Определение местных анестетиков методом капиллярной хроматографии с использованием аппаратно-программного комплекса "Кристалл 2000м"

Гайсинович М.С.; Столяров Е.Е.; Карпенко Ю.Н.; Малкова Т.Л.

М.С. Гайсинович, Е.Е.Столяров, Ю.Н. Карпенко,Т.Л. Малкова ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕСТНЫХ АНЕСТЕТИКОВ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АППАРАТНО-ПРОГРАММНОГО КОМПЛЕКСА "КРИСТАЛЛ 2000М"

Кафедра токсикологической химии (зав. кафедрой - доцент Т.Л.Малкова)

Пермской государственной фармацевтической академии

Приведены данные о разработанных условиях разделения, (температурные режимы испарителя, термостата колонки, детекторов; объемные скорости газовых потоков), их влиянии на параметры удерживания и индикации 8 местных анестетиков в модельной смеси с помощью единой хроматографической системы, включающей пламенно - ионизационный (ПИД) и термоионный (ТИД) детекторы. Разработана методика количественного определения местных анестетиков в модельной смеси.

Ключевые слова: методика, местные анестетики, количественное и качественное определение, модельная смесь.

M.S.Gaysinovich, E.E.Stolyarov, Y.N.Karpenko, T.L.Malkova DEFINITION OF LOCAL АNESTETЮS BY THE METHOD OF A CAPILLARY CHROMATOGRAPHY (HRGC) WITH THE USE HARDWARE PROGRAM COMPLEX "CRYSTAL 2000М"

Perm

The data of developed conditions of division, (temperature modes of the evaporator, oven of column, detector and volumetric velocity of carrier gas) are resulted; their influence on parameters of keeping and indication of 8 local anesthetics from the model mixture with the help chromatographycalsystem includingFlame-ionization (FID) andNitrogen-phosphorus (NPD) detectors. The method of quantitative definition of local anesthetics in model mixture is developed.

Keywords: : method,local anesthetics,quantitative and qualitative definition,model mixture.

Местные анестетики (МА) широко применяются для обезболивания в хирургии, стоматологии, офтальмологии, отоларингологии. Широкое применение этих препаратов обусловливает и частоту регистрации неблагоприятных побочных реакций на них, большинство из которых не являются тяжелыми. Однако у некоторых больных осложнения могут быть тяжелыми или даже летальными [3-5].

Указанные сведения о случаях фатальных осложнений, связанных с применением МА, а также недостаточная освещенность в отечественной литературе вопросов, касающихся безопасности препаратов этой группы, служат основанием как для разработки мер профилактики таких осложнений, так и для разработки быстрых и эффективных методов их анализа.

Целью работы являлась разработка газохроматографического метода аналитического определения группы МА с помощью аппаратно-программного комплекса на базе хроматографа Кристалл 2000М. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: изучить влияние различных факторов (температурные режимы испарителя, термостата колонок, детектора; объемные скорости газовых потоков; детекторы) на параметры удерживания МА; разработать методику газохроматографической идентификации МА при их совместном присутствии и методику количественного определения МА в модельной смеси.

Исследуемыми объектами являлись МА амидного и аминного типов: лидокаин, тримекаин, анекаин, пиромека-ин, дикаин, ультракаин, кокаин, анилокаин. Тримекаин, кокаин, дикаин, анилокаин, лидокаин, использовали в виде субстанций, апиромекаин (1%), анекаин (0,5%) и ультракаин (4%) в виде ампулированных растворов. Необходимые концентрации готовили путем спиртовых разбавлений, пробы вводили с помощью микрошприца объемом 1 мкл.

Рассмотрим на примере анилокаина, как наименее термически устойчивого вещества, влияние температурных параметров на его поведение в процессе хроматографирования. Ранее [1] было установлено, что на воздухе анилокаин начинает разлагаться при температурах выше 1800°С. Выделен "непредельный" продукт разложения и установлено его строение.

Нами установлено, что наиболее существенными факторами, способствующими термическим превращениям анилокаина, является высокая температура в испарителе и колонке хроматографа. Так, при температуре испарителя 2200С на хроматограмме появляются четыре пика со временами удерживания (мин:сек) - 16:54, 25:12, 25:45, 30:18 и соотношением площадей 8:3:1:10. При снижении температуры испарителя до 1800С первые три пика существенно уменьшились по площади и высоте, а четвертый возрос при неизменном времени удерживания. Это свидетельствует о том, что анилокаину соответствует пик со временем выхода 30:18, а остальные - продуктам его разложения. Это подтверждено также на основании хроматограммы "непредельного" продукта разложения анилокаина, полученной в аналогичных условиях: его время удерживания (16:51) соответствует первому пику на хроматограмме анилокаина.

При снижении температуры испарителя до 1600°С "ложные" пики исчезли практически полностью. Эта температура была выбрана как рабочая температура испарителя для всех МА, так как остальные МА обладают большей термической устойчивостью, чем анилокаин.

Предотвращению разложения анилокаина и других МА в колонке способствовали: во-первых, "мягкий" поли-термический режим разделения (подъем температуры от 100 до 200°С со скоростью 4°С/мин); во-вторых, использование капиллярной 30-метровой колонки НР-5 с фенил-метилсилоксановой неподвижной фазой, обладающей высокой разделительной способностью при минимальной каталитической активности; в-третьих, применение в качестве газа-носителя азота особой чистоты с содержанием кислорода 0,003%. В ампулированном растворе ультракаина содержится в качестве вазоконстриктора адреналин, который на хроматограмме проявлялся в виде пика малой интенсивности со временем удерживания 30:11.

/>

/C2H5

NH—C-CH2—CH2-N • HCl NH—C —CH =CH2

|| \C2H5 \=/ ||

Br O Br O

Анилокаин N-2-бромфениланилид пропеновой кислоты

? V-NH—C— CH=r

Таблица 1

Хроматографические характеристики местных анестетиков при совместном присутствии

Вещество tR n Н, мм Rs соседних МА

Лидокаин 26:04 846960 0,036 лидокаин - тримекаин (10,0)

Тримекаин 28:59 670145 0,045 тримекаин - анилокаин (3,26)

Анилокаин 30:14 372038 0,081 анилокаин - ультракаин (6,04)

Ультракаин 32:23 431239 0,070 ультракаин - кокаин (15,12)

Кокаин 38:51 248776 0,121 кокаин - дикаин (2,50)

Дикаин 40:31 101050 0,297 дикаин - анекаин (3,87)

Анекаин 43:48 265704 0,113 анекаин - пиромекаин (2,25)

Пиромекаин 44:41 203164 0,148 -

Рис 1.Хроматограммасмеси исследуемых анестетиков

Наибольшая эффективность колонки при оптимальной чувствительности определения была получена при следующих параметрах.

Температурные параметры: детектор (ПИД) 2000°С, испаритель 1600°С, колонка 1000°С - 2 мин., подъем до 2000°С со скоростью 40°С /мин., выдержка при 2000°С - 23 мин. Общее время хроматограммы 50 мин.

Конструктивные особенности (ТИД) требуют температуру не ниже 280-3000°С, что связано с оптимальной летучестью СsBr. По этой причине, температура ТИД была установлена 2800°С. Расходы газов: (мл/мин): азот 30, водород 20, воздух 200. Коэффициент деления потока газа -носителя 1:20, линейная скорость азота 32 см/сек. С учетом коэффициента деления объемная скорость потока азота, проходящего через колонку, 1,4 мл/мин.

На рис.1 представлена хроматограмма смеси всех исследованных МА.

Как видно, имеет место четкое разделение всех компонентов смеси, пики достаточно узкие и симметричные. Были рассчитаны эффективность колонки (в числе теоретических тарелок-n), высота-Н, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ), критерий разделения Rs. Рассчитанные параметры удерживания и критерии разделения представлены в табл. 1.

Из данных таблицы следует, что фенилметилсилокса-новая капиллярная колонка (НР-5) по отношению к исследованным МА обладает высочайшей эффективностью. Учитывая большую величину критериев разделения пар соседних МА, колонка способна к делению, по крайней мере, еще такого же количества препаратов.

Заключительным этапом работы являлась разработка количественного определения МА в модельных смесях. Для построения калибровочных графиков мы использовали площадь хроматографических пиков, как параметр, более корректно отвечающий экспериментальным данным [2].

В табл. 2 представлены уравнения математической зависимости концентрации от площади пика. Здесь же приведены среднеквадратичные отклонения (СКО) результатов измерений.

Использование калибровочных уравнений для определения содержания препаратов в лекарственных формах вполне приемлемо, однако определение чувствительности, т.е. минимально определяемой концентрации, приводит к большим ошибкам из-за наличия в уравнениях свободного члена. По этой причине, под чувствительностью

мы понимали ту минимальную концентрацию анализируемого раствора, в котором программа "Хроматек Аналитик" в состоянии зафиксировать и измерить хроматографический пик.

Результаты определения чувствительности обоих детекторов представлены в табл. 3.

Согласно полученным результатам, термоионный детектор не показал принципиально большей чувствительности по сравнению с ПИД, а в случае лидокаина оказался менее чувствительным. Это можно объяснить малым мольным содержанием азота в исследованных МА. Однако использование двух детекторов повышает достоверность определения.

Таблица 2 Уравненияматематической зависимости концентрации от площади пика

Детектор

ПИД СКО% ТИД СКО%

Лидокаин С= 0,18 S +0,06 0,12 С = 2,58 S + 0,44 7,23

Анекаин С = 12,11 S - 0,23 1,06 С = 1,16 S + 0,21 14,34

Анилокаин С = 12,21 S - 1,20 17,27 С = 20,48 S-1,45 22,15

Дикаин С = 15,33 S +1,16 5,18 С = 42,69 S-1,92 1,41

Кокаин С = 1,68 S +0,08 3,87 С = 2,74 S + 0,08 0,48

Пиромекаин С = 8,57 S - 0,74 4,73 С = 2,42 S-0,17 11,36

Тримекаин С = 32,51 S-1,51 6,37 С = 8,65 S - 0,91 3,80

Ультракаин С = 7,62 S +0,15 10,37 С = 0,72 S + 0,09 7,81

Таким образом, с применением аппаратно-программного комплекса Кристалл 2000М исследовано хроматографическое поведение анекаина, дикаина, кокаина, лидокаи-на, ультракаина, тримекаина, пиромекаина, анилокаина. Исследовано влияние температурных режимов и объемных скоростей газовых потоков на параметры их хроматографического удерживания. Установлены температурные границы устойчивости анилокаина, показана возможность определения продуктов его разложения.

Таблица 3

Результаты определения чувствительности детекторов к МА

Препарат Чувствительность,мкг/мл

ПИД ТИД

Анекаин 2 2

Дикаин 8 10

Кокаин 6,5 1,5

Лидокаин 0,8 5,7

Ультракаин 4,5 1,5

Тримекаин 6 2,5

Пиромекаин 12 14

Анилокаин 10,5 10

Получено четкое разделение всех компонентов сме- Разработанаметодика количественного определения МА

си. Рассчитаны эффективность колонки, критерий разде- в модельных смесях. Построены калибровочные графики

ления соседних веществ. Показана возможность разделе- зависимости концентрации препарата в модельной смеси от

ния капиллярной колонкой по крайней мере еще такого площади пика. Определена чувствительность определения на

же количества веществ. пламенно - ионизационном и термоионном детекторах.

Литература

1. Гиошон, Ж. Количественная газовая хроматография для лабораторных анализов и промышленного контроля. В 2-хч. /Ж. Гиошон, К. Геймен. - М.: Мир, 1991. -Ч.1.- С. 547-554.

2. Итоги доклинического исследования местноанестезирующего препарата анилокаина/НА. Горнова, В.Э. Колла, Т.Л. Малкова, В.И.Панцуркин //Всесоюзная науч.-практ. конф.: Тез. докл. - Свердловск, 1998. -Ч.П.- С. 47-48.

3. Комбинированное обезболивание в амбулаторной стоматологии / С.А Рабинович, МВ. Лукьянов, Л.А Заводиленко, Е.Г. Шульгин // Человек: и лекарство: Тез. докл. VIIрос нац. конгр., Москва, 2000г. - М., 2000. - С. 373.

4. Ларенцова, Л.И. Неблагоприятные побочные реакции, на местно-анестезирующие средства в стоматологической практике/Л.И. Ларенцова, А.В. Астаханова // Безопасность лекарств: Экспресс-информ. - 2002. -№ 1. - С. 9-12.

5. HamplK.F. Transient neurologic symptoms after spinal anesthesia: a lower incidence with prilocaine and bupivacaine than with l idocaine / K.F. Hampl, S. Heinzmann-Wiedmer, I. Luginbuhl//Anesthesiology. -1998. - № 88. - P. 629-633.

И.А. Ледянкина

О ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЕЛИЧИН ОПТИЧЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ СТЕКЛОВИДНОГО ТЕЛА В ДИАГНОСТИКЕ ДАВНОСТИ НАСТУПЛЕНИЯ СМЕРТИ (предварительное сообщение)

Кафедра судебной медицины (зав. кафедрой - профессор В.И.Витер)

Ижевской государственной медицинской академии

В статье предлагается новый биофизический метод определения давности наступления смерти. В основе метода лежит изменение оптической плотности стекловидного тела с течением времени, что выявляется с помощью фотометра КФК-3 на различных сроках посмертного периода.

Ключевые слова: давность смерти, оптическая плотность глаза.

I.A.Ledankina

ABOUT POTENTIAL USING OF OPTICAL DENSITY’S SIZE OF VITREOUS BODY AT TIME OF DEATH DEFINITION

Izhevsk

In article new biophysical method of time of death definition is proposed. In basis of method is change of optical density's size of vitreous body as times goes by. This discover by photometer KFK-3 on different date of postmortal period.

Key words: : time of death, optical density's size of vitreous body.

Несмотря на давнюю историю вопроса диагностики В связи с этим, целью исследования явилось изучение

давности наступления смерти (ДНС), он продолжает оста- динамики оптической плотности стекловидного тела в

ваться одной из важнейших проблем судебной медицины, посмертном периоде для использования его в диагности-

интерес к которой не ослабевает до настоящего времени. ке ДНС. По нашему мнению, изменения биохимических

Значительная часть научных публикаций, посвященных параметров сред глаза, помимо прочих, должно сопровож-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

определению сроков наступления смерти, приходится на даться изменением оптической плотности стекловидного

последнее 10-летие. В тоже время наряду с этим, анализ тела. Методика же измерения оптической плотности яв-

литературы свидетельствует, что проблема определения ляется простым техническимприемом, не требующих зна-

давности смерти из судебно-медицинской переросла в раз- чительных материальных затрат.

ряд вопросов, стоящих на стыке различных специальнос- В качестве объекта исследования выбрано стекловид-

тей [1]. ное тело, представляющее собой прозрачную гелеобраз-

При этом все чаще в судебно-медицинских исследо- ную массу, которая заполняет пространство между задней

ваниях применяются разнообразные технические сред- поверхностью хрусталика, плоской частью цилиарного тела

ства, позволяющие по-новому оценить ранее исследован- и сетчаткой. В биохимическом отношении стекловидное

ные процессы. В тоже время, использование уже зареко- тело представляет собой гидрофильный гель, содержащий

мендованных биофизических методов, позволяет разраба- 98-99% воды, волокнистый остов и рыхлое вещество, за-

тывать и предлагать к реализации методики, расширяю- полняющее промежутки между волокнами. В стекловид-

щие возможности экспертной диагностики ДНС. ном теле присутствуют особые белки витрозин и муцин,

Между тем, внедрение новых инструментальных ме- которые определяют его вязкость, в несколько десятков раз

тодов исследования в практику здравоохранения зачастую превышающую вязкость воды. Будучи извлеченным из

происходит достаточно сложно, что обусловлено, в том чис- глаза, оно постепенно разжижается, что происходит благо-

ле, высокой трудоемкостью и себестоимостью технологи- даря действию аскорбиновой кислоты, нормально присут-

ческого процесса [2]. Именно потому использование био- ствующей в стекловидном теле, и действию ферментатив-

физических методов целесообразно в судебно-медицинс- ной системы, в которую входит фермент гиалуронидаза.

кой практике. Происходящие изменения химического состава стекло-

Аннотация научной статьи по прочим медицинским наукам, автор научной работы — Гайсинович М. С., Столяров Е. Е., Карпенко Ю. Н., Малкова Т. Л.

Похожие темы научных работ по прочим медицинским наукам , автор научной работы — Гайсинович М. С., Столяров Е. Е., Карпенко Ю. Н., Малкова Т. Л.