CC BY
58В.А. Седакова, А.В. Клебанов, А.Н. Осипенко, Н.А. Клебанова
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБъЕКТАХ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ
ХРОМАТОГРАФИИ
Могилевский государственный университет имени А.А. Кулешова
Представлены экспериментальные данные по разработке методики качественного и количественного определения короткоцепочечных жирных кислот: уксусной, масляной, изомасляной, валериановой, изовалериановой и капроновой в биологических жидкостях организма.
Разработка методики осуществлялась на модельных смесях с использованием метода капиллярной газожидкостной хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием, апробация на биологических объектах — в сыворотке крови.
Ключевые слова: короткоцепочечные жирные кислоты, газожидкостная хроматография, качественный и количественный анализ.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время микрофлора кишечника считается самостоятельным органом с собственными функциями, которая оказывает существенное влияние на поддержание гомеостаза организма [1,2]. Среди различных метаболитов анаэробных бактерий микрофлоры особое место занимают короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК). Их роль велика: КЦЖК участвуют в секреции слизи, регуляции ионного обмена в толстой кишке, блокируют адгезию и угнетают рост патогенной и условно-патогенной флоры, принимают участие в липидном, углеводном и энергетическом обменах [3]. Причем у различных кислот
метаболические эффекты различаются. Например, ацетат участвует в поставке субстратов липогенеза и энергообеспечении эпителия, а также обеспечивает антимикробный эффект, регулирует уровень рН, моторную и секреторную активность кишечника [2]. Пропионат регулирует микроциркуляцию в слизистой оболочке и поддерживает в ней трофические процессы, участвует в глюконеогенезе, блокирует адгезию патогенов к эпителию [3]. Бутират является важным фактором регуляции пролиферации и дифференцировки эпителия толстой кишки, чем объясняется ее антиканцерогенная активность [4]. Таким образом, продукция КЦЖК собственной микрофлорой является одним из важ-
ных механизмов саморегуляции ее роста и жизнедеятельности.
Кроме того, в последнее время указывается на возможность использования качественного и количественного состава КЦЖК различных биологических сред организма в качестве диагностического и прогностического критерия при различных патологиях желудочно-кишечного тракта [1,2].
В настоящее время основными методами качественного и количественного определения КЦЖК являются методы тонкослойной [5] и газовой хроматографии [69], наиболее эффективным является метод газожидкостной хроматографии с использованием капиллярных колонок. В связи с этим целью работы являлась разработка методики количественного определения КЦЖК в биологических средах организма.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объектов исследования использовали: стандарты уксусной (СНСООН, t =118,1оС), масляной
4 3 5 кип 5 у 5
(СНСНСНХООН, t =163,5оС), изо-
4 3 2 2 5 кип 5
масляной ((СНЛСНСООН, t =152-
3 2 кип
155оС), валериано3в2ой (СН3СН2СН2кСипН2СО ОН, t =185,4оС), изовалериановой (СН3СН(СкипН3)СН2СООН, СН3СН2СН(СН3) СООН, t =176,5оС) и капроновой (СН3СН2СН[иСН2СН2СООН, t =202-
3 2 2 2 2 кип
203оС) кислот маркировки ч. и х.ч.; модельные смеси исследуемых кислот; сыворотку крови практически здоровых людей, полученную в лаборатории УЗ «Могилев-ский областной онкологический диспансер» (договор о сотрудничестве № 11755).
Стандартные растворы готовили следующим образом: навеску вещества около 0,3 г (с точностью 0,0001 г) помещали в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводили до метки очищенной водой (рабочий раствор 1), полученная концентрация кислот составляла около 6 мг/см3. Точную концентрацию рабочих растворов 1 устанавливали с помощью кислотно-основного титрования сильным основанием в присутствии индикатора фенолфталеина. На основе рабочего раствора 1 путем разбавления готовили рабочие растворы 2 необходимой концентрации от 0,01 до 0,05 мг/ см3. Приготовленные стандартные растворы хранили при температуре 2-8оС в течение 10-15 дней. Стандартные растворы ис-
пользовали для приготовления модельных смесей и калибровки хроматографа.
Для отработки параметров экстракции и хроматографирования использовали модельные смеси исследуемых кислот. Модельные смеси готовили в соответствии с содержанием КЦЖК в сыворотке крови в норме [1]. Концентрацию уксусной кислоты варьировали в пределах от 0,05 до 0,50 мг/см3; концентрации масляной, изо-масляной, изовалериановой и капроновой кислот варьировали в пределах от 0,01 до 0,05 мг/см3.
КЦЖК хорошо растворяются как в воде, так и в органических растворителях, но для получения очищенных от посторонних примесей проб с целью последующего хроматографического анализа предпочтительно переводить их в органический слой.
Для экстракции КЦЖК использовали бутилацетат (СН3СООСН2СН2СН2СН3) х.ч. и кислоту хлористоводородную (НС1) х.ч. Пробоподготовку осуществляли следующим образом: пробу жидкого образца объемом 4 см3 помещали в градуированную пробирку со шлифом, добавляли 2 см3 6 н. раствора хлористоводородной кислоты и 0,6 см3 бутилацетата и экстрагировали в течение 15-20 минут, используя лабораторный встряхиватель. Затем оставляли пробу на 5-10 минут до полного расслоения водной и органической фазы и отбирали микрошприцем 5 мкл верхнего эфирного слоя для хроматографирования.
Пробы из сыворотки крови готовили следующим способом: в 2 пробирки отбирали по 2 см3 сыворотки и добавляли по 2 см3 физраствора, в одну из пробирок добавляли 0,5 см3 стандартного раствора изомасляной кислоты с концентрацией 0,5 мг/см3. После чего в каждую пробирку добавляли по 2 см3 6н. хлористоводородной кислоты и 0,6 см3 бутилацетата. Время экстрагирования 15-20 мин с использованием лабораторного встряхивателя. Затем оставляли пробу на 5-10 минут до полного расслоения водной и органической фазы и отбирали шприцем 5 мкл верхнего эфирного слоя для анализа.
Качественное и количественное определение КЦЖК осуществляли при помощи метода капиллярной газожидкостной хроматографии. Измерения проводили на хроматографе ГАЛС-311 в изотермическом режиме с пламенно-ионизационным де-
тектированием. Разделение смеси кислот осуществлялось в кварцевой капиллярной колонке OPTIMA FFAP (производитель «Macherey-Nagel») длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм, неподвижная фаза
- пленка сополимера полиэтиленгликоля с 2-нитротерефталевой кислотой; толщина пленки - 0,25 мкм.
Хроматографический анализ проводили при следующих условиях: температура термостата 150оС, температура испарителя и детектора 190оС. Расход газа-носителя составлял 90 см3/мин, водорода
- 30 см3/мин, воздуха - 300 см3/мин. Ввод пробы осуществлялся с делением потока газа-носителя (коэффициент деления 1:30).
Полученные хроматограммы обрабатывали с помощью компьютерной программы МультиХром 1.5. Идентификацию компонентов на хроматограммах осуществляли, сравнивая времена удерживания компонентов смеси со временами удерживания индивидуальных чистых веществ в стандартных растворах. Количественный анализ проводили методом стандартной добавки по площади пика определенного компонента с использованием формул 1 и 2.
Ci =
гтт
si
мг/см3,
(1)
см
где m t - масса стандартной добавки, мг;
Научные публикации Уп - объем пробы, взятой для анализа,
8й2 - площадь пика, принятого за стандарт, на хроматограмме после добавления стандарта;
Б - площадь пика, принятого за стандарт, на хроматограмме до добавления стандарта.
(2)
где Si2 - площадь пика определяемого компонента на хроматограмме смеси, в которую был введен стандарт;
- площадь пика определяемого компонента на хроматограмме исходной смеси;
К - относительный поправочный коэффициент для определяемого компонента.
Условия калибровки и анализа смесей были идентичны.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как видно из полученных результатов, хроматографические параметры разделения анализируемых веществ можно считать хорошими (рисунок 1). При малой продолжительности времени анализа (не превышает 8 минут) отсутствует наложение пиков, соответствующих отдельным кислотам, а влияние на их форму и площадь пика растворителя несущественно, что может обеспечить
Рисунок 1 - Хроматограмма модельной смеси короткоцепочечных жирных кислот
высокое число производимых анализов. Короткое время анализа также обеспечивает малое размывание пика, происходящее за счет размывания зоны вещества во времени и пространстве, и которое является источником возможных ошибок при количественном определении. Это позволяет обходиться без программирования температуры при выполнении измерений, что также увеличивает их производительность.
Для определения относительных поправочных коэффициентов были приготовлены серии растворов с концентрацией уксусной кислоты от 0,05 до 0,5 мг/см3, остальных кислот от 0,01 до 0,05 мг/см3, после чего проводили определение КЦЖК описанным выше способом. На основании полученных данных были построены зависимости площади пика от концентрации кислоты в растворе (рисунок 2).
c, mg/cm3
Рисунок 2 - Зависимость площади пика (мВ*сек) от концентрации масляной кислоты (мг/см3)
Для всех выбранных кислот были получены аналогичные зависимости и проведена их обработка с целью определения относительных поправочных коэффициентов каждой кислоты. Основные параметры
разделения исследуемых кислот приведены в таблице 1.
Результаты определения короткоцепо-чечных жирных кислот в сыворотке крови представлены в таблице 2.
Таблица 1 - Параметры разделения короткоцепочечных жирных кислот в модельных смесях
Время Тангенс угла наклона Относительный Величина
Кислота удерживания мин зависимости в=ДС) (ф поправочный коэффициент достоверности аппроксимации ^2)
Уксусная 2,612 0,988 1,012 0,979
Изомасляная 3,323 8,063 0,124 0,969
Масляная 3,881 14,913 0,067 0,985
Изовалериановая 4,333 19,320 0,052 0,971
Валериановая 5,270 18,374 0,054 0,993
Капроновая 7,382 28,662 0,035 0,973
Таблица 2 - Качественный состав и количественное содержание короткоцепочечных
жирных кислот в сыворотке крови
Время Площади пиков, mV*s Концентрация, мг/см3
Кислота удерживания, Опыт со Опыт чистой
мин стандартом сыворотки
Уксусная 2,602 0,230 0,250 0,145
Изомасляная 3,324 0,273 0,090 0,049
Масляная 3,875 0,082 0,076 0,0031
Изовалериановая 4,303 0,137 0,131 0,0026
Валериановая 5,153 - - следы
Капроновая 7,394 0,149 0,144 0,0028
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований разработана методика качественного и количественного определения короткоцепочечных жирных кислот методом капиллярной газожидкостной хроматографии; определены параметры разделения КЦЖК на модельных смесях и в сыворотке крови (коррелируют между собой). Содержание КЦЖК в сыворотке крови составило: для уксусной - 0,145 мг/см3; для изомасляной - 49 мкг/см3; изомасляной, изовалериано-вой, капроновой - 2,6-3,1 мкг/мл, что соответствует данным, приводимым в научной литературе для практически здоровых людей.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что предложенный нами метод позволяет проводить качественное и количественное определение КЦЖК в сыворотке крови с высокой степенью чувствительности и точности.
Эксперименты проводились на базе ресурсного центра УО «МГУ имени А.А. Кулешова»
SUMMARY
V. A. Sedakova, A.V. Klebanov, A.N. Osipenko, N.A. Klebanova DETERMINATION OF SHORT-CHAIN FATTY ACIDS IN BIOLOGICAL OBJECTS BY GAS-LIQUID CHROMATOGRAPHY
Experimental data on methods of qualitative and quantitative determination of short-chain fatty acids in biological liquids of an organism are shown.
Development of a technique carried out on the model mixtures using the method of capillary gas-liquid chromatography with
flame ionization detection, testing for biological objects - in the blood serum.
Keywords: short-chain fatty acids, gasliquid chromatography, qualitative and quantitative analysis.
ЛИТЕРАТУРА
1. Летучие жирные кислоты и их диагностическое и прогностическое значение в гастроэнтерологической клинике / М.Д. Ардатская [и др.] // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопрок-тологии. - 2000. - №5. - С. 63-70.
2. Хавкин, А.И. Нарушения микроэкологии кишечника и энтеросорбция / А.И. Хавкин // Вопросы современной педиатрии, 2009. - Том 8. - №2. - С. 94-98.
3. Ерофеев, Н.П. Клиническая физиология толстой кишки. Механизмы действия коротко-цепочечных жирных кислот в норме и при патологии / Н.П. Ерофеев, В.Г. Радченко, П.В. Селиверстов. - СПб: Форте Принт, 2012. - 56 с.
4. Ардатская, М.Д. Клиническое применение пищевых волокон: [метод. пособие] / М.Д. Ардатская. - М.: 4ТЕ Арт, 2010. - 48 с.
5. Буланова, А.В. Хроматография в медицине и биологии: учебное пособие / А.В. Буланова, Ю.Л. Полякова; Федер. агенство по образованию. - 2-е изд. - Самара: Изд-во «Самарский университет», 2006. - 116 с.
6. Способ разделения смеси жирных кислот фракции С2-С6 методом газожидкостной хроматографии: патент (19)RU(11) 2220755(13) C1 / М.Д. Ардатская, Н.С. Иконников, О.Н. Минушкин; заявитель Учебно-научный центр Медицинского Управления делами Президента РФ; заявлено 23.07.2002; опубл. 10.01.2004 // БД Патенты России DVD 2004.
7. Способ количественного определения уксусной, пропионовой, изомасляной, масляной, валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот в крови методом га-зохроматографического анализа: патент (19ВДП) 2422830(13) С1 / Н.В. Зайцева, Т.С. Уланова, Т.В. Нурисламова, Н.А. Попова; заявитель Федеральное государственное учреждение «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления по здоровью населения»; заявлено 23.03.2010; приоритет от 23.03.2010, опубликовано http://www.findpatent.ru.
8. Шевелева, М.А. Летучие жирные кислоты в пробиотических средствах и биологически активных добавках / М.А. Шевелева // Фармация. - 2010, - №3. - С. 13-14.
9. Шевелева, М.А. Определение корот-коцепочечных жирных кислот в пищевых продуктах методом газожидкостной хроматографии / М.А. Шевелева, О.И. Пере-деряев, В.В. Бессонов // Вопросы питания. - 2010. - Т.79. - №5. - С.72-74.
Адрес для корреспонденции:
212000, Республика Беларусь, г. Могилев, ул. Космонавтов, 1, Могилевский государственный университет им. А.А. Кулешова, кафедра химии, [email protected], Седакова В.А.
Поступила 30.08.2013 г.
