CC BY
89
научно-прак. конф.- Вып. Х1У., Й-Ола, 2012. - С. 301-302. 2. Михеева, Н.В. Механизмы экспансии плесневых грибов на поверхности колбас / Н. В. Михеева, Л. С. Кузнецова // Мясная индустрия. - 2010. - N 4. - С. 23-26.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭНЗИМОВ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ В ТЕХНОЛОГИИ СТЕЙКОВ ИЗ ГОВЯДИНЫ
Царегородцева Е.В. Резюме
Для улучшения качества, биологической доступности мяса разработана технология стейков из говядины, предварительно обработанной энзимами Pénicillium roqueforti.
THE USE OF ENZYMES OF MOULDY MUSHROOMS IN THE TECHNOLOGY OF MAKING BEEFSTEAKS
Tsaregorodtseva E.V. Summary
To improve quality and bioavailability of meat the technology of making beefsteaks previously treated with enzymes Pénicillium roqueforti has developed.
УДК 619:616-073.537
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ НОВОГО ФОТОАКТИВИРУЕМОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО КРАСИТЕЛЯ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК A431 С ПОМОЩЬЮ СЕЛЕКТИВНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ
Шапошников М.Н. - ученый секретарь; Зайцев С.Ю. - д.б.н., д.х.н., профессор;
Чудаков Д.Б. - студент; Генералов А.А. - аспирант Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологий имени К.И. Скрябина, е-mail: [email protected]
Ключевые слова: флуоресцентные красители, фотоактивация, клеточное окрашивание, митохондрии, лизосомы, колокализация, imageJ.
Keywords: Fluorescent dyes, photo-activation, cell staining, mitochondria, lysosomes, colocalization, imageJ.
С развитием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ) возрастает потребность в большом количестве разнообразных флуоресцентных красителей для биологической микроскопии. Особый
интерес для исследователей представляют фотоактивируемые флуоресцентные красители (ФФК), способные к легкой фотоактивации внутри нативных или фиксированных клеток. ФФК могут быть использованы для отслеживания белков [1], создания многоцветных приложений [2], во флуоресцентной наноскопии («PALM, STORM») [3, 4]. Такие ФФК должны обладать рядом обязательных характеристик: высокой мембранной проницаемостью, отсутствием токсичности, строго определенными спектрами поглощения и флуоресценции, высокой фотостабильностью к обесцвечиванию. Уже исследуемый и примененный нами ранее ФФК-813 [5-7], показал удовлетворительные результаты на различных клеточных линиях. По характеру окрашивания внутриклеточных структур и движению в нативных клетках, не удалось однозначно установить локализацию ФФК.
Целью работы являлось определение локализации ФФК-813 в нативных клетках эпидермоидной карциномы человека A431 с помощью селективных флуоресцентных зондов.
Материалы и методы. Исследуемый краситель (ФФК-813), синтезирован Беловым В.Н. в Макс-Планк Институте биофизической химии (ФРГ), как описано ранее [8]. Схема фотоактивации ФФК-813 соответствует уравнению:
\ /+
,N
N
.N
N,
hv
H2O _ N
CH3OOC \=
CH3OOC
ФФК-813
Род-813
Рисунок 1- Структурные формулы ФФК-813 и флуоресцентного красителя Род-
813, схема фотореакции
Для окрашивания линии клеток А 431 (эпидермоидная карцинома человека) ФФК-813 был растворён в ДМФА до конц. 10 мг/мл, и разведен в воде до конц. 200 мкг/мл. Митохондриальный (MitoTracker® Green FM, Invitrogen) и лизосомальный (LysoTracker® Green DND-26, Invitrogen) зонды с конц. 1 мМ в ДМСО разводили в воде до конц. 10 мкМ. Клетки культивировали на среде RPMI. В среду добавляли фетальную бычью сыворотку (FBS) 7%, L-глютамин (300 мкг/мл), ампицилин/стрептомицин (50 мкг/мл), 2-меркаптоэтанол (5х10-5М). Клетки культивировали в СО2-инкубаторе при 37оС и концентрации СО2 = 5%. Для подготовки образцов клетки выращивали на стерильных покровных стеклах и использовали по достижению ими полуконфлюэнтного монослоя. Растворы ФФК и зондов
добавляли в ячейки планшета с предварительно выращенными на покровных стеклах монослоями клеток до конечной концентрации в клеточной среде: лизосомального - 60 нМ, митохондриального - 120 нМ и ФФК-813 - 10,7 мкМ (5 мкг/мл), инкубировали в течение 30, 120 и 30 минут, соответственно, в СО2-инкубаторе. На последние 15 минут добавляли ядерный краситель Hoechst 33342 (Sigma), и отмывали свежей культуральной средой. Покровные стекла вынимали из ячеек, клали на предметные стекла клетками между стекол, и немедленно микроскопировали.
Фотосъемку проводили на ЛСКМ «Nikon Eclipse TE2000», используя лазеры: 405 нм - для фотоактивации и ядерного красителя; 488 нм - для митохондриального и лизосомального зондов; 543 нм - для Род-813 (флуоресцентной формы ФФК-813). Колоколизацию зондов с Род-813 рассчитывали с помощью программы «ImageJ» и плагина «Colocalization Finder».
Рисунок 2 - Микрофотографии клеток эпидермоидной карциномы человека A431 окрашенные ФФК-813, MitoTracker® Green FM и Hoechst 33342: A. Общая фотография монослоя клеток; Б. Фотография визуализированных митохондрий в отдельной клетке; В. Микрофотография клеточных структур окрашенных ФФК-813 в отдельной клетке; Г. Микрофотография с вычисленной областью колокализации митохондриального зонда и ФФК-813 (белым) одной клетки.
Результаты и обсуждение. Окрашенные клетки линии А 431 с
помощью ФФК-813, MitoTracker® Green FM и Hoechst 33342 представлены на микрофотографии - рис. 2. После фотоактивации ФФК-813 в клетках были записаны три канала вместе, с интервалом в одну секунду: синий - ядра (Hoechst 33342), зеленый - митохондрии (MitoTracker® Green FM), красный - Род-813, представлены на рис.2. Сохранив зеленый и красный каналы отдельно, и удалив все кроме одной хорошо сфокусированной в центре клетки, получили, соответственно, микрофотографии рис.2, Б и В.
Сопоставив красный и зеленый каналы микрофотографий (рис.2, А и Б) была получена обобщенная фотография (рис.2, Г) с вычисленной областью колокализации (белым), красного (Род-813) и зеленного (MitoTracker® Green FM) красителей, на 72,6 % от всей площади занимаемой красным цветом на рис.2.В. Здесь же видно (рис.2.), что есть красные округлые структуры, которые не совпадают с зеленым красителем, следовательно, они не являются митохондриями, а их размер и форма соответствуют вторичным лизосомам. Поэтому следующим шагом определения локализации ФФК внутри нативных клеток стало окрашивание клеток ФФК-813 и лизосомальным зондом.
Рисунок 3 - Микрофотографии клеток A431 окрашенные ФФК-813 и LysoTracker® Green DND-26: A. Общая фотография монослоя клеток; Б. Фотография визуализированных лизосом; В. Микрофотография клеточных структур окрашенных ФФК-813; Г. Микрофотография с вычисленной областью колокализации лизосомального зонда и ФФК-813 (белым) одной клетки.
Окрашенные клетки линии А 431 с помощью ФФК-813 и LysoTracker® Green DND-26 представлены на микрофотографии - рис.3. Записанные два канала вместе, с интервалом в одну секунду: зеленый -лизосомы (LysoTracker® Green DND-26), красный - митохондрии и лизосомы (Род-813), представлены на рис.3 А, Б.
Сохранив зеленый и красный каналы отдельно и сопоставив эти каналы также, как описано выше (рис.2.), была получена обобщенная фотография (рис.3, Г) с вычисленной областью колокализации (белым), красного Род-813 и зеленного LysoTracker® Green DND-26 красителей, на 9,6% от всей площади занимаемой красным цветом на рис.3.В и 64,3% от зеленого на рис.3. Б. Относительно невысокую колокализацию лизосомального красителя с Род-813 (64,3%), легко объяснить сдвигом некоторых лизосом в «живой» клетки между кадрами. Из рис.3 видно, что лизосомы окрашенные ФФК, имеют меньшую яркость чем митохондрии. Это можно объяснить тем, что зеленый лизосомальный зонд (LysoTracker® Green DND-26) протонируется в кислой среде, защелачивая тем самым лизосомы, а интенсивность флуоресценции Род-813 снижается с повышением pH [6].
Заключение. Из проведенных экспериментов следует, что ФФК-813 локализуется в митохондриях и лизосомах в нативных клетках эпидермоидной карциномы человека A431.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Lidke, D.S. Caught in the Act: Quantifying Protein Behavior in Living Cells / D.S. Lidke, B.S. Wilson // Trends Cell Biol. - 2009. -V. 11. P. 566-574. 2. Neher, R.A. Blind source separation techniques for the decomposition of multiply labeled fluorescence images. / Mitkovski M., Kirchhoff F., Neher E., Theis F.J., Zeug A. // Biophys. J., 2009. V.96, P. 37913800. 3. Betzig, E Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. / E. Betzig, G.H. Patterson, R.Sougrat, O.W. Lindwasser, S. Olenych, J.S. Bonifacino, M.W. Davidson, J. Lippincott-Schwartz, H.F. Hess // Science 2006. -V. 313 P. 1642-1645. 4. Rust, M.J., Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) / M.J. Rust, M. Bates, X. Zhuang // Nature Methods. - 2006. - V.3, P. 793-795. 5. Зайцев, С.Ю. Окрашивание клеток новыми фотоактивируемыми флуоресцентными красителями./ Зайцев С.Ю., Шапошников М.Н., Свирщевская Е.В. // Ветеринарная медицина, 2010. №3 С. 32-34. 6. Шапошников, М.Н. Зависимость флуоресценции нового фотоактивируемого красителя от параметров среды / М.Н. Шапошников, Д.Б. Чудаков, А.А. Генералов, А.А. Савина, С.Ю. Зайцев // Фундаментальные исследования. №9(2) 2012., С. 322-327. 7. Шапошников, М.Н. Получение конъюгата хитозана с фотоактивируемым флуоресцентным красителем и его применение в клеточной микроскопии / М.Н. Шапошников, Д.Б. Чудаков, А.А. Генералов, С.Ю. Зайцев // Ветеринарная медицина, 2012. № 3-4 С. 32-35. 8. Belov V. N. Rhodamines NN: a novel class of caged fluorescent dyes / V.N.
Belov, C.A. Wurm, V.P. Boyarskiy // Angew. Chem. Int. Ed., 2010. V. 49. P. 3520-3523.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ НОВОГО ФОТОАКТИВИРУЕМОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО КРАСИТЕЛЯ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК A431 С ПОМОЩЬЮ СЕЛЕКТИВНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ
Шапошников М.Н., Зайцев С.Ю., Чудаков Д.Б., Генералов А.А.
Резюме
Установлено, что новый фотоактивируемый флуоресцентный краситель окрашивает митохондрии и лизосомы в нативных клетках эпидермоидной карциномы человека A431. Эти данные получены методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, с помощью митохондриального и лизосомального трекеров, как селективных зондов.
DETERMINATION LOCALIZATION OF A NOVEL PHOTOACTIVATED FLUORESCENT DYE IN CELL CULTURE A431 WITH SELECTIVE FLUORESCENT
PROBES
Shaposhnikov M.N., Zaitsev S.Yu., Chudakov D.B., Generalov A.A.
Summary
A novel photoactivated fluorescent dye is suitable for staining mitochondria and lysosomes in living human epidermoid carcinoma cells A431. These data were proved using laser scanning confocal microscopy with mitochondrial and lysosomal trackers as reference probes.
УДК 631.416.8 (1-924.85)(470.55/.58)
СОДЕРЖАНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ПОЧВАХ ООО «ЗАОЗЕРНЫЙ» ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ ЮЖНОГО УРАЛА
Шарифьянова В.Р.- аспирант Уральская государственная академия ветеринарной медицины e-mail: [email protected]
Ключевые слова: почва, биогеохимические провинции, тяжелые металлы, условный мировой кларк, кларк концентрации.
Keywords: soil, biogeochemical provinces, heavy metals, conditional world dark, clark of concentration.
Южно-Уральский субрегион биосферы был выделен в
