CC BY
204
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XV • №4 • 2008
© Коллектив авторов, 2008 г
УДК 616.155.392.8-036.12-008.434.59
И. Ю. Сабурова, Я. С. Оникичук, И. И. Зотова, Г. Н. Салотуб, М. И. Зарайский
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАЦИИ
В ГЕНЕ Jak2 У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМИ МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, кафедра факультетской терапии, 31 поликлиника Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
ВВЕДЕНИЕ
Хронические миелопролиферативные заболевания (МПЗ) представляют собой группу клональных нарушений гемопоэтической стволовой клетки, характеризующихся пролиферацией одной или более миелоидных линий в косном мозге и повышенным количеством зрелых и незрелых клеточных форм в крови [1]. Согласно классификации ВОЗ, МПЗ включают в себя истинную полицитэмию, эссенциальную тромбоцитэмию, идеопатический миело-фиброз и хронический миелолейкоз, плюс редкие типы патологии, такие как нейтрофильная лейкемия, гиперэози-нофильный синдром и хроническая эозинофильная лейкемия [4]. Данные патологии имеют ряд схожих клинических признаков: гиперклеточность костного мозга, увеличение количества зрелых клеток одной или нескольких линий в крови, тромбозы, кровотечения, трансформация в острый миелоидный лейкоз или миелофиброз. Диагностика этих патологий сложна и часто основывается на критериях исключения [2]. Поэтому поиск специфических признаков, позволяющих провести дифференциальную диагностику, является чрезвычайно актуальным.
В 1960 г. был открыт первый молекулярный маркер хронического миелолейкоза - Всг/АЫ, транслокация ^9;22). Это позволило не только разработать высокоспецифичный метод диагностики, но и развить таргетную терапию и разработать методики мониторинга минимальной остаточной болезни. С тех пор перечень молекулярных маркеров, ассоциированных с гематологической патологией, постоянно расширяется.
Одним из наиболее диагностически значимых критериев для МПЗ является наличие мутации V617F в гене Jak2 [6]. Мутация V617F в гене Jak2 определяется в 9095 % случаев истинной полицитэмии, 50-70 % случаев эссенциальной тромбоцитэмии и 40-50 % случаев мие-лофиброза [3]. Ген Jak2 экспрессирован в ранних предшественниках гемопоэза и кодирует нерецепторную ти-розинкиназу, участвующую в передаче сигнала от рецепторов цитокинов и факторов роста к ядру клетки. Мутация
V617F вызывает конститутивную активацию рецептора без участия лиганда, что приводит к активации пролиферации клетки и блокаде процессов апоптоза.
Таким образом, основной целью данного исследования явилась разработка простого метода детекции мутации V617F в гене Jak2, пригодной как для первичной диагностики данных патологий, так и для полуколичественной оценки минимальной остаточной болезни на фоне терапии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Характеристика групп пациентов
В исследование были включены 58 пациентов, обследованных на базе Центра лабораторной диагностики СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. Из них 6 человек обследовались с предварительным диагнозом «идеопатичес-кий миелофиброз», 8 человек - с диагнозом «истинная полицитэмия», 7 человек - с диагнозом «эссенциальная тромбоцитэмия» и 35 человек с диагнозом «невирифи-цированная хроническая миелопролиферация». Средний возраст пациентов составил 55 лет. До обследования пациенты не получали специфической терапии. В качестве группы сравнения использовались 10 стандартных доноров крови.
Клеточная линия
В качестве положительного контроля использовалась клеточная линия ЦКЕ1, любезно предоставленная профессором Борисом Фезе (Германия). Данная клеточная линия несет гомозиготный генотип мутированного гена Jak2 в позиции G1849T экзон 14 (мутация V617F).
Преаналитический этап
Кровь: забор образцов производился в стерильных условиях из периферической вены или центрального катетера в вакуумный контейнер, содержащий в качестве антикоагулянта раствор ЭДТА. Объем крови составлял 10 мл.
Костный мозг: забор аспирата костного мозга производился в стерильных условиях путем пункции грудины или крыла подвздошной кости. Образец переносился в вакуумный контейнер, содержащий в качестве антикоагулянта раствор ЭДТА. Объем пробы составлял 1 мл.
Полученные образцы доставлялись в лабораторию не позже 1 ч после их получения.
Выделение ДНК
ДНК выделяли из 200 мкл костного мозга или 1 мл цельной крови, используя наборы «ДНК-ГС» (ДНК-Технология, Россия). В результате получали 100 мкл водного раствора, содержащего от 3 до 10 мкг ДНК. После выделения образцы ДНК хранились при температуре -20 оС до исследования.
Проведение ПЦР-анализа
Амплификация проводилась на приборе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) с использованием двух обратных и одного прямого праймеров. Последователь-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ
РАБОТЫ
ности используемых праймеров: прямой (общий для дикого и мутантного аллелей) праймер Jak2-F: 5'-GGGTTTCCTCAGAACGTTGA-3' и 2 обратных праймера: Jak2-RW: 5'-TTTACTTACTCTCGTCTCCACArAC-3' на дикий тип и Jak2-RM: 5'-TTTACTTACTCTCGTCTCCACATAA-3' на мутантный тип.
Амплификация проводилась по стандартной двухпрай-мерной схеме в конечном объеме 10 мкл. Реакционная смесь содержала 2 мкл ДНК, 14 рМол каждого праймера, смесь дНТФ в конечной концентрации 240 мкМол и 2,5 единицы термостабильной Taq ДНК-полимеразы (Helicon, Россия) в стандартном ПЦР буфере с содержанием Mg2+15 мМол. Типовая программа амплификации состояла из начальной денатурации (96 оС, 3 мин), 40 циклов, включавших денатурацию (94 оС, 20 с), отжиг праймеров (61 оС, 30 с), элонгацию (72 оС , 40 с) и заключительной элонгации (72 оС, 1 мин).
Амплификация в «реальном времени» (RealTime) проводилась на приборе ДТ-96 («ДНК-технология», Россия) с использованием тех же праймеров и амплификацион-ной смеси для ПЦР в реальном времени с красителем SYBR GREEN («Синтол», Россия). Типовая программа амплификации состояла из начальной денатурации (96 оС, 3 мин), 40 циклов, включавших денатурацию (95 оС, 15 с) и отжиг праймеров с элонгацией (61 оС, 40 с).
Постамплификационный этап
ПЦР-продукт амплификации без предварительной обработки наносился на 2 % агарозный гель. Электрофорез проводился в стандартном трис-ЭДТА-боратном буфере при напряженности электрического поля 10 В/см в течение 20 мин. Визуализация и фотографирование элек-трофореграммы проводилось после окраски геля водным раствором бромистого этидия в УФ-свете на трансиллюминаторе. Гели анализировались с помощью устройства для фотографирования и анализа гелей «Gel Imager, 08-111» («ДНК-технология», Россия).
Расчет цикла выхода пробы при амплификации в реальном времени осуществлялся прибором ДТ-96 автоматически по «threshold». По окончании амплификации в реальном времени проводился анализ кривой плавления с целью исключения неспецифического продукта.
Оценка результатов исследования
Для проверки специфичности методики была использована клеточная линия UKE1. В качестве отрицательного контроля было использовано 10 образцов ДНК, выделенных из периферической крови стандартных доноров.
Качественная оценка аналитических характеристик проводилась путем исследования данных электрофоре-граммы продуктов амплификации. Каждая проба оценивалась по наличию электрофоретического сигнала в двух дорожках: дорожка № 1 (амплификация с праймерами для «дикого» типа гена Jak2) и дорожка № 2 (амплификация с праймерами для мутантного типа гена Jak2). Наличие электрофоретического сигнала в дорожке № 2 указывало на наличие данной мутации в исследуемом образ-
1 2 3 4
б
Панель а - «дикий» тип гена; панель б - мутантный тип гена.
Образцы: 1 - донор, 2 и 3 - пациенты, 4 - клеточная линия (UKE1). Проба 1 и 2 - гомозиготы по дикому типу гена Jak2, проба 3 - гетерозигота, проба 4 - гомозигота по мутантному типу гена Jak2
це. Положительным контролем служила клеточная линия UKE1; отрицательным контролем служили образцы доноров (рисунок).
Полуколичественная оценка результатов исследования проводилась с помощью компьютерной программы GelPro Analyzer 3.1.
В процессе работы программа выдает количественную оценку уровней свечения сигнала в пробах в относительных единицах интенсивности (ОЕ). Суммарный сигнал с обеих дорожек (для мутированного и дикого типа гена Jak2) для каждой пробы приравнивался к 100 %. Относительная интенсивность сигнала мутированного варианта гена указывала на процентное содержание клеток опухолевого клона в пробе.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выявление у пациентов мутации V617F гена Jak2 является достоверным диагностическим маркером наличия хронического миелопролиферативного заболевания [6]. Общепризнанной является методика раздельной амплификации ДНК пациента с праймерами, специфичными для мутированного и дикого типа гена Jak2. В настоящей статье мы предлагаем один из адаптированных вариантов данной методики.
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XV • N04 • 2008
Для отладки методики были использованы клеточная линия иКЕ 1, в 100 % клеток которой определяется гомозиготная мутация V617F гена Jak2. В качестве контрольной группы использовалась ДНК от 10 стандартных доноров, у которых данная мутация отсутствовала. При сравнительном анализе данных, полученных с помощью стандартной ПЦР и ПЦР в «реальном времени», была показана высокая сходимость результатов. Использование анализа «кривой плавления» при ПЦР в реальном времени показало высокую специфичность и воспроизводимость данной методики.
Проспективное исследование наличия мутации V617F в гене Jak2 было проведено в группе из 58 пациентов с предварительным диагнозом «хроническое миелопроли-феративное заболевание» (ХМПЗ). Встречаемость данной мутации составила 29,3 %. При анализе распределения встречаемости данной мутации по нозологическим формам были получены следующие результаты (таблица).
Полученные результаты частично совпали с литературными данными [2]. Расхождения могут быть связаны с малой выборкой. Причиной расхождения с литературными данными может также являться то, что данное обследование являлось проспективным, а диагноз пациентов предварительным.
Jak2 является нерецепторной тирозинкиназой, расположенной на цитоплазматическом домене многих рецепторов цитокинов, гормонов и факторов роста. Jak2 представляет собой сложную белковую структуру, в которой наибольший интерес, с точки зрения клиники, представляют киназный и псевдокиназный домены [7]. В норме псевдокиназный домен предотвращает сближение и спонтанную самоактивацию двух киназных доменов. После связывания лиганда с рецептором в псевдокиназном домене происходят конформационные изменения, приводящие к сближению киназных доменов и их активации за счет перекрестного фосфорилирования тирозиновых оснований. Следствием этого является запуск каскада биохимических процессов, передающих сигнал от рецептора к ядру и модулирующих транскрипцию специфических генов. Таким образом, осуществляется регуляция пролиферации, созревания и выживания клетки.
Мутация G1849T в 14 экзоне гена Jak2 приводит к замене валина на фенилаланин в позиции 617 псевдокиназ-ного домена. Это вызывает нарушение пространствен-
Встречаемость мутации V617F гена Jak2 у пациентов в зависимости от нозологии
Нозология ^личество пациентов Положите льная Отрицательная %
Гиперэозино-фильный синдром 2 0 2 0
Идеопатический миелофиброз 6 3 3 50
Истинная 8 3 5 37,5
полицитэмия
Эссенциальная тромбоцитэимя 7 2 5 28,6
Хроническое миелопролифератив-ное заболевание 35 9 26 25,7
ной структуры тирозинкиназы, сближение киназных доменов, их спонтанную самоактивацию и появление конститутивной активности тирозинкиназы Jak2. Фенотипи-чески это проявляется активацией пролиферации и блокированием процессов апаптоза. Все эти механизмы лежат в основе патогенеза ХМПЗ, и даже гетерозиготная мутация может привести к запуску миелопролиферации. Таким образом, выявление мутации у первичных больных может служить надежным диагностическим критерием.
Представленная методика в основном ориентирована на скрининг первичных пациентов с подозрением на ХМПЗ. Дальнейшее совершенствование данной методики с введением количественной оценки опухолевого клона может быть использовано для мониторинга МОБ при проведении стандартной химиотерапии и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Dameshek, W. Some speculations on the myeloproliferative syndromes / W. Dameshek // Blood. - 1951. - № 6. - Р. 372-375.
2. McLornan, D. Melanie Percy, Mary Frances McMullin JAK2 V617F : A Single Mutation in the Myeloproliferative Group of Disorders / D. McLorman [et al] // Ulster. Med. J. - 2006. - № 75 (2). -Р. 112-119.
3. Ross, L. Role of JAK-STAT Signaling in the Pathogenesis of Myeloproliferative Disorders / L. Ross // Hematology. - 2006. - P. 233-239.
4. Tefferi, А. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms : the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms / A. Tefferi, J. W. Vardiman // Leukemia. -2008. - № 22. - Р. 14-22.
5. Tefferi, А. Classification, Diagnosis and Management of Myeloproliferative Disorders in the JAK2V617F Era / A. Tefferi // Hema-tology. - 2006. - P. 240-245.
6. Wolanskyj, A. P. JAK2V617F mutation in essential thrombocy-thaemia : clinical associations and long-term prognostic relevance / A. P. Wolanskyj [et al] // Br. J. Haematol. - 2005. - № 131 (2). -Р. 208-213.
7. Yamaoka, K. The Janus kinases (Jaks) / K. Yamaoka [et al] // Genome Biology. - 2004. - № 5. - Р. 253.
РЕЗЮМЕ
И. Ю. Сабурова, Я. С. Оникичук, И. И. Зотова,
Г. Н. Салотуб, М. И. Зарайский
Определение мутации V617F в гене Jak2 у пациентов с хроническими миелопролиферативными заболеваниями
Миелопролиферативные заболевания (МПЗ) представляют собой гетерогенную группу нарушений гемопоэза, сопровождающихся множественной гиперплазией клеток костного мозга. Их диагностика сложна и часто основывается на критериях исключения. Одним из наиболее диагностически значимых критериев для МПЗ является наличие мутации V617F в гене Jak2. Основная цель данной статьи - описание скринингового метода детекции V617F в гене Jak2, пригодного для первичной диагностики. Геномная ДНК от 58 пациентов с невирифицированным миелопролифера-тивным заболеванием выделялась по стандартной технологии. Детекция наличия мутации V617F в гене Jak2 проводилась с использованием двух пар праймеров, специфичных для мутантного и «дикого» типов генов Jak2. Использовалась клеточная линия UKE1 (Б. Фезе, Германия). Представляемая методика выявляет наличие мутации V617F в гене Jak2 с диагностически значимой чувствительностью и специфичностью. Частота мутации в общей
ОРИГИНАЛЬНЫЕ
РАБОТЫ
группе составила 29,3 %. Процент встречаемости мутации V617F в гене Jak2 в группе первичных пациентов с невирифицирован-ным диагнозом МПЗ составил 25,7 %. Таким образом, разработанный нами метод определения мутации V617F в гене Jak2 может быть использован в качестве скрининговой диагностики у пациентов с невирифицированными хроническими миелопролифератив-ными заболеваниями.
Ключевые слова: миелопролиферативные заболевания, мутация V617F в гене Jak2, ПЦР.
S UMMARY
I. Y. Saburova, Y. S. Onikichuk, I. I. Zotova,
G. N. Salogub, MI. I. Zarayskiy
Detection of JAK2V617F mutation in Patients with Myeloproliferative Disorders
Myeloproliferative disorders (MPD) represent a heterogeneous group of hematopoietic disturbances accompanied by multiple
hyperplasia of bone marrow cells. They are rather difficult to be diagnosed and are often revealed by excluding other conditions. One of the most valuable diagnostic criteria for MPD is JAK2V617F mutation. The main object of the study was to develop a routine technique for detection of JAK2V617F mutations to be of help in primary diagnosis. The genomic DNA was substracted from 58 patients by standard technique. The V617F mutation of Jak2 gene was detected with 2 pairs of primers specific to mutated and wild-type Jak2. The JAK2V617F mutation was detected with two pairs of primers specific to mutated and wild types of JAK2 gene on the UKE1 cell line (donated by Professor Boris Fehse, Germany). The suggested method proved to be rather sensitive in JAK2V617F mutation detection. The mutation rate in the combined group was 29.3 %. The frequency of JAK2V617F mutations in newly diagnosed patients with non-verified MPD was 25.7 %. Consequently the newly developed method for detection of JAK2V617F mutations can be used as a screening diagnostic method in patents with myeloproliferative disorders.
Key words: myeloproliferative disorders, JAK2V617F mutation, PCR.
© Коллектив авторов, 2008 г УДК 616.24-031.72-08.382.014.45
Д. В. Дзадзуа, А. С. Захарова, Л. Н. Новикова, В. А. Воинов, К. С. Карчевский, Р. В. Чеминава, О. Э. Бакланова
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПЛАЗМАФЕРЕЗА У БОЛЬНЫХ ИДИОПАТИЧЕСКИМ ФИБРО-ЗИРУЮЩИМ АЛЬВЕОЛИТОМ
НИИ пульмонологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
Интерстициальные заболевания легких (ИЗЛ) составляют 10-15 % в структуре всех болезней легких. К ним относятся более 200 нозологий известной и неизвестной этиологии [7]. Одним из наиболее распространенных и прогностически неблагоприятных заболеваний является идиопатический фиброзирующий альвеолит. Идиопа-тический фиброзирующий альвеолит (ИФА) (синонимы: криптогенный фиброзирующий альвеолит, идиопатический фиброз легких, болезнь Хаммена-Рича и др.) представляет собой своеобразный патологический процесс в легких неясной природы, характеризующийся нарастающей дыхательной недостаточностью вследствие развития преимущественно в интерстициальной ткани легких небактериального воспаления, ведущего к прогрессирующему интерстициальному фиброзу [3].
ИФА - заболевание, в развитии которого определенную роль играют иммунные механизмы, о чем свидетельствует присутствие активированных лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов в легких.
Существенные отклонения от нормы определяются и в системе Т-клеточного иммунитета.
В связи с тем, что степень отклонения иммунологических показателей от нормы зависит от особенностей течения болезни, в литературе описаны существенные различия в оценке иммунологической реактивности больных ИФА. Исследования, проведенные Т. П. Сесь и соавт. (2000), свидетельствуют о том, что при ИФА наиболее информативными являются изменения следующих показателей: повышение общего числа эффекторных клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) - альвеолярных макрофагов, нейтрофилов, лимфоцитов, увеличение числа Т-лимфоцитов (Т-хелперов), повышение активности интер-лейкинов (ИЛ-1Р, ИЛ-2), пролиферативной активности Т-лимфоцитов, активности протеолитических ферментов -эластазы и коллагеназы. Отклонение показателей гуморального иммунитета - иммуноглобулины трех основных классов (А, G и М) и циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) - служит критерием интенсивности аутоиммунных процессов в организме [3]. Поэтому оценка иммунологического статуса при ИФА имеет важное значение в решении вопросов лечебной тактики.
Для лечения больных ИФА используются кортикосте-роиды, иногда в сочетании с иммунносупрессантами и антифибротическими препаратами ф-пеницилламин и др.). Наряду с медикаментами, применяются и эфферентные методы лечения, главным образом плазмаферез (ПФ). Положительный эффект ПФ заключается в элиминации аутоантител и циркулирующих в крови иммунных комплексов, которые играют важную роль в развитии ИФА. ПФ повышает чувствительность к кортикостерои-дам [4], удаляя аутоантитела и ЦИК, улучшает микроциркуляцию, способствует нормализации основных метаболических процессов [1].
Однако до настоящего времени эффективность эфферентных методов при ИФА вызывает сомнения, не дока-
