CC BY
89
РАСТЕНИЕВОДСТВО
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ МАННИТА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПРОЦЕССЕ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К ЗАСУХЕ У КУКУРУЗЫ
Х.А. Аль-Холани1, Ю.И. Долгих2
1 Кафедра ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8/2, 117198 Москва, Россия 2Институт физиологии растений РАН ул. Ботаническая, 35, 127276 Москва, Россия
Целью данной работы была апробация селективной системы с маннитом для создания засухоустойчивых растений кукурузы. Непосредственной задачей являлось определение чувствительности каллусных клеток кукурузы к этому осмотику и выбор концентрации маннита для отбора устойчивых клеток. Для проведения работы был использован эмбриогенный каллус двух линий кукурузы (Zea mays L) 91 и Al 88. Каллус получали из незрелых зародышей, изолированных на 10-12-е сутки после опыления. Индукцию каллуса и его культивирование проводили на агаризованной среде Мурасиге-Скуга [13] с 30 г/л сахарозы и 1мг/л 2,4-Д. Маннит добавляли в питательную среду для роста каллуса в концентрациях 0, 0,6, 0,8, 1,0 и 1,2 М. На основании полученных результатов для отбора засухоустойчивых растений кукурузы была выбрана концентрация маннита 0,8 М.
Засуха является одним из самых важных природных факторов, негативно влияющих на урожай сельскохозяйственных культур. Она наносит больший урон растениеводству, чем все остальные стрессовые факторы вместе взятые [1]. Засушливые периоды характерны для климата 110 стран мира [2]. Поэтому существует острая потребность в толерантных к недостатку влаги сортах культурных растений. Для ускорения селекционного процесса применяются биотехнологические подходы, в частности клеточная селекция in vitro. С целью имитации in vitro стрессового эффекта засухи могут использоваться питательные среды, которые дополнены осмотически активными веществами, понижающими внешний водный потенциал: полиэтиленгликолем (ПЭГ), маннитом или хлористым натрием. Например, при сопоставлении реакции различных сортов сорго на засуху с реакцией полученных от этих сортов каллусов на ПЭГ было показано, что ПЭГ хорошо имитирует in vitro чувствительность к засухе проростков и молодых растений [3]. Аналогичные данные были получены для кукурузы [4]. Galiba и соавторы после проверки шести сортов пшеницы выяснили, что чувствительности целых растений к водному стрессу в основном соответствует реакция каллусных тканей на NaCl и маннит [5]. В результате селекции клеток горчицы на средах с маннитом были отобраны адаптированные к водному стрессу клеточные линии [6]. Для получения засухоустойчивых форм кокосовой пальмы на основании оценки эффективности сред с ПЭГ, маннитом и NaCl была выбрана селективная система с хлоридом натрия [7], а для селекции растений пшеницы, толерантных к засухе и заморозкам, эффективной была среда с ПЭГ [8]. В то же время растения томатов, регенерированные из устойчивых к ПЭГ клеточных клонов, были так же чувствительны к засухе, как и исходный сорт [9].
Большое значение при проведении клеточной селекции имеет правильный выбор концентрации селективного фактора. Известно, что при слишком высоких дозах клетки в культуре теряют способность к регенерации растений [10], а при низких концентрациях полученные растения могут не проявлять устойчивость [11, 12]. В опубликованных работах для получения адаптированных к водному стрессу клеточных линий применяли варьирующие в широких пределах (99-880 мМ) концентрации маннита [1]. Чувствительность к манниту клеток кукурузы ранее не была исследована.
Цель данной работы - апробация селективной системы с маннитом для создания засухоустойчивых растений кукурузы. Непосредственной задачей являлось определение чувствительности каллусных клеток кукурузы к этому осмотику и выбор концентрации маннита для отбора устойчивых клеток.
Материал и методы. Для проведения работы был использован эмбриогенный каллус двух линий кукурузы (Zea mays L.) 91 и А188. Каллус получали из незрелых зародышей, изолированных на 10-12-е сутки после опыления. Перед выделением зародышей зерновки стерилизовали спиртом в течение 2 мин, а потом 0,1 %-ным раствором сулемы в течение 20 мин и трижды промывали дистиллированной водой. Индукцию каллуса и его культивирование проводили на агаризованной среде Мурасиге-Скуга [13] с 30 г/л сахарозы и 1мг/л 2,4-Д. Клетки выращивали в чашках Петри в камере в условиях 16-часового светового дня (освещенность 3000 лк) при температуре 26 °С и влажности 70%, пересаживая на свежую среду каждые 3-4 недели.
Маннит добавляли в питательную среду для роста каллуса в концентрациях 0,
0,6, 0,8, 1,0 и 1,2 М. Каллус разделяли на инокулюмы равной массы, которая в разных опытах варьировала от 16 до 27 мг, и высаживали по 15 инокулюмов на чашку Петри диаметром 10 мм. В каждом варианте опыта было 3 чашки. Рост каллуса в селективных условиях оценивали через месяц после посадки по увеличению сырой массы относительно начальной массы. Каждый опыт повторяли не менее трех раз. Статистическая обработка результатов проведена с помощью компьютерной программы Genstat 3. В таблицах и на диаграммах приведены средние величины со стандартной ошибкой.
Работу проводили в стерильных условиях в ламинар-боксе в отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН с ноября 2005 по январь 2006 года.
Результаты и обсуждение. При выращивании на среде без маннита масса каллуса линии А188 увеличивалась за месяц примерно в 10 раз, а линии 91 - в 7 раз. Добавление 0,6 М маннита вызывало у обеих линий снижение прироста каллуса примерно в 3 раза, однако клетки оставались живыми и сохраняли способность к регенерации растений. При увеличении концентрации маннита до 0,8 М угнетение роста было выражено еще сильнее, на части каллусов появились зоны некроза. На средах с 1,0 и 1,2 М маннита роста каллуса практически не было, отмечена массовая гибель клеток (Табл.1, Рис.1).
Таблица 1
Сырая масса каллуса (мг) после месяца культивирования на питательных средах с
разной концентрацией маннита
Линия Концентрация маннита, М
0 0,6 0,8 1,0 1,2
91 141,82±10,27 43,47±2,02 37,44±1,74 34,72±1,13 28,57±3,05
А188 192,7±25,39 51,78*4,47 36,3±2,03 26,4± 1,74 30,53±2,155
При высоких концентрациях осмотика проявлялась гетерогенность каллуса обеих линий: часть каллуса еще сохраняла способность к пролиферации, в то время как другая часть уже погибала. Маннит, начиная с концентрации 0,8 М, полностью ингибировал морфогенез.
-лин. А188 -лин. 91
кон.маннита М
Рис. 1. Индекс роста каллуса двух линий кукурузы на средах с маннитом (индекс роста определяли как отношение массы каллуса в конце пассажа
к начальной массе)
Линия А188 оказалась несколько более устойчивой к манниту по сравнению с линией 91. Эта разница становилась более заметной по мере увеличения концентрации осмотика с 0,6 до 1,0 М (рис. 2). На среде с 1,0 М маннита средний прирост тканей линии 91 составлял 24,49% от контрольного, а прирост каллусов линии А188 - только 13,7%.
Рис. 2. Влияние разных концентраций маннита на рост каллуса двух
линий кукурузы
Линия 91 ранее была выделена из тканей гибрида Chi31 х Cateto S.G. путем селекции на среде, содержащей 20% ПЭГ [14]. По-видимому, толерантность к одному осмотику (ПЭГ) способствует снижению чувствительности и к другому (маннит).
Сравнение с культивируемыми тканями других видов растений показывает, что каллус кукурузы является относительно устойчивым к осмотическому действию маннита. Подобная реакция на осмотик была описана для культивируемых клеток табака и пшеницы [15,16]. В то же время рост каллуса горчицы был ингибирован при содержании в среде 329 мМ маннита [6], а у бархатца регенерация растений из эксплантов была существенно подавлена при дозе маннита 90 мМ [17].
На основании полученных результатов для отбора засухоустойчивых растений кукурузы была выбрана концентрация маннита 0,8 М.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шевелуха B.C. Сельскохозяйственная биотехнология. - М.: Высшая школа, 2003.-469 с.
2. WWW. FAO. Org/ static, 2005
3. Smith R.H., Bhashkaran S., Miller F.R. Screening for drought tolerance in sorghum using cell culture. - In Vitro Cell and Dev. Biol. - 1985. - V. 21. - P. 541-543.
4. Долгих Ю.И., Ларина C.H., Шамина З.Б. Селекция на осмоустойчивость кукурузы in vitro и характеристика растений-регенерантов. - Физиология растений. - 1994. - Т. 41. - с. 114-117.
5. Galiba G., Erdei L, Sarkadi L., Salgo A., Koscy G. Genotype dependent responses of wheat varieties to water and salt stresses in vitro. - Abstr. VII Intern. Congr. Plant Tissue and Cell Culture. - Amsterdam. - 1990. - P. 13.
6. Gangopadhyay G., B. Sangita G. In vitro selection and physiological characterization of NaCl and mannitol adapted callus lines in Brassica juncea. - Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 1997,- V. 50. - P. 161-168.
7. Karunaratne S., Santha S., Kovoor A. An in vitro assay for drought-tolerant coconut germplasm. - Euphytica. - 1991. - V. 53. - P. 25-30.
8. Никифирова ИД., Чернов B.A., Швидченко В.К, Бутенко Р.Г. Рост и морфогенез клеток яровых пшениц в стрессовых условиях и отбор устойчивых вариантов. - Тезисы Междунар. конф. Биология культивируемых клеток и биотехнология. - Новосибирск, 1988. - с.178-179.
9. Handa А.К., Bressan R. A., Handa S., Hasedawa P.M. Clonal variation for tolerance to polyethylene glycol induced water stress in cultured tomato calls. - Plant Physiol. -1988.-V.72.-P. 645-653.
10. Duncan D.R., Waskot R.M., Nabors M.W. In vitro screening and field evaluation of tissue-culture-regenerated sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) for soil stress tolerance. - Euphytica. - 1995. - V. 85. - P. 373-380.
11. Smith M.K., McComb J.A. Selection for NaCl-tolerance in cell cultures of Medicago sativa and recovery of plants from a NaCl-tolerant cell line. - Plant Cell Rep. - 1983. -V. 2.-P. 126-128.
12. Chandler S.F., Vasil J.H. Selection and characterization of NaCl tolerant cells from embryonic cultures of Pennisetum purpureum Schum. (Napier grass). - Plant Sci. Lett. - 1984. - V. 37. - P. 157-164.
13. Murashige Т., Skoog F. A Revised Medium for Rabid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures. - Physiol. Plantarum. - 1962. - V. 15. - P. 473-481.
14. Долгих Ю.И., Ларина C.H., Шамина З.Б., Жданова Н.Е., Пустовойтова Т.Н. Засухоустойчивость растений кукурузы, полученных из устойчивых
осмотическому действию полиэтиленгликоля клеточных линий. - Физиология растений. - 1994. - № 41. - С 853-858.
15. Левенко Б.А., Сергеева Л.Е., Виноградов В.А. Отбор и анализ устойчивых к солевому и водному стрессам клеточных линий табака и регенерантов из них. -Экспериментальная генетика в ускорении селекционного процесса. - Киев, Наук. Думка. - 1989. - С. 101-109.
16. Levenko В.А., Pasternak E.Yu., Sidorova N.V. Selection for resistance to water and salt stress in wheat. - Abstr. 7th. International Congr. P. Т. С. C. - Amsterdam. -1990. - P. 37.
17. MohamedM.A.-H, Harris P.J.C., Henderson J. In vitro selection and characterization of a drought tolerant clone of Tagetes minuta. - Plant Science. - 2000. - V. 159, P. 213-222.
DEFINITION OF CONCENTRATION OF MANNITOL IN ORDER TO USE FOR CELL SELECTION OF MAIZE (ZEA MAYS L.) DROUGHT -TOLERANT PLANTS
H. A. Al-Kholani1, U. E. Dolgikh2
1 Department of Botany, Plant Physiology and Agrobiotechnology Russian People’s Friendship University st. Miklucho-Maklay, 8/2, 117198 Moscow, Russia 2Institute of Plant Physiology RAS Botanicheskaya st., 35, 127276 Moscow, Russia
The purpose of the given work was approbation of selective system with mannitol for creation of drought tolerant plants of maize. A direct task was the definition of sensitivity of maize callus to this osmotic and choice of concentration of mannitol for selection of resistant cells. For realization of work callus of two lines of maize (Zea mays L) 91 and A188 was used. An induction and culturing of callus carried out on Murashige and Skoog (MS) agar medium with 30 g/L sucrose and 1 mg/L 2,4-D. Mannitol was added to nutrient media for callus growth in concentration 0, 0.6, 0.8, 1.0 and 1.2 M. On the basis of the received results for selection drought tolerant maize cells the concentration mannitol 0, 8 M was chosen.
