CC BY
238
УДК 543.545
Вестник СПбГУ. Сер. 4. Т. 1 (59). 2014. Вып. 2
В. В. Никоноров, Л. М. Лифшиц, М. С. Киреева
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИКОТИНА В ТАБАКЕ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург, Российская Федерация
Показано, что электрофоретическое определение никотина с косвенным фотометрическим детектированием возможно в диапазоне концентраций 1—45 мг/л. Предел обнаружения составляет 0,3 мг/л. Методика была опробована на табаке различных сигаретных марок. Извлечение никотина из табака производили количественно при его кипячении в течение 5 мин. Экстракция никотина из табака при повышенной температуре описана впервые. При комнатной температуре извлекаются только лабильные формы никотина, так как определённая часть аналита, а именно стабильные соединения никотина с гидрофобными органическими кислотами, при этом большей частью теряется. Предложена методика КЭ определения никотина в табаке. В табаке различных товарных марок было найдено 3,1—9,8 мг никотина на одну сигарету, что значительно (в 7—22 раза) превышает значения, указанные производителем. Это связано с тем, что производители указывают содержание никотина в табачном дыме без учёта его сгорания и адсорбции на сигаретном фильтре. В табаке также были найдены ионы калия, кальция и натрия. Относительное стандартное отклонение определения никотина варьируется для различных марок сигарет от 1,4 до 7,3 %. Правильность результатов подтверждена методом стандартной добавки. Библиогр. 15 назв. Ил. 3. Табл. 3.
Ключевые слова: капиллярный электрофорез, никотин, табак, пробоподготовка.
V. V. Nikonorov, L. M. Lifshits, M. S. Kireeva
DETERMINATION OF NICOTINE IN TOBACCO BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS
St. Petersburg State University, 199034, St. Petersburg, Russian Federation
It is shown that a capillary electrophoretic (CE) determination of nicotine with indirect photometric detection is possible in the range 1—45 mg/L. The detection limit of determination is 0.3 mg/L. The method was tested with tobacco of different brands of cigarettes. Extraction of nicotine from tobacco is quantitative when the sample is boiled in distilled water for 5 min. The extraction of nicotine from tobacco with aqueous solutions at increased temperatures was not described in the literature. Probably only labile forms of nicotine were extracted at room temperature. A considerable portion of the analyte of stable nicotine compounds with hydrophobic organic acids was most likely lost. The CE procedure of determination of nicotine in tobacco is suggested. The nicotine was found in tobacco cigarettes of various brands in the range 3.1—9.8 mg/cig. that significantly (7—22 times) more than manufacturers declare. This is due to the fact that manufacturers indicate the nicotine in tobacco smoke, which is not burned and not absorbed on the cigarette filter. Potassium, calcium, and sodium ions were found in tobacco too. Relative standard deviation at determination of nicotine in different brands of cigarettes varies between 1.4—7.3 %. The accuracy of the analytical results was confirmed by a standard addition method. Refs 15. Figs 3. Tables 3.
Keywords: capillary electrophoresis, nicotine, tobacco, sample preparation.
Введение. Содержание никотина в табаке колеблется в пределах 0,6-8 % (в среднем около 4 %). При курении табака большая часть никотина сгорает, а организмом в зависимости от режима курения усваивается от 5 до 95 % никотина, содержащегося в табачном дыме [1]. При определении никотина необходима операция его выделения из анализируемой пробы. Для этого применяют экстрагирование подкисленным спиртом (полнота выделения 23,5-30 %) или водой, подкисленной щавелевой (полнота выделе-
ния 22,5-30 %) или серной кислотами (полнота выделения 47-58 %), а также отгонка с водяным паром из щелочного раствора (полнота выделения 21-25 %) [1-3]. Однако при определении количества никотина, попадающего в организм при курении, действуют более опосредованно и определяют никотин в конденсате дыма, полученного при выкуривании определённого количества сигарет на так называемой «курительной машине» (метод 1БО-ФТК). Этот метод позволяет измерять содержание никотина в остатке на фильтре курительной машины и не даёт сведений о летучей форме никотина, в которую табачный никотин переводится производителями с помощью различных добавок в сигареты [4]. Таким образом, сомнения в адекватности соотнесения данных о содержании труднолетучих форм никотина в дыме с реальными количествами никотина, поступающими в организм человека при курении, вполне обоснованы. Поэтому определение никотина непосредственно в табаке, несомненно, актуально.
Никотин определяют по собственному поглощению в УФ области (X = 236, 259 и 282 нм) [5, 6], газохроматографическим (ГХ) методом [7, 8]. Хромато-масс-спектрометрическое определение никотина после концентрирования на адсорбенте возможно в диапазоне концентраций 0,2-4 мкг/м3 [9]. Метод капиллярного электрофореза (КЭ) применяли для определения никотина с середины 1990-х годов. КЭ определение никотина имеет существенные преимущества, так как этот аналит имеет ярко выраженную гидрофильную природу и высокую склонность к образованию катионных форм [10]. Режимы КЭ разделения изменяются незначительно: напряжение 18-30 кВ, длина капилляра 50-70 см, внутренний диаметр капилляра 50-75 мкм, время электромиграции никотина 6-8 мин [10, 11], ведущий электролит: 0,025М [13], 0,05М [12], 0,12М [10] фосфатный буфер (рН = 2^2,7) или 0,12-0,15М цитратный буфер (рН = 2^3,7) [10, 11]. Детектирование — прямое УФ на длине волны 260 нм (максимум поглощения никотина). Судя по рН использованных буферных растворов, можно утверждать, что никотин определялся в форме дикатиона, имеющего в два раза больший коэффициент экстинк-ции, чем монокатион или нейтральный никотин [10]. Эффективность КЭ разделения (6 + 7) • 104 и 1,1 • 105 тт при использовании фосфатных и цитратных ведущих электролитов соответственно [11, 14]. Предел определения КЭ с прямым фотометрическим детектированием при определении никотина оценивается в 0,3 мг/л [11], а ОСО при определении никотина в табаке составляет 8,5 % [10]. Пробоподготовка табака перед КЭ определением предусматривает экстрагирование в дистиллированную воду, растворы соляной или уксусной кислот, кислые фосфатные или цитратные буферы, а также растворы триэтаноламина в течение 6-15 мин [10-12]. Считается, что экстрагирование количественное. Общим местом в пробоподготовке стало использование ультразвука, позволяющее свести продолжительность этой операции от многих часов до 15-20 мин [8, 10].
Экспериментальная часть. Использовали систему капиллярного электрофореза «Капель-103» (НПП АФ «Люмэкс»), снабжённую кварцевым капилляром с внешним полиимидным защитным покрытием (внутренний диаметр 75 мкм, внешний 365 мкм, общая длина 68 см, эффективная длина 50 см, наложенное напряжение +20 кВ). Для подготовки к работе капилляр промывался последовательно концентрированной НС1О4, 4М МаОН, Н2О и рабочим буфером. Ввод пробы осуществляли со стороны катода давлением 30 мбар в течение 10 с. Электрофореграммы регистрировали с помощью косвенного УФ детектирования (254 нм) непосредственно в капилляре. Спектр никотина получили с помощью спектрофотометра СФ-103.
Рабочий буферный раствор 12мМ бензимидазола для капиллярного электрофореза готовили непосредственно перед анализом. В стаканчик помещали 6 мл 20мМ раствора
бензимидазола, прибавляли 2 мл дистиллированной воды и затем, используя иономер, доводили значение рН до необходимого с помощью 0,1М раствора соляной кислоты. Полученный раствор переносили в колбу вместимостью 10 мл, доводили до метки дистиллированной водой и перемешивали.
Стандартные образцы никотина являются коммерческим продуктом. Поэтому предприняли выделение никотина из 2 кг табачной пыли [15] марки «Огородник» (ЗАО «Костромской химзавод»). Полученную никотинсодержащую фракцию (5,0389 г) исследовали методом 1Н ЯМР ^С13): 5 8,6-7,2 (м; 4Н пиридин), 3,35 (м; 1Н, СН), 3,2-1,6 (м; 6Н, кольц. СН2), 2,17 (с; 3Н, СН3). Данные ЯМР позволяют утверждать, что из табачной пыли был выделен никотин в чистом виде. Из полученного препарата никотина приготовили растворы хлорида никотина с концентрациями 21,4 г/л (раствор № 1), 0,428 г/л (№ 2) и 42,8 мг/л (№ 3). Стабильность растворов никотина подтвердили измерением электрофоретического сигнала стандартного раствора № 3 в течение 38 дней. Значимых изменений сигнала не зафиксировано. Все остальные использованные в работе вещества имели квалификацию не ниже х.ч.
Результаты и их обсуждение. При выборе состава ведущего электролита для КЭ определения никотина исходили из того, что в анализируемом растворе никотин присутствует в катионной форме. Принимая во внимание, что при рабочей длине волны 254 нм никотин сам поглощает излучение (е = 2470), можно было бы применить схему его прямого детектирования, как это рекомендуется в литературе [10-14]. Однако сочли более удобным использовать косвенное детектирование, введя в ведущий электролит активно абсорбирующий УФ-излучение катион бензимидазола. В этом случае электрофоретический метод становится более информативным, так как детектируются любые катионные вещества пробы, и потенциально более чувствительным за счёт большего значения коэффициента экстинкции бензимидазола (е = 4970, у никотина е = 2470). Были приготовлены растворы ведущего электролита со значениями рН от 3,5 до 7,0 (с шагом 0,5) и с их использованием получены электрофореграммы стандартного раствора никотина № 3. Типичная электрофореграмма приведена на рис. 1. На всех электрофореграммах наблюдалась группа из четырёх хорошо разделённых пиков с временем миграции £ = 220 + 440 с. Для буферных растворов со значением рН = 6,00 и выше наблюдается расщепление четвёртого пика, а затем и его полное исчезновение. Было установлено, что пики 1-3 отвечают ионам калия, кальция и натрия, а пик 4 — никотину. Источником щелочных и щелочноземельных металлов явилась
2,17, мВ
4
200
300
400
г, с
Рис. 1. Электрофореграмма разбавленного раствора хлорида никотина (раствор № 3): ведущий электролит — 12мМ бензимидазол, рН = 4,5; 1 — К+; 2 — Са2+; 3 — Ка+; 4 — никотин
1
соляная кислота. Основные характеристики электрофореграмм, полученных с использованием ведущих электролитов с различными значениями рН, приведены в табл. 1. Для дальнейшей работы был выбран буферный раствор с рН = 4,5. При выбранном значении рН значение высоты и площади пика, отношение сигнал/шум (110), эффективность разделения (1,4 • 105 тт) и разрешение пиков никотина и натрия (20) близки к максимальным, а время электромиграции никотина отличается от минимального незначительно (430 против 410 с).
Таблица 1
Зависимость параметров пика никотина от pH буферного раствора
(те = 3, Р = 0,95)
рН f, с /? , мВ S, мВ-с сигнал/шум Число теоретических тарелок
3,5 456 ± 8 1,00 ±0,09 3,1 ± 0,3 110 ±40 (155 ± 13) • 103
4,0 433 ± 7 1,03 ±0,11 3,2 ±0,3 120 ±20 (138 ±16) • 10^
4,5 435 ± 6 1,01 ± 0,10 3,4 ± 0,3 110 ±30 (144 ± 13) • 10^
5,0 425 ± 7 0,90 ±0,07 2,6 ±0,2 70 ±30 (139 ± 18) • 103
5,5 414 ±8 0,66 ± 0,06 1,9 ±0,2 50 ±20 (107 ±15) • 103
В выбранных оптимальных условиях получили электрофореграммы серии граду-ировочных растворов с различными концентрациями никотина. В качестве аналитического сигнала была выбрана величина площади пика никотина, так как концентрационная зависимость последней сохраняет линейность в большем диапазоне концентраций, чем соответствующая зависимость высоты пика. Результаты измерения были усреднены и представлены в виде градуировочного графика зависимости площади пика никотина (5) от его концентрации (С) (рис. 2). Уравнение линейной регрессии имеет следующий вид:
5 (мВ-с) = (0,1472 ± 0,0003)С (мг/л).
Предел обнаружения косвенного метода КЭ определения никотина составляет 0,3 мг/л. В сходных экспериментальных условиях прямое КЭ определение никотина, по нашим данным, имеет ПО 0,08 мг/л. Таким образом, предположение о большей чувствительности косвенного фотометрического детектирования в КЭ не подтвердилось. Однако ввиду больших содержаний никотина в табаке данный факт особого значения не имеет.
Ранее было показано, что никотин количественно извлекается из табака широким рядом экстрагентов [12]. Поэтому здесь ограничились рассмотрением простейших из них — воды и 0,1М соляной кислоты. На примере табака марки «Пётр I Лёгкий» было подтверждено, что при комнатной температуре оба экстрагента одинаково эффективно извлекают никотин, поэтому в качестве экстрагента использовали дистиллированную воду. Наиболее полная экстракция наблюдается при нагревании пробы с водой при 90-100 °С в течение 5-30 мин. Далее время нагревания ограничили 5 мин. Ранее извлечение никотина из табака водными растворами при повышенных температурах в литературе описано не было, и можно предположить, что экстрагировали лишь его лабильные формы, часть же аналита, находящуюся в виде солей с гидрофобными органическими кислотами, очевидно, теряли. В нашем случае анализ повторных экстрактов показал, что извлечение никотина из табака в выбранных оптимальных условиях протекает количественно.
В качестве реальных объектов исследования были выбраны сигареты различных марок с различным содержанием никотина, указанным производителем на пачках. Табак извлекали из сигареты, взвешивали, экстрагировали из него никотин в выбранных оптимальных условиях, отфильтровывали и переводили раствор в колбу вместимостью 500 мл. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
Результаты анализа сигаретного табака методом капиллярного электрофореза
(те = 3, Р = 0,95)
Марка сигарет Содержание никотина, мг
в дыме одной сигареты в сигарете
«Арктика Классика» 1,0 9,8 ±1,8
«Пётр I» 0,9 8,8 ±0,3
«Пётр I Лёгкий» 0,6 8,8 ±0,4
«Прима» 0,8 6,5 ±0,4
«СССР» 1,0 7,8 ±1,0
«Camel Lights» 0,5 7,8 ±1,0
«Chesterfield Classic Blue» 0,5 8,5 ±0,4
«Kent №8» 0,7 9,8 ±0,9
«Marlboro Lights» 0,5 9,8 ±1,5
«Kent Convertibles» 0,3 6,7 ±1,0
«Glamour Amber» 0,2 3,1 ±0,5
«Pall Mall Menthol» 0,6 4,3 ±0,7
«Winston Blue» 0,5 7,0 ±1,0
* Указано производителем.
Пример элекрофореграммы пробы табака сигареты марки «Пётр I Лёгкий» представлен на рис. 3. Наряду с сигналом никотина присутствуют значительные сигналы ионов калия (1), кальция (2) и натрия (3), входящих в состав табака. Найденное содержание никотина в табаке различных марок сигарет колеблется в диапазоне 3,1-9,8 мг/сиг. и существенно (в 7-22 раза) превышает указываемое производителем. Это связано с тем, что в табачном дыме содержание никотина значительно понижается за счёт сгорания и адсорбции на сигаретном фильтре. Однако при этом потребление никотина при курении потенциально может превышать указанное производителем в несколько раз. Значение СКО при анализе различных образцов табака колеблется в интервале 1,4-7,3 % (среднее значение СКО 3,6 %). Оценка правильности
- 4,26 мВ
3
200
400
t, c
Рис. 3. Электрофореграмма пробы табака сигареты марки «Пётр I Лёгкий»: ведущий электролит — 12мМ бензимидазол, рН = 4,5; 1 — К+; 2 — Са2+; 3 — Ка+; 4 — никотин
полученных результатов была выполнена методом стандартной добавки. Перед экстракцией к навеске пробы табака добавляли раствор хлорида никотина таким образом, чтобы величина добавки составила 7,68 мг. Затем осуществлялась стандартная процедура пробоподготов-ки и электрофоретическое исследование полученного раствора. Результаты были усреднены и представлены в табл. 3. Таким образом, было доказано, что методика КЭ определения никотина в табаке с косвенным фотометрическим детектированием обеспечивает получение правильных результатов.
Таблица 3 Оценка правильности методики КЭ определения никотина в табаке (п = 9, Р = 0,95)
Марка сигарет Добавка, мг
введено найдено
«Арктика Классика» 7,68 8,2 ±0,6
«Пётр I» 7,68 7,8 ± 0,4
«Прима» 7,68 7,5 ±0,5
«СССР» 7,68 7,8 ± 0,6
«Camel Lights» 7,68 7,5 ±0,5
Литература
1. Швайкова М. Д. Токсикологическая химия. М.: Медицина, 1975. 376 с.
2. Предельно допустимые концентрации загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населённых мест. Гигиенические нормативы ГН 2.1.6.695-98. М.: Минздрав России, 1998.
3. Крамаренко В. Ф. Химико-токсикологический анализ. Киев: Вища школа, 1982. 272 с.
4. Андреева, Т. И., КрасовскийК. С. Табак и здоровье. Киев, 2004. 224 с.
5. Межгосударственный стандарт по стандартизации, метрологии и сертификации. Табак и табачные изделия. Определение алкалоидов в табаке. Спектрофотометрический метод. ГОСТ 30038-93 (ИСО 2881-77).
6. Межгосударственный стандарт по стандартизации, метрологии и сертификации. Сигареты. Определение содержания алкалоидов в конденсате дыма. Спектрометрический метод. ГОСТ 304382003 (ИСО 3400:1997).
7. Межгосударственный стандарт по стандартизации, метрологии и сертификации. Сигареты. Определение содержания алкалоидов в конденсате дыма. Метод газовой хроматографии. ГОСТ 305702003 (ИСО 10315:2000).
8. Zuo Y., Zhang L., WuJ. et al. Ultrasonic extraction and capillary gas chromatography determination of nicotine in pharmaceutical formulations // Anal. Chim. Acta. 2004. Vol. 526, N 1. P. 35—39.
9. Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации. Определение концентраций химических веществ в воздухе. МУК 4.1.1048а-01 Хромато-масс-спектрометричес-кое определение никотина в воздухе. М.: Минздрав России, 2002.
10. YangS. S., SmetenaI. Evaluation of capillary electrophoresis for the analysis of nicotine and selected minor alkaloids from tobacco // Chromatographia. 1995. Vol. 40, N 7—8. P. 375—378.
11. Lochmann H., Bazzanella A., Kropsch S., Bachmann K. Determination of tobacco alkaloids in single plant cells by capillary electrophoresis //J. Chromatography. (A). 2001. Vol. 917, N 1—2. P. 311—317.
12. Clarke M.B. Quantitation of nicotine in tobacco products by capillary electrophoresis //J. AOAC Int. 2002. Vol. 85, N 1. P. 1-7.
13. RalapatiS. Capillary electrophoresis as an analytical tool for monitoring in ATF regulated tobacco products // J. Chromatography. (b). 1998. Vol. 695, N 1. P. 117-129.
14. Palmer M. E., Smith R. F., Chambers K., TetlerL. W. Separation of nicotine metabolites by capillary zone electrophoresis and capillary zone electrophoresis/mass spectrometry // Rapid comm. in mass spectrometry. 2001. Vol. 15, N 3. P. 224-231.
15. Лазурьевский Г. В., Терентьева Е. В., Шамшурин А. А. Практические работы по химии природных соединений. Вып. 1. М.: Высшая школа, 1961. 192 с.
Статья поступила в редакцию 24 января 2014 г.
Контактная информация
Никоноров Виталий Владимирович — кандидат химических наук, доцент; e-mail: nikonorov65@yandex.ru
Лифшиц Любовь Михайловна — студентка; e-mail: tonia_ll@mail.ru
Киреева Мария Сергеевна — студентка; e-mail: elle1989@mail.ru
Nikonorov V. V. — Candidate of Chemistry, Associate Professor; e-mail: nikonorov65@yandex.ru
Lifshits L. M. — student; e-mail: tonia_ll@mail.ru
Kireeva M. S. — student; e-mail: elle1989@mail.ru
