CC BY
70
Биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевско го, 2008, № 3, с. 116-119
УДК 57:612.398:616-074
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ ГРУПП БЕЛКОВ В ВЫСОХШЕЙ КАПЛЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ ПОМОЩИ КРАСИТЕЛЕЙ
© 2008 г. Л.М. Обухова, К.Н. Конторщикова
Нижегородская государственная медицинская академия
Поступила в редакцию 13.05.2008
Исследованы параметры структурного макропортрета сыворотки крови больных с диспротеинеми-ей, липидемией и практически здоровых людей. Обнаружена прямая корреляционная взаимосвязь между содержанием альбуминов в сыворотке крови и шириной краевой зоны ее высохшей капли. С размерами промежуточной зоны прямо коррелировало содержание глобулинов а1, а2 и р. Содержание у-глобулинов (иммуноглобулинов) прямо связано с размерами центральной зоны высохшей капли сыворотки крови. При осаждении липидов и липопротеинов исчезает промежуточная зона в высохшей капле сыворотки крови больных с гиперлипидемией.
В результате проведенных исследований с использованием красителей, традиционно применяемых в биохимии и гистохимии для определения белков, была установлена локализация различных типов белков в высохшей капле сыворотки крови.
Ключевые слова: группы белков, сыворотка крови, краситель.
Введение
Для интерпретации результатов анализа биологических жидкостей методом клиновидной дегидратации, необходимо четко представлять локализацию различных групп белков в высохшей капле. По мнению авторов данного метода [1], большинство белков группируются по краю высохшей капли. Действительно, есть много данных, косвенно подтверждающих эту точку зрения: выявлена прямопропорциональная зависимость ширины краевого валика с общим содержание белка в пробе и т.п. [2] Однако в последнее время появляются данные, что миграция белка при высыхании к краю капли не является прямолинейным процессом [3].
Сыворотка крови содержит альбумины (58.8-69.6% белков) и глобулины: а1 (1.8-3.8%), а2 (3.7-13.1%), р (8.9-13.6%), у (8.4-18.3%). Богатство белкового состава этой биологической жидкости делает ее оптимальной моделью для исследований такого рода.
В связи с этим, цель данной работы - изучение расположения различных групп белков в высохшей капле сыворотки крови с использованием красителей.
Экспериментальная часть
Исследовали сыворотку крови 20 больных с нарушением процентного соотношения белковых фракций (диспротеинемией), с повышен-
ным содержанием холестерина (липидемией) (6 человек) и практически здоровых людей (10 человек), проходивших обследование в Нижегородском областном клиническом диагностическом центре.
Сыворотку крови больных с липидемией изучали до и после осаждения липидов и липопротеинов добавлением хлороформа с последующим центрифугированием при 11 тыс. об/мин [4]. В каждом образце определяли общее количество белка, процентное соотношение белковых фракций, общего холестерина и холестерина липопротеинов высокой (ЛПВП) и низкой плотности (ЛПНП). Изучали структурный макропортрет сыворотки крови при добавлении различных красителей, применяемых в биохимии и гистохимии для выявления белков: метиленовый синий, толуидиновый синий, кармин, альциановый голубой, амидочерный 10В, ку-масси бриллиантовый синий Я-250, бромфено-ловый синий. После перемешивания сыворотку с добавлением красителя в объемном соотношении 3:1 исследовали методом клиновидной дегидратации, для чего каплю высушивали на горизонтально расположенном предметном стекле при комнатной температуре в течение 18-24 часов, а затем анализировали структуру полученной дегидратированной капли в световом микроскопе. Для большей достоверности результатов делали 10 повторов для одного образца сыворотки. Высохшие капли фотографировали и рассчитывали соотношение ширины
различных зон окраски к их радиусу (для каждой капли проводили 3 измерения). Затем определяли коэффициент корреляции между этими показателями и значениями концентраций белковых фракций сыворотки, общего холестерина, холестеринов ЛПНП, ЛПВП.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью персонального компьютера с использованием пакета программ 81ай8йса. Корреляционные взаимосвязи изучали в общем массиве данных больных и практически здоровых людей. Применялись методы параметрической статистики: для исследования связи двух признаков - метод Пирсона (считалось, что линейная связь между признаками существует при г > 0.4, уровень значимости р < 0.05) [5].
Результаты и их обсуждение
Применение красителей давало возможность получить два типа картины высохших каплей сыворотки крови. При использовании альциа-нового голубого наиболее интенсивная окраска наблюдалась в центре капли. Добавление остальных красителей создавало изображение с различным количеством концентрических зон окраски, самой яркой из которых была краевая зона. Наибольшее количество зон окраски (четыре) имело место при использовании красителей амидочерного 10В и толуидинового синего: краевая, промежуточная, состоящая из двух подзон, и центральная (рис. 1).
Наибольшее количество статистически достоверных коэффициентов корреляций между уровнем различных белковых фракций и шириной зон окраски в высохшей капле сыворотки крови также было выявлено для красителей амидочерный 10В и толуидиновый синий.
Обнаружена прямая взаимосвязь между содержанием альбуминов в сыворотке крови и шириной краевой зоны при использовании амидочерного 10В (г = 0.495). Обратная взаимосвязь наблюдалась с шириной центральной зоны (амидочерный 10В - г = -0.441) и промежуточной зоны (толуидиновый синий (г = -0.575) и кармин (г = -0.613)).
Следовательно можно предположить, что при высыхании капли сыворотки крови альбумины группируются в краевой зоне.
Суммарное содержание глобулинов прямо коррелировало с шириной центральной зоны (амидочерный 10В г = 0.486), промежуточной зоны (толуидиновый синий и кармин). Обратная связь наблюдалась с шириной краевой зоны (амидочерный 10В г = -0.412).
Рис. 1. Картины высохших капель сыворотки крови человека с добавлением толуидинового синего (20:1): а - контрольная группа; б - при увеличении содержания у-глобулинов; в - при гиперлипидемии
Следовательно глобулины располагаются в центральной и промежуточных зонах высохшей капли сыворотки крови.
Рис. 2. Картины высохших капель сыворотки крови с добавлением амидочерного 10В (20:1): а - нативная сыворотка; б - сыворотка после осаждения липидов и липопротеинов
Рис. 3. Схема расположения белков в высохшей капле сыворотки крови
С размерами промежуточной зоны (при окраске амидочерным 10В и толуидиновым си-
ним) прямо коррелировало содержание глобулинов а^ а2 и р. Известно [6], что а- и Р-гло-булиновые фракции содержат липопротеины. Содержание глобулинов а прямо связано с шириной первой (ближней к краю) промежуточной зоны высохшей капли сыворотки крови: амидочерный 10В г = 0.575; толуидиновый синий г = 0.459. Содержание глобулинов Р прямо связано с шириной второй (ближней к центру) промежуточной зоны: амидочерный 10В г = 0.552; толуидиновый синий г = 0.443).
Обнаружена прямая корреляция между уровнем холестерина ЛПВП (а-глобулиновая фракция) и шириной промежуточной зоны (амидочерный 10В г = 0.423).
Содержание у-глобулинов (иммуноглобулинов) прямо связано с размерами центральной зоны (амидочерный г = 0.603, бромфеноловый синий г = 0.439) и обратно с шириной краевой зоны (амидочерный г = -0.571, толуидиновый синий г = -0.516, бромфеноловый синий г = = -0.414).
Расположение окраски в центре высохшей капли сыворотки крови при использовании аль-цианового голубого подтверждает предположение о расположении здесь иммуноглобулинов. Альциановый голубой селективен к кислым гликопротеинам. Именно к этому типу белков относятся иммуноглобулины. Считается, что окрашивание происходит за счет формирования обратимых электростатических связей между молекулой красителя, несущей положительный заряд, и отрицательно заряженными участками мукополисахарида [7].
При увеличении уровня у-глобулинов структурный макропортрет сыворотки крови с добавлением красителя отличался более широкой центральной зоной по сравнению с таковым практически здорового человека (рис. 1а, б). При липидемии наблюдалось увеличение размера промежуточной зоны (рис. 1в).
Опыты с сывороткой крови больных с ги-перлипидемией показали, что осаждение липидов и липопротеинов приводит к исчезновению промежуточной зоны высохшей капли (рис. 2). Следовательно можно считать, что местом локализации липопротеинов является промежуточная зона.
Таким образом, складывается следующая картина расположения групп белков в высохшей капле сыворотки крови: альбумины - краевая зона; а и Р-глобулины (ЛПВП и ЛПНП) - промежуточная зона, у-глобулины (иммуноглобулины) - центральная зона (рис. 3).
События, происходящие в капле сыворотки крови при высыхании, по своей природе ближе
всего к процессу высаливания. Используя метод высаливания нейтральными солями, белки плазмы крови можно разделить на три группы: альбумины, глобулины и фибриноген. Поскольку мы имели дело с сывороткой, а не плазмой крови, то в нашем случае белки будут подразделяться лишь на две группы: альбумины и глобулины. Сывороточные глобулины при высаливании нейтральными солями можно разделить на а-, в- и у-глобулины [6]. Таким образом, при высаливании белки сыворотки крови образуют 4 фракции: альбумины, а-, в- и у-гло-булины. Именно такое количество концентрических колец различной окраски мы наблюдаем в высохшей капле плазмы крови с добавлением красителей.
При испарении влаги с поверхности капли концентрация растворенных в ней веществ неуклонно повышается, и при достижении предельной растворимости вещество выпадает в осадок. Альбумины отличаются от глобулинов более высокой растворимостью в воде и солевых растворах. Но их содержание в сыворотке крови значительно выше (58.8-69.6% от всего белка), чем глобулинов. Вследствие этого часть альбуминов, находящихся в краевой зоне где концентрация солей выше, чем в центре, выпадает в осадок раньше всех иных белковых составляющих сыворотки. Дальнейший рост концентрации солей в жидкой части высыхающей капли приводит к осаждению остальных фракций белков.
Заключение
В результате проведенных исследований с использованием красителей, традиционно применяемых в биохимии и гистохимии для определения белков, была выявлена локализация различных типов белков в высохшей капле сыворотки крови: альбумины - по краю, а-, в-глобулины, включая липопротеины - в промежуточной и иммуноглобулины - в центральной зоне.
Список литературы
1. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. М.: Хризостом, 2001. 304 с.
2. Шатохина С.Н., Теодор И.Л., Макурина Т.В., Выборов М.П., Помазков Ю.В., Яковлев С.А. Могу-тов А.В., Мирошников А.В. Способ исследования белка в биологической жидкости. Патент № 1681182 5 О 01№1/28 4628955/14 (22) 29.12.88.
3. Залесский М.Г., Эммануэль В.Л., Краснова М.В. Физико-химические закономерности структуризации капли биологической жидкости на примере диагностикума «Литос-система» // Клиническая лабораторная диагностика. 2004. № 8. С. 20-24.
4. Скоупс Р. Методы очистки белков: пер. с англ. М: Мир, 1985. 358 с.
5. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ 81ай811са. М: Медиа Сфера, 2002. 35 с.
6. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1998. 704 с.
7. Селиванов Е.В. Красители в биохимии и медицине: Справочник. Барнаул: Азбука, 2003. 40 с.
DYE-DETERMINED PROTEIN GROUP LOCALIZATION IN A BLOOD SERUM DRIED DROP
L.M. Obuhova, K.N. Kontorshchikova
The parameters of blood serum structural macro picture have been investigated for patients with dysproteinemia, lipidemia and practically healthy people. A direct correlation has been found between the blood serum albumin content and the edge zone width of the dried drop. The content of a!, a2 and p globulins was directly correlated with the intermediate zone size. The content of y-globulins (immunoglobulins) is directly related to the central zone size of the dried drop. At lipid and lipoprotein deposition the dried drop intermediate zone disappears for the patients with hyperlipidemia.
On the basis of the results obtained using dyes, which are traditionally applied in biochemistry and histochemistry for determination of proteins, the localization of different types of proteins has been determined in the dried drop of blood serum.
