CC BY
143
39. Border J.R., Burns G.P., Rumph C., Schenk W.G. Carnitine levels in severe infection and starvation: a possible key to the prolonged catabolic state. Surgery. 1970; 68: 175-9.
40. Rath F., Skala I., Nathova E. Metabolic aspects of the use of medium chain triglycerides in the treatment of obesity. Z Ernahrugswiss. 1972; 13(suppl): 116-24.
41. Furman R.H., Howard R.P., Brusco O.J., Alaupovic P. Effects of medium chain triglyceride (MCT) on serum lipids and lipoproteins in familial hyperchylomicronemia (dietary fat-induced lipemia) and dietary carbohydrate-accentuated lipemia. J. Lab. Clin. Med. 1965; 66: 912-26.
42. Hornstra G., Lussenburg R.N. Relationship between the type of dietary fatty acid and arterial thrombosis tendency in rats. Atherosclerosis. 1975; 22: 499-516.
43. Nagao K., Yanagita T. Medium-chain fatty acids: functional lipids for the prevention and treatment of the metabolic syndrome. Pharmacol. Res. 2010; 61(3): 208-12.
44. Nosaka N., Maki H., Suzuki Y. et al. J. Effects margarine containing medium-chain triacylglycerols on body fat reduction in humans. Atheroscler. Thromb. 2003; 10: 290-8.
45. Tomita K., Teratani T., YokoyamaH. et al. Plasma free myristic acid proportion is a predictor on nonalcoholic steatohepatitis. Dig. Dis. Sci. 2011; 56(10): 3045-52.
46. Takeuchi H., Sekine S., Kojima K., Aoyama T. The application of medium-chain fatty acids: edible oil a suppressing effect on body fat accumulation. J. Clin. Nutr 2008; 17(1): 320-3.
47. Bertorini T., Yen Y.Y., Trevisan C. et al. Carnitine palmityl transferase deficiency: myoglobinuria and respiratory failure. Neurology. 1980; 30: 263-71.
48. Kaunitz H., Cotton R.H., Johnson R.E. Comparison of medium-chain
triglycerides and other fats in a reducing diet. In. Proceedings Subcommittee, eds. Tenth International Congress in Nutrition. Japan. 1975. Kyoto: proceedings Subcommittee of XICN. 1976; 63-4(abstr).
49. Kasai M., Nosaka N., Maki H. et al. Comparison of diet-induced thermogenesis of foods containing medium- versus long-chain tria-cylglycerols. J. Nutr. Sci. Vitaminol. 2002; 48(6): 536-40.
50. Prajapati H.N., Dalrymple D.M., Serajuddin T.M. A comparative evaluation of mono-. Di- and triglyceride of medium chain fatty acids by lipid/surfactant/water phase diagram, solubility determination and dispersion testing for application in pharmaceutical dosage form development. Pharm. Res. 2010; 29: 285-305.
51. SandstromR., Hyltander A., Korner U., LundholmK. Structured triglycerides were well tolerated and induced increased whole body fat oxidation compared with long-chain triglycerides in postoperative patients. Nutr. 1995; 19(5): 381-6.
52. Huttenlocher P.R., WilbournA.J. Medium-chain triglycerides as a therapy for intractable child epilepsy. Neurology. 1971; 21: 1097-1103.
53. Liu Y., Wang J., Zhang R. et al. A good response to oil with medium- and liong-chain fatty acids in body fat and blood lipid profiles of male hypertriglyceridemic subjects. J. Clin. Nutr. 2009; 18(3): 351-8.
54. Lieber C.S., Lefevre A., Spritz N. et al. Difference in hepatic metabolism of long- and medium - chain fatty acids: the role of fatty acid chain length in the production of the alcoholic. J. Clin. Invest. 1967; 46(9): 1451-60.
55. Aoyama T., NosakaN., KasaiM. Research on the nutritional characteristics of medium-chain fatty acids. J. Med. Invest. 2007; 54: 385-8.
55. PadigliaA. Sensitivity to 6-n-propylthiouracil is associated with gustin (carbonic anhydrase VI) gene polymorphism, salivary zinc, and body mass index in humans. Am. J. Clin. Nutr. 2010; 92(3): 539-45.
Поступила 09.01.13
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.152:615.214.32]-074:543.544]-073.584
Н.В. Апанасенко1, п.В. Кудан1, Ф.С. Баранова1, В.Ю. Абрамов1,2
определение концентрации циклоспорина A в крови методом жидкостной хроматомасс-спектрометрии
Лаборатория трансплантационной иммунологии ФГУ "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова" минздравсоцразвития РФ; 2ГБОУ ВпО "первый московский государственный медицинский университет им. И.м. Сеченова" минздравсоцразвития РФ
Разработана методика измерения концентрации иммунодепрессанта циклоспорина A (ЦсА) в цельной крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией на приборе типа "ионная ловушка". Определены оптимальные условия проведения анализа. Отработку метода производили на крови здоровых доноров и пациентов, перенесших аллотрансплантацию органов. Провели сравнение разработанного метода с методом флюоресцентного поляризационного иммуноанализаAbbott TDX, применяемым в клинической диагностике. Показали более высокую селективность предлагаемого метода к ЦсА по сравнению с Abbott TDX.
Ключевые слова: высокоэффективная жидкостная хроматография, масспектрометрия, кровь, циклоспорин A
N.V. Apanasenko, P.V. Kudan, F.S. Baranova, V.Yu. Abramov
THE ANALYSIS OF CONCENTRATION OF CYCLOSPORINE A IN BLOOD USING LIQUID CHROMATOGRAPHIC MASS SPECTROMETRY
The method of analysis of concentration of immunosuppressant of cyclosporine A in whole blood was developed. The highly effective liquid chromatography with mass spectrometric detection was applied using device of "ionic trap" type. The optimal conditions of analysis are established. The tryout of method was carried out using blood samples of healthy donors and patients underwent allotransplantation of organs. The comparison was made of the developed method with method of fluorescence polarized immunoassay Abbott TDX applied in clinical diagnostic. The higher selectivity of the proposed method to cyclosporine A as compared with Abbott TDX was established.
Key words: highly effective liquid chromatography, mass-spectrometry, blood, cyclosporine A
биохимия
Циклоспорин A (UpA) является иммунодепрессан-том, широко применяемым в клинической практике, а также при лечении аутоиммунных заболеваний. Узкий диапазон терапевтических концентраций ^A и высокая вариабельность фармакокинетических параметров в популяции больных требует для индивидуализации дозы ^A постоянного мониторинга концентрации препарата в крови [1].
В большинстве лабораторий для определения концентрации ^A используют разные варианты иммунологических методов. Чувствительность подобных методов в целом отвечает запросам клинической практики [5]. Вместе с тем, поскольку иммунодепрессивный эффект ^A определяется в основном фармакологическим эффектом нативной молекулы [2], общим недостатком указанных методов является относительно низкая специфичность, что обусловлено перекрестной реактивностью применяемых антител с метаболитами ^A [3].
В тех случаях, когда относительная доля метаболитов в общем пуле интактного ^A и его метаболитов высока, появляется необходимость селективного определения концентрации нативного ^A. В большой мере для решения указанной задачи подходит метод жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС), который основан на хроматографическом разделении компонентов образца с последующим детектированием анализируемого соединения по специфичным для него ионам в масс-спектре [4]. Метод ВЭЖХ-МС/МС отличается высокой специфичностью и позволяет измерить концентрацию нативного ^A в комплексной матрице.
В последние годы метод ВЭЖХ-МС/МС широко используют в лабораторной и клинической практике. Вместе с тем его реализация сопряжена с рядом таких сложностей, как использование приборов специализированного типа (тандемные масс-спектрометры с тройным квадрупольным масс-анализатором), дополнительного оборудования для он-лайн экстракции, а также изотопно-меченных внутренних стандартов.
Мы поставили задачу разработать и описать метод ВЭЖХ-МС/МС для определения концентрации ^A в крови пациентов, позволяющий проводить анализ с использованием детектора типа "ионная ловушка" без внутреннего стандарта и дополнительного оборудования.
Материалы и методы. Оборудование. Для дозирования использовали автоматические одноканальные пипетки вытеснительного типа Finnpipette PDP 0,5-25 мкл (Labsystems), Finnpipette P.C.R. 20-200 мкл (Labsystems). Перемешивание производили на шейкере IKA-VIRBAX-VXR (IKA). Центрифугирование проводили на центрифуге Heraeus Fresco 17 (Thermo Sci.). Хроматографическое разделение осуществляли на жидкостном хроматографе Series 1100 (Agilent) с кватернарным градиентом на стороне низкого давления и хроматографической колонкой Zorbax Eclipse XDB-C8, 2,1 х 100 мм с размером частиц 3,5 мкм (Agilent).
Масс-спектрометрический анализ проводили при помощи детектора 1100 Series LC/MSD Trap VL (Fgilent).
Реактивы. ^A, Reference Substance (Novartis); геп-тагидрат сульфата цинка, puriss p.a. (Aldrich); мура-
Для корреспонденции:
Апанасенко Наталья Вячеславовна, мл. науч. сотр. лаб. трансплантационной иммунологии Адрес: 123182, Москва, ул. Щукинская, 1 Телефон: +7(926)9018036 E-mail: [email protected]
вьиная кислота, puriss p.a., 50% водный раствор (Fluka Anal.); формиат аммония, puriss p.a. (Fluka Anal.); аце-тонитрил, HPLC grade (Panreac); метанол, HPLC grade (Fisher Scientific); вода, очищенная с использованием системы центрального обратного осмоса AquaB DUO (Fresenius Medical care).
Калибровочные и контрольные образцы. Серию калибровочных и контрольных образцов концентрацией 15,6; 31,3; 62,5; 125; 250; 500; 1000 и 2000 нг/мл приготовили из цельной крови здорового донора путем добавления одинаковых объемов концентрированных растворов ^A в ацетонитриле к аликвотам крови. Калибровочные образцы дозировали непосредственно после пробоподго-товки, контрольные образцы дозировали вместе с анализируемыми образцами. Образцы хранили в холодильнике при температуре -40°c.
Пробоподготовка. К 150 мкл крови добавляли 300 мкл осаждающего раствора (1% сульфат цинка в 80% метаноле), перемешивали 10 мин на шейкере со скоростью 2200 об/мин, центрифугировали 10 мин со скоростью 13 300 об/мин при 15°C, отбирали 150 мкл супернатанта, к которому добавляли 300 мкл метанола, перемешивали 0,5 мин на шейкере со скоростью 2200 об/мин, после чего центрифугировали 10 мин со скоростью 13 300 об/мин при 15°C и отбирали 300 мкл супернатанта в хроматогра-фическую виалу для анализа.
Хроматографическое разделение. Объем вкола 50 мкл; подвижная фаза A: 200 мМ HCOONH 0,1% HCOOH в 50% MeOH; подвижная фаза B: 200 мМ HCOONH 0,1% HCOOH в 95% MeOH; градиент: от 100% A до 100% B за 0,5 мин; 100% B 3,2 мин; от 100% B до 100% A за 0,1 мин; 100% A 1,7 мин; скорость потока 0,65 мл/мин; температура колонки 50°C; полное время анализа 5,5 мин.
Настройки масс-спектрометрического детектора. Родительский ион 1224,8 ± 2 а. е. м.; амплитуда фрагментации 1,75; сканируемый диапазон 1000-1250 а. е. м.; максимальный заряд 15 000; максимальное время накопления 50 мс; напряжение на капилляре 5000 В; давление распыляющего газа 35 psi; осушающий газ 10 л/мин; температура осушающего газа 350°C.
Обработка данных. Программное обеспечение: Agilent Technologies ChemStation Plus B.01.03; Bruker Daltonik GmbH LC/MSD Trap software 5.3; Bruker Daltonik Gmbh QuantAnalysis 1.7; тип хроматограммы - Extracted Ion Chromatogram; анализируемая масса 1112,7 ± 0,5 а.е.м.; сглаживание (фильтр Гаусса) 1,096 с; аппроксимация: квадратичная со взвешиванием 1/х2.
Результаты и обсуждение. В ходе выполнения работы были оптимизированы условия пробоподготовки, параметры хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования.
По сравнению с описанными в литературе методами [3] в стадию пробоподготовки ввели дополнительную стадию осаждения метанолом, что позволило улучшить результаты детектирования, по-видимому, вследствие более полного осаждения интерферирующих примесей.
Хроматографический градиент оптимизировали для достижения наиболее полного отделения ^A от компонентов матрицы для снижения возможной супрессии сигналов аналита.
Для оптимизации условий детектирования изучили наиболее интенсивные фрагменты ионов, образованных присоединением H+, NH4+, Na+ и K+ в молекуле ^A (1202,8; 1219,9; 1224,8; 1240,8 а. е. м. соответственно). Для каждого иона были подобраны условия образования и фрагментации. Наилучшую воспроизводимость показала MRM-пара 1224,8 ^ 1112,7 а. е. м., соответству-
Рис. 1. Спектр фрагментации иона 1224,8 ± 2 а. е. м. №+) при условиях, описанных в тексте.
(ЦсА, катионизированный
ющая фрагментации ЦсА, катионизированного ионом №+. Данную пару выбрали для детектирования ЦсА в целях количественного определения. Спектр фрагментации представлен на рис. 1.
Хроматограмма стандартного образца крови человека с концентрацией ЦсА 250 нг/мл при описанных условиях представлена на рис. 2. Как видно на рис. 2, исследуемое вещество элюируется отдельно и представлено одним пиком, время выхода ЦсА 3,1 мин, полное время анализа 5,5 мин.
Количественное определение ЦсА осуществляли в диапазоне концентраций от 15 до 2000 нг/мл. Для построения калибровочной кривой использовали образцы концентрацией 15,6; 62,5; 250; 1000 и 2000 нг/мл, контролем служили образцы концентрацией 31,3; 125 и 500 нг/мл. Наиболее полно зависимость величины площади пика от концентрации ЦсА описывали квадратичной функцией со взвешиванием 1/х2, данный тип кривой использовали для дальнейшего анализа. Калибровочная кривая представлена на рис. 3. Относительное стандартное отклонение не превышает 10%, ошибка метода не хуже 15%.
2,0-
1,5-
1,0-
0,50,0- I
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
Рис.2. Хроматограмма стандартного образца ЦсА в крови (250 нг/мл). Объем вкола 50 мкл, колонка Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8, 2,1 х 100 мм 3,5 мкм, температура колонки 55°С, градиент 200 мМ HCOONH4, 0,1% НСООН, 50% ^ 95% MeOH за 0,5 мин, скорость потока 0,65 мл/мин, MRM 1224,8 ^ 1112,7 а. е. м., сглаживание 1,096 с.
у= -1,078х2+ 82277,905Х-21,743
250 500 750 1250 1750 2250 1000 1500 2000
Рис. 3. Кривая зависимости площади пика от концентрации (в нг/мл) ЦсА в крови при условиях, описанных в тексте.
Для подтверждения отсутствия интерференции со стороны компонентов матрицы проанализировали образцы крови 6 пациентов, не принимавших препаратов, содержащих ЦсА. Показали, что суммарная площадь фоновых пиков не превышает 10% минимальной определяемой концентрации.
Для верификации разработанного метода контрольные образцы концентрацией 31,3, 125 и 500 нг/мл анализировали предлагаемым методом и флюоресцентным поляризационным иммуноанализом, широко применяемым в клинической практике, на приборе Abbott TDX/ FLX с использованием набора TDX/FLX Cyclosporine Monoclonal Whole Blood (далее ФПИА Abbott TDX). Данные, представленные в таблице, показывают, что в отсутствие метаболитов оба метода дают близкие результаты.
С использованием описанной методики осуществили количественное определение ЦсА в крови у 52 реципиентов аллотрансплантата печени или почки, находящихся на лечении в ФГУ "ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова" Минздрав-соцразвития РФ. Одновременно в тех же образцах крови количественное определение ЦсА выполнили методом ФПИА Abbott TDX. _
Среднее значение концентрации ЦсА (X ± m; нг/мл) в 52 исследованных образцах крови при определении предложенным методом составило 132 ± 70 (разброс значений 27-461). При определении методом ФПИА Abbott TDX среднее значение концентрации составило 177 ± 98 (разброс значений 35-559). Результаты демонстрировали положительную корреляцию (r = 0,874). Ко-
600 -i 500 -400 -300 -200 -100 -
у=0,63х+20,259 R2=0,765
-1-1-1-1-1-1
0 100 200 300 400 500 600
Рис. 4. Диаграмма рассеяния концентраций (в нг/мл) ЦсА в образцах крови пациентов предлагаемым методом ВЭЖХ-МС/ МС (по вертикали) и ФПИА Abbott TDX (по горизонтали).
результаты измерений концентрации (в нг/мл) ЦсА в контрольных образцах предлагаемым методом вЭжх-мс/мс и ФпиА abbott TDX
Концентрация ВЭЖХ-МС/МС ФПИА Abbott TDX
концентрация ошибка, % концентрация ошибка, %
31,3 29,6 5,2 33 5,6
125,0 124,9 0,0 118 5,6
500,0 433,4 13,3 459 8,2
биохимия
%
604020". о--20-40-60-80-100-
о о
сь^те^Б
ооо о 0 о
о о
100
200
300
400
+1,96 SD
14,1% ° Среднее
-28,3 -1,96 SD
-70,6%
500
600
Рис. 5. Диаграмма Бленда-Альтмана. Относительные различия в процентах между результатами определения концентрации ЦсА методами ВЭЖХ-МС/МС и ФПИА Abbott TDX по отношению к средним результатам.
По горизонтали - среднее значение от ВЭЖХ-МС/МС и ФПИА (в нг/мл); по вертикали - ВЭЖХ-МС/МС-ФПИА (в нг/мл) / среднее (в %).
метода ФПИА Abbott TDX к метаболитам. Вклад метаболитов в значения, полученные методом ФПИА Abbott TDX, может быть оценен по средней разности значений на диаграмме Бленда-Альтмана. Умеренное значение коэффициента корреляции двух методов вызвано, по всей видимости, различным накоплением метаболитов ЦсА у пациентов, что влияет на результаты измерения концентрации нативного ЦсА методом ФПИА Abbott TDX.
Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о более высокой селективности метода ВЭЖХ-МС/МС к ЦсА в присутствии его метаболитов по отношению к методу ФПиА Abbott TDX.
Заключение. Разработан метод определения содержания ^A в крови человека с помощью ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором типа "ионная ловушка". Предлагаемый метод обеспечивает простоту и универсальность анализа при достижении достаточной чувствительности и селективности за счет исключения необходимости во внутреннем стандарте и онлайн-экстракции, а также благодаря снижению требований к техническим характеристикам используемого масс-спектрометра.
эффициент детерминации г2 = 0,765. Диаграмма рассеяния представлена на рис. 4.
Степень согласованности измерений концентрации ^A методами ВЭЖХ-МС/МС и ФПИА Abbott TDX оценивали методом Бленда-Альтмана (рис. 5).
Средняя разность величины измерений между методами ВЭЖХ-МС/МС и ФПИА Abbott TDX составила 28,3% в пользу последнего. Значения разности концентраций, определенные двумя методами, с единичными исключениями укладываются в пределы X ± 2о, подтверждая хорошую согласованность результатов измерения.
Результаты сопоставления средних значений концентраций ^A в крови пациентов, полученных двумя методами, и наклон прямой на диаграмме рассеяния указывают на тенденцию к превышению значений, полученных методом ФПИА Abbott TDX, над значениями, полученными предлагаемым методом ВЭЖХ-МС/МС, что соответствует ожидаемому эффекту от кросс-селективности
ЛИТЕРАТУРА
1. Готье С.В., Столяревич Е.С., Томилина Н.А., Мойсюк Я.Г. Механизмы иммуносупрессии и основные группы иммуносупрес-сантов. В кн.: Готье С.В., ред. Иммуносупрессия при трансплантации солидных органов. М.; Тверь: Триада-Х; 2011: 11-44.
2. 0zbayA., Karamperis N., J0rgensen K. A review of the immunosup-pressive activity of cyclosporine metabolites: new insights into an old issue. Curr. Clin. Pharmacol. 2007; 2(3): 244-8.
3. Roberts N.B., Dutton J., Higgins G., Allars L. Evaluation of a novel semi-automated HPLC procedure for whole blood cyclosporin A confirms equivalence to adjusted monoclonal values form Abbott TDx. Clin. Chem. Lab. Med. 2005; 43(2): 228-36.
4. Seger C., Tentschert K., Stöggl W., Griesmacher A., Ramsay S.L. A rapid HPLC-MS/MS method for simultaneous quantification of cy-closporine A, tacrolimus, sirolimus and everolimus in human blood samples. Nat. Protocols. 2009; 4(4): 526-33.
5. YatscoffR.W., CopelandK.R., Faraci C.J. Abbott TDx monoclonal antibody assay evaluated for measuring cyclosporine in whole blood. Clin. Chem. 1990; 36(11): 1969-73.
Поступила 09.12.11
© В.Г. БУЛыГИН, 2013
УДК 616.36-002.2-022-053.2-07:616.153.1+616-008.931
В.Г. Булыгин
ферменты плазмы крови и ткани печени у детей в зависимости от стадии хронизации вирусного гепатита C
ФГБУ "НИИ медицинских проблем Севера" СО РАмН, Красноярск
Определение активности ферментов в ткани печени и в цельной крови у детей 12-16 лет, больных хроническим вирусным гепатитом С, показало, что уровень метаболических параметров при 3-й стадии хронизации процесса свидетельствует о более глубоком, чем при 2-й стадии, функциональном поражении клеток печени и более выраженных нарушениях метаболизма. Характер соотношения уровней активности ферментов в печени и крови детей при 2-й и 3-й стадиях хронизации позволяют утверждать, что энзиматические показатели крови отражают специфику и направленность изменений метаболических процессов в клетках печени при хроническом гепатите С, что может являться основой для разработки новых диагностических подходов при этой патологии.
Ключевые слова: ферменты, ткани печени, плазма крови, вирусный гепатит С, дети
