CC BY
40УДК 543.544.3.615.31 https://doi.org/10.29296/25877313-2021-10-07
© Коллектив авторов, 2021
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ В НОВОМ КАРДИОПРОТЕКТОРНОМ СОЕДИНЕНИИ МЕТОДОМ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Е.В. Компанцева
д.фарм.н., профессор, кафедра фармацевтической химии,
Пятигорский медико-фармацевтический институт- филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России (г. Пятигорск, Россия) Д.Н. Луценко
аспирант, кафедра фармацевтической химии,
Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России (г. Пятигорск, Россия) E-mail: lucenkodasha95@mail.ru М.В. Ларский
к.фарм.н., зав. кафедрой фармацевтической химии,
Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России (г. Пятигорск, Россия)
Актуальность. Газовая хроматография - метод, позволяющий быстро и точно провести качественный и количественный анализ компонентов различных смесей, а также разделить их на составные части. Этот метод широко используется в различных отраслях промышленности, в том числе и фармацевтической,
Цель исследования. Разработка и валидация методики определения остаточных органических растворителей в субстанции биологически активного соединения (БАС) М-[2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил]-гуанидина (VMA-13-15) методом газовой хроматографии.
Материал и методы. Объект исследования - лабораторные образцы БАС VMA-13-15 (серия 2017, 2018 и 2019), а также стандартные образцы метанола (ГСО 8461-2003) и диэтилового эфира (ОСТ-84-2006-88) квалификации х.ч. Определение остаточных органических растворителей проводили методом газовой хроматографии на приборе «Кристалл-2000М». Результаты. Разработана методика определения остаточных органических растворителей в субстанции БАС 1\1-[2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил]-гуанидина методом газовой хроматографии. Методика валидирована по показателям: специфичность, линейность, правильность и прецизионность.
Выводы. Методика определения остаточных органических растворителей М-[2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил]-гуанидина может быть рекомендована для включения в проект нормативной документации. Ключевые слова: БАС, газовая хроматография, валидация.
Для цитирования: Компанцева Е.В., Луценко Д.Н., Ларский М.В. Определение остаточных органических растворителей в новом кардиопротекторном соединении методом газовой хроматографии. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2021;24(10):52-58. https://doi.org/10.29296/25877313-2021-10-07
Перспективным направлением в лечении ишемической болезни сердца является создание кардиопротекторных препаратов, повышающих устойчивость кардиомиоцитов к ишемии. С этой целью на кафедре фармацевтической и токсикологической химии Волгоградского государственного медицинского университета было синтезировано биологически активное соединение (БАС), производное хиназолина К-[2-[4-оксо-3(4Н)-хиназоли-нил] пропионил]-гуанидин (УМЛ-13-15) [1].
Изучение схемы синтеза исследуемого БАС показало использование при его получении и перекристаллизации таких органических растворителей, как метанол и диэтиловый эфир [2]. Не-
смотря на то, что БАС подвергается тщательной очистке, на конечной стадии в нем могут обнаруживаться минимальные количества указанных растворителей. Поэтому актуальной является разработка методики идентификации и количественного определения возможных примесей остаточных органических растворителей.
Согласно требованиям ОФС.1.1.0008.15, остаточные органические растворители распределены на три класса по предельно допустимому содержанию в лекарственных средствах и степени их возможного влияния на здоровье человека. Метанол относится ко второму классу токсичности с предельным содержанием 0,3%. Согласно фарма-
копейной статье, диэтиловый эфир относится к третьему классу токсичности, его содержание не должно превышать 0,5% [3].
Цель исследования - разработка и валидация методики определения остаточных органических растворителей в субстанции БАС К-[2-[4-оксо-3(4Н)-хиназолинил]пропионил]-гуани-дина методом газовой хроматографии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Определение остаточных органических растворителей проводили методом газовой хроматографии на приборе «Кристалл-2000М» (зав. номер 6596), используя следующие условия хромато-графирования: колонка насадочная - 2Б-РРАР, 50 м X 0,32 мм X 0,5 нм; газ носитель - азот о.с.ч. 99,996%; скорость потока - 10 мин; объем вводимой пробы - 1 мкл; температура колонки - 160 °С; температура испарителя - 180 °С; температура детектора - 220 °С; давление газа - 65 кПа; длина колонки - 50 м; диаметр колонки - 0,32 мм.
Объектом исследования служили лабораторные образцы БАС УМА-13-15 (серия 2017, 2018, 2019), а также стандартные образцы (СО) метанола (ГСО 8461-2003) и диэтиловый эфир (0СТ-84-2006-88) квалификации ч.д.а. Для взвешивания навесок для анализа использовали весы аналитические «ЛВ 210-А» (ООО «Сартогосм», Россия).
Предлагаемая методика. Субстанцию БАС в количестве 0,500 г (точная навеска) растворяли в мерной колбе вместимостью 10 мл в 5 мл воды
очищенной, доводили объем раствора до метки тем же растворителем, перемешивали. Свежеприготовленный раствор объемом 1 мкл вводили в хроматографическую колонку и проводили анализ в условиях, указанных выше.
Содержание остаточных растворителей в БАС рассчитывали по формуле
С0/ • Сет 100 100
С % —-,
Бет • а 1000
где Сет - количество СО в 1 мл стандартного раствора, мг; а - навеска БАС, г; Бх - площадь пика исследуемого вещества; Бет - площадь пика стандартного образца.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для количественного определения остаточного содержания метанола и диэтилового эфира логично в качестве растворителя использовать воду очищенную, так как растворимость БАС в воде составляет 1:30 [4], диэтиловый эфир мало растворим в воде, а метанол смешивается с водой во всех соотношениях.
Для подтверждения специфичности методики определяли влияние растворителя на разделение пиков диэтилового эфира и метанола (рис. 1). С этой целью вводили в хроматографическую колонку пробы водного раствора модельной смеси, содержащий по 50 мг/мл стандартных образцов диэтилового эфира (ОСТ-84-2006-88) и метанола (ГСО 8461-2003).
Рис 1. Хроматограмма модельной смеси диэтилового эфира и метанола в воде очищенной
На хроматограмме наблюдали полное разделение пиков метанола и диэтилового эфира (время выхода метанола - 6,060 мин, пика диэтилового эфира - 5,097 мин) (рис. 1), что является доказательством специфичности методики и подтверждает возможность определения указанных соединений при совместном присутствии в анализируемом образце.
Для определения линейности [5] методики, готовили в воде для жидкостной хроматографии растворы СО метанола и диэтилового эфира х.ч. с концентрацией каждого 10,0 мг/мл. Из полученных растворов методом разведения водой для жидкостной хроматографии готовили градуировочные растворы, разбавляя от 0,10 до 0,35 мг/мл соответствующего раствора водой для жидкостной хроматографии. При построении градуировочных графиков зависимости площади пика от концентрации стандартные растворы диэтилового эфира содержали от 0,2 до 1,2%, метанола - от 0,2 до 0,7%.
В хроматографическую колонку вводили по 1 мкл каждого раствора из приготовленной серии разведений. Раствор каждой градуировочной концентрации хроматографировали не менее трех раз. Рассчитывали средние значения площадей пиков и строили график зависимости аналитического сигнала площади пика от концентрации раствора.
Установлена линейная зависимость площади пика от концентраций метанола и диэтилового эфира (рис. 2; табл. 1 и 2).
В, мВ
25 у = 71,0Э7х+ 0,0198^
20
15
10 у*
5 *
0.
В, мЕ
0,1 0,3 с, мг/ип
а)
у = 116цМК ♦ 0.0401
о г о,в с, иг/ип
б)
Рис 2. График зависимости площади пика от концентраций метанола (а) и диэтилового эфира (б)
Таблица 1. Результаты определения зависимости площади пиков от концентрации метанола
Концентрация метанола, Количество примеси, Площадь пика, Параметры
мг/мл % мВ линейной зависимости
0,10 0,2 6,838 Ь = 71,097
0,15 0,3 10,408 Бь = 2,033
0,20 0,4 14,615 ДЬ = 5,646 а = 0,0198 Ба = 0,4314 Да = 1,197
0,25 0,5 18,421
0,30 0,6 21,531
0,35 0,7 24,287 г = 0,9987
Таблица 2. Результаты определения зависимости площади пиков от концентрации диэтилового эфира
Концентрация диэтилового эфира, мг/мл Количество примеси, % Площадь пика, мВ Параметры линейной зависимости
0,1 0,2 12,526 Ь = 116,84
0,2 0,4 22,951 Бь = 3,147
0,3 0,6 34,484 ДЬ = 8,738 а = 0,040 Ба = 1,043 Да = 2,898
0,4 0,8 46,041
0,5 1,0 58,566
0,6 1,2 69,032 г = 0,9997
Правильность [6] методики оценивали с помощью параметров линейной зависимости, в частности, по значению свободного члена уравнения. Приведенные результаты (табл. 1 и 2) показывают, что для метанола свободный член уравнения (а) 0,0198±1,197, для диэтилового эфира - 0,040±2,898. Так как свободный член уравнения (а) меньше его доверительного интервала (а < Да = ? (95%; 5) Х&), это свидетельствует об отсутствии систематической погрешности методики.
Линейную зависимость результатов (г>0,99) также подтверждают рассчитанные значения коэффициентов корреляции (г) градуировочных графиков: для метанола - 0,9987, для диэтилового эфира - 0,9997. Таким образом, методика валидирована по показателям правильность и линейность.
Предел обнаружения (ПО) и предел количественного определения (ПКО) рассчитывали, используя параметры линейной зависимости: ПО = 3,3£а/Ь и ПКО = 10£а/Ь. Для метанола полученные
данные составили ПО = 0,020 мг/мл, ПКО = 0,060 мг/мл и диэтилового эфира ПО = 0,029 мг/мл, ПКО = 0,089 мг/мл. Таким образом, при рабочей концентрации раствора УМЛ-13-15 5% возможно обнаружение примеси метанола в концентрации от 0,060 мг/мл и диэтилового эфира - 0,089 мг/мл.
Для определения прецизионности [7] методики использовали модельные смеси БАС с добавлением СО диэтилового эфира и метанола на трех уровнях по девяти точкам.
Как следует из данных табл. 3 и 4, методика валидна по параметру прецизионности, так как относительная погрешность (Я8Б) не превышает 3% при определении каждого из растворителей.
Разработанная методика обнаружения остаточных растворителей апробирована на УМЛ 1315 (серия 2018). На хроматограммах анализируемых образцов (рис. 3 и 4) выявлены пики, соответствующие по времени удерживания пикам метанола и диэтилового эфира СО (рис. 1).
Таблица 3. Результаты определения прецизионности (сходимости) методики определения метанола в модельных смесях
Уровень Взято метанола, мг/мл Площадь пика, мВ Найдено метанола, мг/мл Найдено метанола, % Метрологические характеристики
1 0,1000 6,851 0,0984 98,40 хср = 101,84 5 = 3,23 &-1,07 Ах = 2,54 е = 2,49% ЯББ = 1,05%
6,799 0,0976 97,60
6,864 0,0986 98,60
2 0,2000 14,362 0,2062 103,1
14,620 0,2099 104,95
14,592 0,2095 104,75
3 0,3000 21,930 0,3149 104,96
21,880 0,3142 104,73
20,784 0,2985 99,50
&т = 13,925, Сст = 0,2000
Уровень Взято ДЭ, мг/мл Площадь пика, мВ Найдено ДЭ, мг/мл Найдено ДЭ, % Метрологические характеристики
1 0,2000 22,922 0,1974 98,70 хср = 99,37 5 = 0,84 5х = 0,279 Ах = 0,65 е = 0,66% ЯББ = 0,27%
22,978 0,1978 98,90
22,953 0,1976 98,80
2 0,3000 34,583 0,2977 99,23
34,520 0,2972 99,06
34,349 0,2957 98,56
3 0,4000 46,526 0,4006 100,15
46,402 0,3995 99,87
46,923 0,4040 101,10
5ст = 34,840, Сст = 0,3000
Таблица 4. Результаты определения прецизионности (сходимости) методики определения диэтилового эфира (ДЭ) в модельных смесях
Рис 3. Хроматограммы раствора БАС и 0,1%-ного раствора диэтилового эфира
Рис. 4. Хроматограммы раствора БАС и 0,1%-ного раствора метанола
Таблица 5. Результаты статистической обработки времени удерживания метанола и диэтилового эфира при их определении в VMA 13-15
Метанол Диэтиловый эфир
^уд- Метрологические характеристики ^уд. Метрологические характеристики
6,057 Хср = 6,074 Б = 0,015 Бх = 0,005 Дх = 0,012 £ = 0,20% 5,035 Хср = 5,061 Б = 0,022 Бх = 0,007 Дх = 0,017 £ = 0,33%
6,100 5,039
6,047 5,035
6,079 5,093
6,077 5,078
6,086 5,087
Наложение хроматограмм серийного образца БАС и модельных смесей искомых остаточных растворителей показало, что пики СО метанола и ди-этилового эфираполностью совпадают по времени
удерживания с аналогичными пиками серийного образца БАС. В случае лабораторного образца БАС это подтверждает присутствие в нем метанола и ди-этилового эфира в следовых количествах.
Полученные значения рассчитанных с помощью уравнений градуировочных графиков (см. рис. 2), количеств метанола (0.0041 мг/мл) и ди-этилового эфира (0.0007 от/мл) (см. рис. 3 и 4). оказались ниже рассчитанных результатов ПКО, что говорит о наличии лишь следовых количеств остаточных растворителей в БАС.
Результаты определения следовых количеств метанола и диэтилового эфира статистически обработаны по времени удерживания. Полученные данные представлены в табл. 5.
Из табл. 5 следует, что относительная погрешность определения времени удерживания пиков находится в пределах 0,2% для метанола и 0,33% -для диэтилового эфира. Эти значения подтверждают возможность обнаруживать наличие следовых количеств обоих искомых остаточных растворителей с достаточной точностью и могут служить критерием для подтверждения чистоты БАС.
ВЫВОДЫ
Разработана методика определения остаточных органических растворителей в биологически активном соединении К-[2-[4-оксо-3(4Н)-хиназо.шшил] пропионкт]-гуанидина методом газовой хроматографии. Методика валидна по показателям: специ-
фичность. линейность, правильность и прецизионность.
ЛИТЕРАТУРА
1. Патент № 2622638 (РФ). Производные хиназолин -4(3н)-она. обладающие нейро- и кардиопротекторной активностью / В.И. Петров, И.Н. Тюренков, A.A. Озеров, М.С. Новиков и др. 2016129010 заявл.. 14.07.2016: опубл. 19.06.17. Бюл. № 17.
2. Глухова Е.Г. Синтез и фармакологические свойства новых карбонильных производных хиназолнн-4(ЗН)-она: Автореф. дисс. ... канд. фарм. наук: 14.04.12. Волгоград: Волг. мед. университет. 2016: 120 с.
3. Государственная фармакопея Российской Федерации. Изд. XIV. М.: МЗ РФ. 2018. Т. 1. [Электронный ресурс].
4. Луценко Д.Н., Компанцева Е.В. Изучение физнко-хнмн-ческнх свойств субстанции нового биологически активного соединения хиназолнн-4(ЗН)-она. Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Сб. науч. трудов. 2018: 24-27.
5. Обшая фармакопейная статья 1.1.0012.15. Валндацня аналитических методик. Государственная фармакопея Российской Федерации. Изд. ХШ. Т. I. М.; 2015. Avaitablefrom: http:// femb.ru/felm.
6. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. М.: Мир. 1994: 268 с.
7. Daksh S., et al. Validation of analytical methods - Strategies &Singficance. Int. J. Res. Dev. Pharm. L. Sei. April-May 2015: 4(3): 489-1497.
Поступила после доработки 28 июля 2021 г.
DETERMINATION OF RESIDUAL ORGANIC SOLVENTS IN A NEW CARDIOPROTECTIVE COMPOUND BY GAS CHROMATOGRAPHY
© Authors, 2021 E.V, Kompantseva
Dr.Sc. (Pharm.), Professor, Department of Pharmaceutical Chemistry,
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of the Volgograd State Medical University
of the Ministry of Health of Russia (Pyatigorsk, Russia)
D.N. Lutsenko
Post-graduate Student, Department of Pharmaceutical Chemistry,
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of the Volgograd State Medical University of the Ministry of Health of Russia (Pyatigorsk, Russia) E-mail: lucenkodasha95@mail.ru M.V. Larsky
Ph.D.(Pharm.), Head of the Department of Pharmaceutical Chemistry,
Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of the Volgograd State Medical University
of the Ministry of Health of Russia (Pyatigorsk, Russia)
Relevance. Gas chromatography - a method that allows you to quickly and accurately conduct a qualitative and quantitative analysis of the components of various mixtures, as well as divide them into their component parts - is widely used in various industries, including pharmaceutical.
The purpose of this study was to develop and validate a method for determining residual organic solvents in the substance of the biologically active compound (BAS) N-[2-[4-oxo-3(4h)-quinazolinyl]propionyl]-guanidine (VMA-13-15) by gas chromatography.
Material and methods. The objects of the study were laboratory samples of BAS VMA-13-15 (series 2017, 2018 and 2019), as well as CO methanol (GSO 8461-2003) and diethyl ether (OST-84-2006-88) qualifications of the he.
Results. A method for the determination of residual organic solvents in the BAS substance N-[2-[4-oxo-3(4h)-quinazolinyl]propionyl]-guanidine by gas chromatography has been developed. The method was validated according to the following indicators: specificity, linearity, correctness and precision.
Conclusions. The method for determining the residual organic solvents of N-[2-[4-oxo-3(4h)-quinazoline]propionyl]-guanidine can be recommended for inclusion in the draft regulatory documentation.
Key words: BAS, gas chromatography, validation.
1. Patent № 2622638 (RF). Proizvodnye hinazolin -4(3n)-ona, obladajushhie nejro- i kardioprotektornoj aktivno-st'ju / V.l. Petrov, I.N. Tjurenkov, A.A. Ozerov, M.S. Novikov i dr. 2016129010 zajavl., 14.07.2016; opubl. 19.06.17. Bjul. № 17.
2. Gluhova E.G. Sintez i farmakologicheskie svojstva novyh karbonil'nyh proizvodnyh hinazolin-4(3N)-ona: Avtoref. diss.... kand. farm, nauk: 14.04.12. Volgograd: Volg. med. universitet. 2016; 120 s.
3. Gosudarstvennaja Farmakopeja Rossijskoj Federacii. Izd. XIV. M.: MZ RF, 2018. T. 1. [Jelektronnyj resurs].
4. Lucenko D.N., Kompanceva E.V. Izuchenie fiziko-himi-cheskih svojstv substancii novogo biologicheski aktiv-nogo soedinenija hinazolin-4(3N)-ona. Razrabot-ka, is-sledovanie i marketing novoj farmacevticheskoj pro-dukcii. Sb. nauch. trudov. 2018; 24-27.
5. Obshhaja farmakopejnaja stat'ja 1.1.0012.15. Validacija analiticheskih metodik. Gosudarstvennaja farmakopeja Rossijskoj Federacii. Izd. HUI. T. I. M.; 2015. Avaitab-lefrom: http:// femb.ru/felm.
6. Derffel' K. Statistika v analiticheskoj himii. M.: Mir, 1994; 268 s.
7. Daksh S., et al. Validation of analytical methods - Strategies &Singficance. Int. J. Res. Dev. Pharm. L Sei. April-May 2015; 4(3): 489-1497.
Аппизарин (таблетки, мазь), per. №№ 85/507/2; 85/507/10; 85/507/16 - противовирусное средство, получаемое из травы копеечника альпийского (Hedysarum alpinum L.) или копеечника желтеющего (.Hedysarum flavenscens Rerel et Schmalh).
По сравнению с ацикловиром обладает более широким спектром действия.
Аммифурин (таблетки, спиртовый раствор), per. №№ 83/914/9; 70/151/47; 70/151/48 - фотосенсибили-зирующее средство, получаемое из плодов амми большой (Ammi majus L.),
Анмарин (линимент, гель, лосьон (раствор)), per. №№ 90/248/1; 95/178/5; 90/248/4 - антифунгальное, противогрибковое средство, получаемое из плодов амми большой [Ammi majus L.).
Гипорамин (таблетки, мазь, суппозитории, лиофилизат), per. №№ 98/305/1; 98/305/10; 98/305/12 - противовирусное средство, получаемое из листьев облепихи крушиновидной (Hippophae rhamnoides L.)
Глицирам (таблетки, гранулы), per. №№ 76/252/7; 70/730/48; 88/542/3 - оказывает противовоспалительное стимулирующее действие на кору надпочечников, умеренно отхаркивающее средство, получаемое из корней и корневищ солодки голой [Glycyrrhiza glabra L.) и солодки уральской [Glycyrrhiza uralensis Fisch.)
For citation: Kompantseva E.V., Lutsenko D.N., Larsky M.V. Determination of residual organic solvents in a new cardioprotective compound by gas chromatography. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2021;24(10):52-58. https://doi.org/10.29296/25877313-2021-10-07
REFERENCES
Лекарственные препараты, разработанные ВИЛАР
Тел. контакта; 8(495)388-55-09; 8(495)388-61-09; 8(495)712-10-45 Fax: 8(495)712-09-18; e-mail: vilarnii.ru; www.vilarnii.ru
