CC BY
24DOI: 10.25712/ASTU.2072-8921.2019.01.014 УДК: 579.676
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ТЕРМОУСТОИЧИВОСТИ СПОР ALICYCLOBACILLUS ACIDOTERRESTRIS В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ РЕЖИМОВ СТЕРИЛИЗАЦИИ ФРУКТОВЫХ СОКОВ
М.Т. Левшенко, Т.А. Позднякова, Р.А. Волкова
В настоящее время при производстве соковой продукции большое значение придается выявлению спорообразующих бацилл рода Alicyclobacillus. В представленной работе изучена термоустойчивость спор возбудителя порчи данной продукции A. acidoterrestris. Определение параметров термоустойчивости спор необходимо для разработки оптимальных режимов стерилизации фруктовых консервов. Концентрированный яблочный сок (ЯКС) относится к кислотной группе фруктовых консервов, при разработке режимов их тепловой обработки рекомендуется использовать тест-культуру - аскоспоры плесневого гриба Aspergillus fischeri. Аскоспоры плесневых грибов имеют невысокую термоустойчивость, поэтому нами были определены параметры термоустойчивости спор бактериальной культуры Bacillus macerans, так же являющейся возбудителем порчи фруктовых консервов. Экспериментально установлено, что термоустойчивость спор A. acidoterrestris (Dt 105 0С = 0,96 мин.) превышает термоустойчивость спор B. macerans (Dt 105 0С = 0,44 мин.) в ЯКС более чем в два раза. При этом, величина Z для спор A. acidoterrestris в ЯКС составила 13 0С, а для спор B. macerans - 15,5 0С. Результаты экспериментов показали, что кинетика гибели спор, исследованных тест-микроорганизмов, соответствует кинетике первого порядка в диапазоне температур 90-105 0С. Это значительно облегчает математическую обработку полученных данных и упрощает расчет требуемой летальности при разработке режимов стерилизации (пастеризации) фруктовых консервов.
Ключевые слова: фруктовые соки, концентрированный яблочный сок, термоустойчивость бактериальных спор, режимы стерилизации, Alicyclobacillus acidoterrestris, Bacillus macerans.
ВВЕДЕНИЕ включили в список контролируемых показа-
телей качества концентрированных соков Производство концентрированных соков наличие бактерий рода Alicyclobacillus. Бак-получило широкое развитие во всем мире. терии этого рода - кислотоустойчивые, тер-Содержание растворимых сухих веществ в мо-ацидофильные, спорообразующие, грам-соках можно повысить путем концентрирова- положительные, палочковидные, факульта-ния до 70-75%. Наибольшую часть плодовых тивно-анаэробные бактерии, растут в среде и овощных соков концентрируют выпарива- от 2 до 6 единиц рН при температуре от 16 до нием под вакуумом [1]. 70 0c [5,6]
Для сохранения натуральных свойств Порчу, вызванную бактериями этого ро-
соков выпаривание проводят при возможно да, трудно обнаружить визуально. Испорчен-более низких температурах и в течение ко- ный сок имеет небольшой осадок без газооб-роткого времени. Поэтому споры бактерий, разования, основным доказательством порчи присутствующие в сырье сохраняются жиз- служит лекарственный аромат. Химическое неспособными и могут попадать в готовый вещество, ответственное за этот аромат, бы-продукт [2]. ло идентифицировано как гваякол (2-
Концентрированный яблочный сок methoxyphenol) - продукт жизнедеятельности (ЯКС) традиционно считается стойким к мик- гваяколобразующих бактерий рода робиологической порче из-за его физическо- Alicyclobacillus, одним из которых является химических характеристик: высокой величины вид a. acid0ferrestris [7]. кислотности (pH составляет 3,5 - 4,0), низкой Наиболее достоверные данные о термо-
активности воды (aw менее 0,80) и большой устойчивости получают при прогреве спор концентрации растворимых сухих веществ, тест-культуры непосредственно в том продук-более 60°Brix [3,4]. те, для которого разрабатывают режим сте-
Производители соковой продукции рилизации [8]. В этом случае учитывается
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ТЕРМОУСТОИЧИВОСТИ СПОР ALICYCLOBACILLUS ACIDOTERRESTRIS В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ РЕЖИМОВ СТЕРИЛИЗАЦИИ ФРУКТОВЫХ СОКОВ
влияние всех факторов среды, способствующих повышению или понижению термоустойчивости спор.
Для обоснования тепловых параметров стерилизации, определяют термоустойчивость спор тест-культур в исследуемом продукте с целью определения показателей термоустойчивости Dt и Z [9]:
Dt мин. - продолжительность нагревания при постоянной температуре, в течение которого число жизнеспособных спор уменьшается на один порядок, выражается в минутах,
Z 0C - характеризует изменение величины термоустойчивости Dt в 10 раз, в зависимости от температуры нагревания, выражается в градусах.
Величину Dt определяют экспериментально, прогревая споры тест-культуры в продукте, при различных температурах и временных экспозициях, а величину z получают расчетным путем из значений DT.
Задачей наших исследований являлось определение и сравнение параметров термоустойчивости Dt и Z споровых суспензий бактериальных тест-культур A. acidoterrestris и B. macerans в растворе фосфатного буфера и в ЯКС, капиллярным методом.
Константы термоустойчивости используются для расчета требуемой летальности термической обработки консервов, гарантирующей их промышленную стерильность [10].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Термоустойчивость споровых суспензий тест-культур A. acidoterrestris и B. macerans [9] определяли в растворе 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,98 и в осветленном концентрированном яблочном соке с параметрами: 70 °Brix и рН 3,51, aw =0,75, произведенном на Российском предприятии.
Раствор фосфатного буфера использовался в качестве среды для определения контрольной термоустойчивости выбранных штаммов тест-культур микроорганизмов [11].
Исследования проводили с использованием музейных бактериальных культур микроорганизмов, имеющихся в лаборатории качества и безопасности пищевой продукции ВНИИТеК: гваякол положительный штамм A. acidoterrestris ВКПМ B-10087 и штамм B. macerans 2 BKMG-83.
Споры бактерий A. acidoterrestris получали в соответствии с ГОСТ 33163-2014 «Продукция соковая. Определение бактерий рода Alicyclobacillus» на плотной питательной среде BAT (Alicyclobacillus Agar), фирмы HIMEDIA, Индия. Посевы термостатировали
при 40 0С в течение 4 суток.
Споры культуры B. macerans получали в соответствии с «Руководством ...» [11] на жидкой питательной среде мясопептонный бульон (МПБ) с 1% глюкозы. Посевы активно растущей культуры термостатировали 48-72 часа при 37 0С и затем, выдерживали при 20 0С в течение 10 суток.
Количество образовавшихся спор контролировали микроскопированием нативного препарата с помощью фазово-контрастной микроскопии, с применением микроскопа Zeiss с программным обеспечением AxioVision Rel.4.8 и камерой Canon PC 1200. Культуры содержали преломляющие свет блестящие споры в количестве не менее 70% по отношению к общему числу клеток.
Полученные суспензии содержали в 1 см3 не менее 107 спор.
Титр споровых суспензий устанавливали высевом соответствующих разведений по ГОСТ ISO 7218-2015 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям», как средневзвешенное значение из двух подсчетов последовательных разведений. Подсчет, оставшегося после прогревов, количества жизнеспособных спор в буферном растворе и в ЯКС, так же определяли посевом соответствующих разведений на твердые питательные среды. Для B. macerans на питательную среду МПА с 1 % глюкозы, а для A. acidoterrestris - на Alicyclobacillus Agar.
Параметры термоустойчивости спор Dt и Z в исследуемых средах определяли капиллярным методом и рассчитывали по формулам из кривых выживаемости и термоустойчивости. Существенным моментом, определяющим выбор капиллярного метода, являлась жидкая консистенция ЯКС [12].
Капилляры представляют собой тонкостенные стеклянные трубки, имеющие внешний диаметр 3 мм и длину 7,5 см, споровую суспензию вводили по 0,1 см3. Каждый капилляр содержал не менее 106 спор. Споровые суспензии прогревали в циркуляционном термостате серии LOIP LT-311(Россия), в глицериновой и водной средах.
Для каждого времени прогрева высевали по четыре капилляра и определяли логарифм среднеарифметического числа выживших спор в соответствии с «Руководством ...» [11].
Величину Dt определяли, откладывая на линейной шкале абсцисс продолжительность нагревания, на логарифмической шкале ординат - lg среднеарифметических значений выживших спор. Кривую выживаемости стро-
М.Т. ЛЕВШЕНКО, Т.А. ПОЗДНЯКОВА, Р.А. ВОЛКОВА
или методом наименьших квадратов по уравнению [11]:
у = ах + b , где: у - исследуемая переменная (lg количества спор); х - число, определяющее время прогрева, а - точка пересечения с осью y на графике (максимальный уровень); b - это значение, на которое уменьшается следующее значение временного ряда.
Данному уравнению соответствует линия тренда, которая отражает графическое представление закономерности изменения ряда данных и строится с помощью программы Microsoft Excel.
Для определения величины Z, строили кривую термического отмирания спор, используя значения DT, полученные при четырех температурах прогрева. В полученном решении уравнений, величина «a-1» давала значение DT или Z.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На основании полученных экспериментальных данных можно сделать следующие выводы. Графическое выражение Dт (кривая выживаемости), показывающее зависимость между логарифмом числа выживших клеток и продолжительностью нагревания при постоянной температуре, дало прямую линию при всех исследованных температурах прогрева. Это значит, что кинетика гибели спор, исследованных тест-микроорганизмов, соответствует кинетике первого порядка в диапазоне температур 90-105 0С.
В таблице 1 приведены экспериментально полученные и обработанные расчетным путем данные прогревов споровых суспензий при различных температурах в фосфатном буфере и в ЯКС. На основании математической обработки полученных величин Dт, были вычислены значения т 0С.
Таблица - 1 Термоустойчивость спор B.macerans и A.acidoterrestris
Параметры термоустойчивости спор в растворе фосфатного буфера П а ра метры термоустойчивости спор в концентрированном яблочном соке (ЯКС)
Величина йт для спор, мин.: Величина йт для спор, мин.:
B.macerans A. acidoterrestris B.macerans A.acidoterrestris
90 0С = 1,33 95 0С = 0,51 100 0С = 0,26 105 0С = 0,14 90 0С = 11,45 95 0С = 4,49 100 0С = 0,78 105 0С = 0,33 90 0С = 2,27 95 0С = 1,43 100 0С = 0,62 105 0С = 0,44 90 0С = 14,49 95 0С = 5,49 100 0С = 2,94 105 0С = 0,96
Для спор B. macerans Z = 8,38 0С Для спор A. acidoterrestris Z = 9,32 0С Для спор B. macerans Z =15,5 0С Для спор A. acidoterrestris Z =13,14 0С
Полученные данные по величине термоустойчивости Dт 100 0С=0,26 мин спор B. macerans в фосфатном буфере показали, что параметры термоустойчивости этой тест-культуры, соответствуют требованиям «Руководства ...» [11] к минимальной величине ее термоустойчивости - Dт 100 0С больше 0,2 мин. При этом, величина термоустойчивости Dт в ЯКС фт 100 0С=0,62 мин) более чем в два раза выше, чем в буферном растворе фт 100 0С = 0,26 мин) при одинаковых температурах прогрева.
С повышением температуры прогрева бактериальных спор, величина их термоустойчивости в ЯКС, растет быстрее, по сравнению с термоустойчивостью спор при прогреве в фосфатном буфере. Величина термоустойчивости Dт спор Л. acidoterrestris, также выше в ЯКС ^т 100 0С = 2,94 мин), чем в фосфатном буфере ^т 100 0С = 0,78 мин). Величина термоустойчивости Dт спор Л. acidoterrestris в ЯКС ^т 105 0С = 0,96 мин) превышает величину термоустойчивости спор B.macerans ^т 105 0С = 0,44 мин).
Математическая обработка величин Dт, для получения значений т, представлена на рис. 1 и 2.
Определение г спор В. тасегапБ
* В буфере ■ В яблочном соке
■ к N.
à к " 1 = -0,054) R2 = 0 + 5,273 ,989
\ N
i К 1 -ч •ч ч 1
ь
У = -О.Оббх Нг= 0 +■ 5,888 \
N L
85 90 95 100 105 110
Т, °С
Рисунок 1 - Определение величины Z спор B.macerans в буфере и в ЯКС
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ТЕРМОУСТОИЧИВОСТИ СПОР АиСУаОВАСИШБ ACIDOTERRESTRIS В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-КУЛЬТУРЫ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ РЕЖИМОВ СТЕРИЛИЗАЦИИ ФРУКТОВЫХ СОКОВ
Q
О)
Определение z спор A. acidoterrestris ■ В яблочном соке ▲ В буфере
3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8
85
1 L
"Ч> У = -0,076x + 8,006
Ч) R2 = 0,98 9
ч 1
ч
L4 1 ■
У = -0,107x + 10,748 Ч
R2 = 0,98 !1 N к
90
95т<>с 100 105 110
Рисунок 2 - Определение величины Z спор A.acidoterrestris в буфере и в ЯКС
Величина термоустойчивое™ бактериальных спор В. тасегат в ЯКС составила: г = а-1 =( 0,054) -1= 15,5 0С . При этом, г в буфере равна: г = а-1 =(0,065) -1= 8,4 0С. Термоустойчивость бактериальных спор А. acidoterrestris в ЯКС составила: г = а-1 = ( 0,076) -1= 13,1 0С, а г в буфере равна: г = а-1 =(0,107) -1= 9,3 0С.
Экспоненциальная зависимость величин термоустойчивости от температуры, при определении величин z в полулогарифмической системе, так же дала прямые линии для обеих тест-культур в исследованном диапазоне температур.
При определении требуемой летальности, необходимой для разработки конкретных режимов стерилизации ЯКС, кроме параметров термоустойчивости спор А. acidoterrestris, следует учитывать факторы консервируемого продукта: величину рН продукта, число спор в продукте перед стерилизацией в пересчете на весь объем тары и допустимый процент брака.
Установленная кинетика гибели спор исследованных тест-микроорганизмов, соответствующая кинетике первого порядка в диапазоне температур 90-105 0С, значительно упрощает расчет требуемой летальности при разработке режимов стерилизации (пастеризации) фруктовых консервов. Оптимизация режимов стерилизации соковой продукции необходима для получения качественных и безопасных фруктовых консервов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Шобингер У. Фруктовые и овощные соки: научные основы и технологии // Пер. с нем. под общ. науч. ред. А.Ю. Колеснова, Н.Ф. Берестеня и А. В. Орещенко. СПб: Профессия, 2004. 640 с.
2. Филиппова Р.Л., Мухамеджанова А.А., Колес-нов А.Ю. Идентификация бактерий рода АНсусЬЬасН^ во фруктовых соках и пути предотвращения их порчи // Пиво и напитки. 2004. №4. С. 66-69.
3. Aneja K. R., Dhiman R., Kumar N. A., Aneja A. Review Article. Emerging Preservation Techniques for Controlling Spoilage and Pathogenic Microorganisms in Fruit Juices //International Journal of Microbiology. 2014. Р. 14. Article ID 758942, doi:10.1155/2014/758942/.
4. Xiao-Chen Huang , Ya-Hong Yuan , Chun-Feng Guo , Vassilis Gekas Alicyclobacillus in the Fruit Juice Industry: Spoilage, Detection, and Prevention/Control //Food Reviews International, V. 31, 2015, pp. 91-124. DOI: 10.1080/87559129.2014.974266.
5. Tayefe M., Zade A.N., Asl M.S., Hashemi S.A. Isolation of Alicyclobacillus acidoterrestris from Commercial Spoiled apple Juice and Study on some Influence Parameters on its Growth in Apple Juice // Biological Forum - An International Journal. 2014. №6(2). С. 41-45. doi: 10.15515/abr.0976-4585.5.2.138142.
6. Yokota A., Fujii T., Goto K. Alicyclobacillus: Thermophilic Acidophilic Bacilli // Springer Science & Business Media, 2008. С. 15-21.
7. Bahgeci K.S., Gokmen V., Acar J. Formation of guaiacol from vanillin by Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice: a model study // European Food Research and Technology. 2005. №220 (2), pp. 196-199. DOI: 10.1007/s00217-004-1018-y.
8. Choi L.H., Nielsen S.S. The effect of thermal and non-thermal processing methods on apple cider quality and consumer acceptability // Journal of Food Quality, 2005, 28, 13-29. doi 10.1111/j.1745-4557.2005.00002.x
9. Мазохина-Поршнякова Н.Н., Найдёнова Л. П., Николаева С.А., Розанова Л.И.. Анализ и оценка качества консервов по микробиологическим показателям // М.: Пищевая промышленность, 1977. С. 308-309.
10. Левшенко М.Т., Каневский Б.Л. Оптимизация расчета требуемой летальности при разработке режимов стерилизации и пастеризации гомогенных фруктовых консервов // Сборник "Актуальные вопросы индустрии напитков". Выпуск 2. 2018 г, стр. 81-86.
11. Руководство по разработке режимов стерилизации и пастеризации консервируемой продукции // Разработан ВНИИКОП, утв. 24.08.2011 года.
12. Левшенко М.Т., Каневский Б.Л., Покудина Г.П., Борченкова Л.А. Сенкевич В.И. Уточненные режимы стерилизации гетерогенных овощных продуктов в зависимости от величины рН // Инновации и продовольственная безопасность. 2018. № 3. С. 49-55.
Левшенко Михаил Трифонович, старший научный сотрудник лаборатории качества и безопасности пищевой продукции ВНИИТеК -филиала ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им В.М. Горбатова» РАН. E-mail: lev-mika@yandex.ru +7495-541-76-55.
Позднякова Тамара Алексеевна, старший научный сотрудник лаборатории качества и безопасности пищевой продукции ВНИИТеК -филиала ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им В.М. Горбатова» РАН. E-mail: microbio@vniitek.ru +7495-541-76-55.
Волкова Раиса Александровна, ведущий научный сотрудник лаборатории качества и безопасности пищевой продукции ВНИИТеК -филиала ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им В.М. Горбатова» РАН. E-mail: microbio@vniitek.ru +7495-541-76-55.
