. С. ДДТ и Гексахлоран в ветеринарии. Механизм действия ДДТ на организм насекомых. / Г. С. Назаров М.: Сельхозгиз, 1959. С. 44-50.
6. Назаров С. С. Охрана пчел от отравления ядохимикатами. / С. С. Назаров. М.: Изд-во Минпромзага, 1963. 184 с.
7. Прокофьева Л. В. Определение экономического ущерба от отравления и зимней гибели пчелиных семей. Научно-методическое издание. / Л. В. Прокофье-
ва, Л. Ф. Соловьева. Рыбное: ГНУ НИИ пчеловодства, Россельхозакадемия, 2010. 19 с.
8. Соловьева Л. Ф. Инструкция по профилактике отравления пчел пестицидами. / Л. Ф. Соловьева. М.: ГАП СССР, Агропромиздат, 1989. 8 с.
9. Соловьева Л. Ф. Пестициды и пчелы / Л. Ф. Соловьева. // Защита и карантин растений. 2004. № 5. С. 54—55.
10. Соловьева Л. Ф. Химический токсикоз медоносных пчел: профилактика, диагностика и лечение. / Л. Ф. Соловьева. // Сборник научно-исследовательских работ по пчеловодству. Рыбное: НИИП, 2005. С. 194-208.
11. Соловьева Л. Ф. Токсикозы медоносных пчел. / Л. Ф. Соловьева, С. Я. Годяцкий. М., 1995.
12. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. 2007 год. «Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации». М., 2007.
13. Anastassiades M. Fast and Easy Multiresidue Method Employment Acetonitrile Extraction/Partitioning and «Dispersive Solid-Phase Extraction» for the Determination of Pesticide Residues in Produse. / Anastassiades M., Lehotay S. J. // Journal AOAC Int., 2003, 86. Р. 412-431.
14. Fritch H. Versuche zum Analyse des Angriffspunktes kontakt insektizider Stoffs. / Fritich H. // Biol. Zentralblatt, 1952. V. 71. N 9/10. S. 512-528.
15. Hamide Z. Senyuva. A Simple Users Guide to Method Development and Validation. / Hamide Z. Senyuva, John Gilbert. // Method validation, John Gilbert., 2011. P. 43.
16. Hoffmann J. Zur Wirkungsweise neuer insekticides Stoffe. / Hoffmann J., Lendle Z. // Arch. Exp. Path., 1948. V. 205. S. 223.
17. Welch J. The mode of action of certain insecticides on the arthropod nervaxon. / Welch J., Gordon H. //J. Cellular Comp. Physiol., 1949, V. 30. P. 147.
КАК ОФОРМИТЬ ПОДПИСКУ НА ЖУРНАЛ?
А. Через подписной каталог
Индекс в каталоге "Газеты. Журналы" Агентства "Роспечать" - 33184 Б. Через редакцию журнала
Банковские реквизиты для оплаты подписки по безналичному расчету для юридических лиц: ЧОУДПО "Институт Ветеринарной Биологии". ИНН 7802196720. КПП 781301001. Р/с 40703810400000000022 в АО "Горбанк", г. Санкт-Петербург. К/с 30101810200000000814. БИК 044030814
В поле "Назначение платежа" указать:
"Предоплата за подписку на журнал "Актуальные вопросы ветеринарной биологии" на 2019 г. согласно инф. письму б/н от 03.09.18 г. НДС не облагается. Адрес подписки: ..." Стоимость редакционной подписки на 2019 год 2000 рублей.
Адрес редакции: Санкт-Петербург, ул. Ораниенбаумская, 3-Б. Т./ф. (812) 232-55-92, т. 927-55-92. E-mail: virclin@mail.ru; www.invetbio.spb.ru
