CC BY
421
УДК 636.085.3:577.18:543
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ В ВИНОГРАДЕ И ТОМАТАХ МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ
А. М. Андоралов1,2, В. Г. Амелин2
1Брянская межобластная ветеринарная лаборатория 2Владимирский государственный университет E-mail: amelinvg@mail.ru
Предложен способ определения 20 пестицидов (азоксистро-бин, боскалид, хлорпирифос, ципродинил, диазинон, диметоат, флуазифоп-П-бутил, малатион, метрибузин, пенконазол, фо-залон, пиримикарб, пиримифос-метил, прометрин, пропаргит, пираклостробин, пириметанил, триадименол, триадимефон, трифлоксистробин) в винограде и томатах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным квадру-поль-времяпролетным масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС/ВП), с применением пробоподготовки QuEChERS. Диапазон определяемых содержаний пестицидов при навеске пробы 10 г составил 0.01-2 мг/кг. Относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 14%. Продолжительность анализа 30-40 мин.
Ключевые слова: пестициды, виноград, томаты, QuEChERS, масс-спектрометрия высокого разрешения, тандемная квадру-поль-времяпролетная масс-спектрометрия.
Determination of Pesticide Residues
in Grapes and Tomatoes
by High Resolution Mass-spectrometry
A. M. Andoralov, V. G. Amelin
A method for determining the 20 pesticides (azoxystrobin, boscalid, chlorpyrifos, cyprodinil, diazinon, dimethoate, fluazifop-P-butyl, malathion, metribuzin, penconazole, phosalone, pirimicarb, piri-miphos-methyl, prometryn, propargite, pyraclostrobin, pyrimethanil, triadimenol, triadimefon, trifloxystrobin) in grapes and tomatoes by high performance liquid chromatography with tandem quadrupole -time of flight mass spectrometry detector (HPLC-MS / TOF), using sample preparation QuEChERS. The range determines the content of pesticides by an addition of 10 g of the sample was 0.01-2 mg / kg. The relative standard deviation of the test results does not exceed 14%. The duration of the analysis of 30-40 minutes. Key words: pesticides, grapes, tomatoes, QuEChERS, mass spectrometry, high resolution tandem quadrupole-time of flight mass-spectrometry.
Введение
Ежегодные потери урожая сельскохозяйственных культур от вредителей, болезней и сорняков без использования пестицидов могут достигать 30-40% [1]. С другой стороны, чрезмерное употребление пестицидов приводит к
ijpS I
rv//I/
накоплению их в продуктах питания и объектах окружающей среды. В связи с этим определение их остаточных количеств является важной задачей обеспечения безопасности жизнедеятельности человека. По этой причине разработаны нормативы содержания пестицидов в объектах окружающей среды [2, 3].
Определение остаточных количеств пестицидов в овощах и фруктах проводят в основном с применением пробоподготовки QuEChERS (Quick, E asy, Cheap, E ffective, Rugged and S afe - быстрый, простой, дешевый, эффективный, точный и надежный). Экстракцию целевых компонентов в этом способе проводят ацетонитрилом в присутствии буферирующих солей. Очистку экстрактов от липидов, жиров и белков осуществляют насыпными сорбентами Bondesil-PSA, C18, графитированной сажей, ионообменными смолами и их комбинациями [4-11]. В последнее десятилетие анализ остатков пестицидов в пищевых продуктах и кормах существенно изменился в связи с появлением масс-спектрометров нового поколения. Так, масс-спектрометры высокого разрешения, в частности времяпролетные масс-спектрометры, используют все чаще для идентификации и определения органических загрязнителей [1018]. Такие масс-спектрометры используют и для определения остаточных количеств пестицидов как в сочетании с газовой [10, 11], так и высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) [12-18]. Однако диапазон определяемых содержаний пестицидов не превышает двух порядков [16-18].
По итогам работы ФГБУ «Брянская МВЛ» был сформирован список пестицидов, которые наиболее часто встречаются в пробах овощей и фруктов. Для определения методом ВЭЖХ-МС/ВП выбрано 20 пестицидов, на которые приходится 64% обнаруженных пестицидов за 2012-2013 гг. В основном это фунгициды и
инсектициды, которые активно используются при выращивании винограда и томатов.
В данной работе предложен способ идентификации и одновременного определения 20 пестицидов различных классов в томатах и винограде методом масс-спектрометрии высокого разрешения.
Экспериментальная часть
Аппаратура. В работе использовали жидкостной хроматограф «UltiMate 3000» (Thermo Scientific, США) с тандемным квадруполь-вре-мяпролетным «maXis impact» (Bruker, Германия) масс-спектрометрическим детектором. Разделение проводили на колонке (100 х 2,1 мм) Acclaim RSLC 120 C18 (2,2 мкм) (Thermo Scientific, США) в режиме градиентного элюирования подвижной фазы. Между хроматографической колонкой и системой ввода образца была установлена предколонка (5 х 2,1мм) Acquity UPLC BEH C18 (1,7 мкм).
Реактивы. Использовали стандартные образцы пестицидов: азоксистробина, боска-лида, хлорпирифоса, ципродинила, диазинона, диметоата, малатиона, пенконазола, фозалона, пиримикарба, прометрина, пропаргита, пира-клостробина, пириметанила, триадименола, триадимефона, трифлоксистробина (Sigma, Гер -мания), флуазифоп-П-бутила (Dr. Ehrenstorfer GmbH, Германия), пиримифос-метила (Chem Service Inc, США) и метрибузина (ВНИИХСЗР, НПК «Блок-1», Россия). Исходные стандартные растворы с концентрацией 1 мг/мл готовили в ацетонитриле. Рабочие растворы готовили путем разбавления исходных ацетонитрилом в день использования.
Использовали смесь для экстракции SupelTM QuE Citrate (EN) Tube 55227-U (SUPELCO) и смесь для очистки экстракта SupelTM QuE PSA (EN) Tube 55228-U (SUPELCO) по методу QuEChERS. Ацетонитрил ОСЧ (НПК «КРИО-ХРОМ»), метанол (Merck Millipore), формиат аммония (Fluka), муравьиная кислота (Sigma-Aldrich), изопропанол ОСЧ (АО Реахим).
Условия хроматографического разделения и детектирования. Использовали подвижную фазу: вода с содержанием 5 мМ формиата аммония и 0,01%-ной муравьиной кислоты (фаза А), метанол с содержанием 5 мМ формиата и 0,01%-ной муравьиной кислоты (фаза В). Гра -диент подвижной фазы представлен в табл. 1. Температура колонки 30 °С, объем вводимой пробы 5 мкл.
Таблица 1
Градиент подвижной фазы
Время, мин Скорость подвижной фазы, мл/мин А, %
0 0.2 95
0.5 0.2 95
2.5 0.2 55.9
13.5 0.4 0.1
15.5 0.48 0.1
15.6 0.48 95
18.5 0.48 95
18.6 0.2 95
20.0 0.2 95
Тандемный квадруполь-времяпролетный масс-спектрометрический детектор «maXis impact» был настроен на одновременное сканирование МС-спектров и МС/МС-спектров. При обработке данных выделяли хроматограммы характеристических ионов пестицидов с точностью ± 5 мДа. Молекулярный ион (для количественного анализа) выделяли из МС-спектров, а ионы-фрагменты (для идентификации) из МС/МС-спектров с энергией фрагментации 25 эВ (рисунок). При сканировании были установлены следующие оптимальные значения параметров: напряжение на щитке капилляра -400 В, на капилляре - 1000 В, давление газа распылителя - 4 атм, поток газа осушителя азота - 3 л/мин, температура газа осушителя -300 °С, поток газа испарителя азота - 250 л/час, температура газа испарителя- 350 °C, время трансфера ионов - 20-70 мкс, время задержки перед импульсом - 6 мкс. Времена удерживания и основные массы ионов определяемых пестицидов приведены в табл. 2.
Пробоподготовка. В центрифужную пробирку емкостью 50 мл вносили навеску измельченного образца массой 10.0 г, добавляли 10 мл ацетонитрила, закрывали пробирку и энергично взбалтывали в течение одной минуты. Затем вносили следующие соли: 4.0 г безводного сульфата магния, 1.0 г хлорида натрия, 1.0 г натрия лимоннокислого тризамещённого двойного гидрата и 0.5 г натрия лимоннокислого двузамещённого полуторного гидрата. После внесения солей взбалтывали в течение одной минуты (во избежание образования комков) и центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин, отбирали 4 мл верхней части экстракта и переносили в цен-
трифужную пробирку емкостью 15 мл, которая энергично встряхивали в течение 30 с и центри-содержала смесь сорбента Во^е8И-РБА (0.5 г) и фугировали 5 мин при 3000 об/мин, отбирали сульфата магния (0.5 г). Содержимое пробирки экстракт в микрофлакон и хроматографировали.
Time [min]
Хроматограммы извлеченных масс ионов [М+Н]+ смеси стандартов пестицидов
(100 нг/мл)
Времена удерживания и измеряемые массы ионов пестицидов
Таблица 2
Пестицид Время удерживания 1к , мин Масса иона, [М+Н]+ m/z Масса иона-фрагм. 1, m/z Масса иона-фрагм. 2, m/z
Азоксистробин 8.90 404.1240 372.0979 344.1027
Боскалид 9.24 343.0399 307.0633 139.9898
Диазинон 10.81 305.1089 169.0794 114.9613
Диметоат 5.44 230.0070 142.9917 124.9821
Малатион 9.43 331.0433 127.0390 99.0077
Метрибузин 7.06 215.0960 187.1011 84.0801
Пенконазол 10.62 284.0722 158.9763 70.0400
Пираклостробин 10.99 388.1058 163.0618 149.1060
Пириметанил 9.30 200.1183 107.0604 82.0651
Пиримикарб 7.73 239.1507 182.1288 72.0444
Пиримифос-метил 11.16 306.1040 164.1182 108.0560
Прометрин 9.88 242.1439 200.0956 158.0499
Пропаргит 12.62 368.1890 107.0491 81.0699
Триадименол 9.50 296.1167 99.0810 70.0400
Триадимефон 9.71 294.1008 197.0723 69.0695
Трифлоксистробин 11.41 409.1370 186.0525 116.0495
Флуазифоп-П-бутил 11.82 384.1423 282.0732 328.0797
Фозалон 11.06 367.9942 181.9995 138.0115
Хлорпирифос 12.49 349.9337 197.9275 114.9613
Ципродинил 10.87 226.1343 133.0760 108.0819
Результаты и их обсуждение
Установлено, что выбор вида функции граду -ировочной зависимости влияет на погрешность определения пестицидов (табл. 3). Так, лучшие результаты получали при использовании кубической функции градуировочной характеристики: средний коэффициент корреляции (Я2) равен 0.998 (0.989-0.999) и среднее значение относительного стандартного отклонения равно 7%
Коэффициент корреляции для 19 из 20 пестицидов составил > 0,99. Степень извлечения пестицидов для томатов и винограда находится в диапазоне 95-108%, относительное стандартное отклонение результатов анализа < 14%. В табл. 4 представлены степени извлечения пестицидов и их пределы обнаружения при отношении сигнал/шум равном 3. Правильность анализа подтверждена методом добавок. Установлено, что погрешность в определении
(5-13%). Такой эффект, вероятно, может быть вызван малым линейным динамическим диапазоном масс-спектрометра. При этом хороший уровень корреляции линейной функции со сравнительно низкими значениями отклонения наблюдается в тех случаях, когда определяемые концентрации близки к пределу обнаружения (хлорпирифос, флуазифоп-П-бутил, пенконазол, триадимефон, триадименол).
остаточных количеств пестицидов не превышает 10%.
Разработанным методом было проанализировано 14 проб (7 - винограда и 7 - томатов) из них в 11 случаях были обнаружены пестициды. Результаты проведенных исследований приведены в табл. 5. Из 7 проб винограда в 5 пробах были обнаружены пестициды, содержание которых превышает максимально допустимый уровень (МДУ).
Таблица 3
Влияние корреляционной функции на результаты определения пестицидов (п = 3)
Пестицид Коэффициент корреляции, Я2 иг , %
Калибровочная функция
Линейная Квадратичная Кубическая Линейная Квадратичная Кубическая
Азоксистробин 0.9839 0.9963 0.9998 24.3 8.4 6.8
Боскалид 0.9711 0.9975 0.9889 28.3 13.4 9.5
Диазинон 0.9738 0.9928 0.9991 32.8 11.7 9.1
Диметоат 0.9810 0.9956 0.9978 20.9 13.8 6.4
Малатион 0.9661 0.9932 0.9983 33.7 10.5 7.6
Метрибузин 0.9814 0.9986 0.9993 22.0 5.7 5.1
Пенконазол 0.9934 0.9990 0.9996 14.1 6.0 5.6
Пираклостробин 0.9670 0.9956 0.9992 34.1 8.5 6.3
Пириметанил 0.9729 0.9964 0.9995 31.5 9.6 7.7
Пиримикарб 0.9715 0.9969 0.9988 29.3 7.1 5.8
Пиримифос-метил 0.9856 0.9985 0.9989 20.7 6.4 5.9
Прометрин 0.9886 0.9962 0.9997 18.6 7.1 6.0
Пропаргит 0.9882 0.9988 0.9986 19.5 7.6 7.0
Триадименол 0.9957 0.9975 0.9998 9.3 9.8 8.3
Триадимефон 0.9921 0.9983 0.9999 16.2 6.7 6.1
Трифлоксистробин 0.9742 0.9966 0.9981 29.8 7.7 6.5
Флуазифоп-П-бутил 0.9879 0.9984 0.9974 13.9 6.8 6.7
Фозалон 0.9853 0.9980 0.9988 19.7 7.8 8.0
Хлорпирифос 0.9933 0.9950 0.9983 15.0 14.8 13.1
Ципродинил 0.9250 0.9938 0.9960 45.8 10.1 7.6
Таблица 4
Пределы обнаружения и степени извлечения пестицидов
Пестицид Пределы обнаружения, мкг/кг Степень извлечения,%
Томаты Виноград Томаты Виноград
Азоксистробин 0.2 0,4 96.6 103.3
Боскалид 1.5 2,2 96.6 104.9
Диазинон 0.4 0,4 100.5 100.8
Диметоат 0.6 0,6 96.9 107.8
Малатион 0.8 1,0 95.4 104.3
Метрибузин 0.8 0,6 97.1 101.5
Пенконазол 0.7 0,6 98.7 102.4
Пираклостробин 0.3 0,6 96.9 100.9
Пириметанил 0.1 0,2 97.0 103.8
Пиримикарб 0.7 0,8 96.6 99.8
Пиримифос-метил 0.1 0,2 98.0 100.8
Прометрин 0.1 0,2 97.2 104.2
Пропаргит 5.8 8,4 96.3 99.7
Триадименол 14.3 2,6 97.4 103.5
Триадимефон 0.5 0,2 101.4 100.5
Трифлоксистробин 0.7 0,4 97.9 102.4
Флуазифоп-П-бутил 0.1 0,4 97.1 102.5
Фозалон 4.4 11,6 96.3 96.8
Хлорпирифос 19.4 100 95.0 101.7
Ципродинил 0.1 0,2 97.5 102.8
Таблица 5
Результаты определения пестицидов в пробах (n = 2, P = 0.95)
№ Название образца Пестицид Найдено, мг/кг МДУ/ВМДУ1 в продукции, мг/кг
Азоксистробин 0.335 0.2
Пенконазол 0.138 0.3
1 Пириметанил 4.161 4.02
Триадименол 0.177 2.0
Ципродинил 1.131 2.0
Азоксистробин 0.856 0.2
Пенконазол 0.080 0.3
2 Виноград Пириметанил 1.767 4.02
Триадименол 0.553 2.0
Ципродинил 0.006 2.0
Азоксистробин 0.554 0.2
Пенконазол 0.200 0.3
3 Пириметанил 1.156 4.02
Триадименол 0.270 2.0
Хлорпирифос 0.282 0.4
Ципродинил 0.381 2.0
Окончание табл. 5
№ Название образца Пестицид Найдено, мг/кг МДУ/ВМДУ1 в продукции, мг/кг
Азоксистробин 0.385 0.2
Пенконазол 0.165 0.3
4 Пириметанил 0.056 4.02
Пропаргит 0.126 0.2
Ципродинил 0.007 2.0
Азоксистробин 0.125 0.2
Пенконазол 0.062 0.3
5 Виноград Пириметанил 0.009 4.02
Триадименол 0.010 2.0
Ципродинил 2.258 2.0
6 Пириметанил 3.125 4.02
Пенконазол 0.005 0.3
7 Пириметанил 1.911 4.02
Триадименол 0.033 2.0
Ципродинил 0.012 2.0
8 Триадименол 0,023 0.1
9 Томаты Триадименол 0.018 0.1
10 Ципродинил 0.012 0.52
11 Ципродинил 0.089 0.52
Примечание. 1 - Гигиенические нормативы содержания действующих веществ пестицидов в объектах окружающей среды, продовольственном сырье, пищевых продуктах Единых санитарно-эпидемиологических и гигиенических требований к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю); 2 - ГН 1.2.3111-13.
Список литературы
1. Мельников Н. Н. Пестициды. Химия, технология и применение. М. : Химия, 1987. 712 с.
2. ГН 1.2.3111-13. Гигиенические нормативы содержания пестицидов в объектах окружающей среды (перечень). М., 2013.
3. Гигиенические нормативы содержания действующих веществ пестицидов в объектах окружающей среды, продовольственном сырье, пищевых продуктах. Приложение 15.1. к Разделу 15 Главы II // Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) таможенного союза. URL: www.tsouz.ru
4. Anastassiades M., Lehotay S. J., Stajnbaher D., Schenck F. J. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and «dispersive solid-phase extraction» for the determination of pesticide residues in produce // J. AOAC Int. 2003. Vol. 86. P. 412-416.
5. Lehotay S. J., Son K. A., Kwon H., Koesukwiwat U., Fu W., Mastovska K., Hoh E., Leepipatpiboon N. Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables // J. Chromatogr. A 2010. Vol. 1217. P. 2548-2560.
6. Lesueur C., KnittlP., GartnerM., Mentler A., Fuerhac-ker M. Analysis of 140 pesticides from conventional farming foodstuff samples after extraction with the modified QuECheRS method // Food Contr. 2008. Vol. 19. P. 906-914.
7. Wilkowska A., Biziuk M. Determination of pesticide residues in food matrices using the QuEChERS methodology // Food Chem. 2011. Vol. 125. P. 803-812.
8. Nguyen T. D., Yu J. E, Lee D. M., Lee G. H. A multiresi-due method for the determination of 107 pesticides in cabbage and radish using QuEChERS sample preparation method and gas chromatography mass spectrometry // Food Chem. 2008. Vol. 110. P. 207-213.
9. Koesukwiwat U., Sanguankaew K., Leepipatpiboon N. Rapid determination of phenoxy acid residues in rice by modified QuEChERS extraction and liquid chromato-graphy-tandem mass spectrometry // Anal. Chim. Acta. 2008. Vol. 626. P. 10-20.
10. Koesukwiwat U., Lehotaya S. J., Miao S., Leepipatpiboon N. High throughput analysis of 150 pesticides in fruits and vegetables using QuEChERS and low-pressure gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry // J. Chromatogr. A 2010. Vol. 1217. P. 6692-6703.
11. Koesukwiwat U., Lehotay S. J., Mastovska K., Dorweiler K. J., Leepipatpiboon N. Extension of the QuEChERS method for pesticide residues in cereals to flax-
seeds, peanuts, and doughs // J. Agric. Food Chem. 2010. Vol. 58. P. 5950-5958.
12. Fernandez-Alba A. R., Juan F. Garcia-Reyes Large-scale multi-residue methods for pesticides and their degradation products in food by advanced LC-MS // Tr. Anal. Chem. 2008. Vol. 27. P. 973-990.
13. Soler C., Pico Y. Recent trends in liquid chromatogra-phy-tandem mass spectrometry to determine pesticides and their metabolites in food // Tr. Anal. Chem. 2007. Vol. 26. P. 103-115.
14. Thurman E. M., Ferrer I., Fernandez-Alba A. R. Matching unknown empirical formulas to chemical structure using LC/MS TOF accurate mass and database searching: example of unknown pesticides on tomato skins // J. Chromatogr. A. 2005. Vol. 1067. P. 127-134.
15. Mezcua M., Malato O., Garcia-Reyes J. F., Molina-Diaz A., Fernandez-Alba A. R. Accurate-Mass Databases
for Comprehensive Screening of Pesticide Residues in Food by Fast Liquid Chromatography Time-of-Flight Mass Spectrometry // Anal. Chem. 2009. Vol. 81. P. 913-929.
16. Ferrer I., Thurman E. M., Fernandez-Alba A. R. Quantitation and Accurate Mass Analysis of Pesticides in Vegetables by LC/TOF-MS // Anal. Chem. 2005. Vol. 77. P. 818-2825.
17. Lacina O., Urbanova J., Poustka J., Hajslova J. Identification/quantification of multiple pesticide residues in food plants by ultra-high-performance liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2010. Vol. 1217. P. 648-659.
18. Ferrer I., Garcia-Reyes J. F., Fernandez-Alba A. Identification and quantitation of pesticides in vegetables by liquid chromatography time-of-flight mass spectro-metry // Tr. Anal. Chem. 2005. Vol. 24. P. 671-682.
